本發(fā)明涉及到的是一種三明治式復(fù)合膜支架的制作方法。

背景技術(shù)：

目前促神經(jīng)生長(zhǎng)或神經(jīng)再生藥物的最常見給藥途徑為靜脈或鞘內(nèi)注射。也有以凝膠結(jié)合活性因子貼膜敷于脊髓表面、以l-多聚賴氨酸結(jié)合活性因子作為支架植入脊髓，以解決因子通過血腦屏障問題。

藥物遞送系統(tǒng)和干細(xì)胞生物支架都可用于治療脊髓損傷，但目前未見兩者結(jié)合使用。干細(xì)胞三維支架橋接神經(jīng)的方法和材料中已經(jīng)有類似的組合運(yùn)用了如（一種用于橋接缺損神經(jīng)的復(fù)合修復(fù)材料及其支架cn201510716279.8）。但是目前三維支架橋接神經(jīng)的治療方法，存在以下缺點(diǎn)：

一方面對(duì)已經(jīng)受到損傷（但未死亡）的單個(gè)神經(jīng)束，無法達(dá)到修復(fù)和治療的目的；另一方面在橋接過程中，因?yàn)橐獙?duì)損傷處的脊髓剪切出一個(gè)和三維支架形狀類似的——通常是管狀——缺口，因此會(huì)對(duì)該處未損傷的神經(jīng)細(xì)胞和已經(jīng)受到損傷（但未死亡）的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行清除，結(jié)果造成了該處脊髓細(xì)胞的進(jìn)一步損失。

2、現(xiàn)有載藥系統(tǒng)不能實(shí)現(xiàn)藥物的定向釋放，無法保證損傷局部因子的高濃度；

3，多數(shù)載藥系統(tǒng)易于降解，載藥量低，藥物釋放不能貫穿于脊髓損傷修復(fù)過程始終；

4，載藥系統(tǒng)體積過大，可能壓迫脊髓，同時(shí)不有利于縫合硬脊膜，導(dǎo)致腦脊液漏形成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的：

1，提供一種新的脊髓治療用的載藥系統(tǒng)的制作方法，避免采用背景技術(shù)中傳統(tǒng)的載藥系統(tǒng)時(shí)，需要對(duì)該處未損傷的神經(jīng)細(xì)胞和已經(jīng)受到損傷（但未死亡）的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行清除，以造成了該處脊髓細(xì)胞的進(jìn)一步損失。

2，提供一種新的載藥系統(tǒng)的制作方法，解決藥物的定向釋放、載藥量低的問題。

3，提供一種新的載藥系統(tǒng)的制作方法，解決藥物釋放不能貫穿于脊髓損傷修復(fù)過程始終的問題。

4，提供一種新的載藥系統(tǒng)的制作方法，解決現(xiàn)有載藥系統(tǒng)體積過大，可能壓迫脊髓，同時(shí)不有利于縫合硬脊膜的問題。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種三明治式復(fù)合膜支架的制作方法，構(gòu)建負(fù)載生物活性因子的聚乳酸/生物活性玻璃/殼聚糖三明治式復(fù)合膜載體；包括以下步驟：

1）分別制作聚乳酸薄膜、負(fù)載生物活性因子的介孔生物活性玻璃、負(fù)載種子細(xì)胞的殼聚糖膜作為外側(cè)密封層、夾心層和內(nèi)側(cè)控釋及干細(xì)胞支架層；

2）將負(fù)載生物活性因子的生物活性玻璃的夾心層覆蓋于聚乳酸薄膜上，再將負(fù)載種子細(xì)胞的殼聚糖膜覆蓋在生物活性玻璃層上構(gòu)建三明治式復(fù)合膜載體。

進(jìn)一步的，1）中制作沒有負(fù)載種子細(xì)胞的殼聚糖膜；

2）中將沒有負(fù)載種子細(xì)胞的殼聚糖膜覆蓋在生物活性玻璃層上；

3）將干細(xì)胞懸液，采用均勻浸入上一步的殼聚糖薄膜內(nèi)部進(jìn)行種子細(xì)胞的培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，1）中不制作殼聚糖膜；2）中不將殼聚糖膜覆蓋在生物活性玻璃層上；3）制作干細(xì)胞和殼聚糖混合懸溶液，采用旋涂、滴涂方法將該混合溶液覆蓋于生物活性玻璃層上，構(gòu)建類三明治式復(fù)合膜載體。

進(jìn)一步的，將各層以能夠滲透神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子和干細(xì)胞的醫(yī)用生物膠進(jìn)行粘連。

進(jìn)一步的，所述夾心層負(fù)載生物活性因子為神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子。

進(jìn)一步的，所述神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子為bfgf、bd-nf、nt-3、igf中的一種或者幾種的組合。

進(jìn)一步的，復(fù)合膜支架周邊以不滲透神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子和干細(xì)胞的醫(yī)用生物膠進(jìn)行封閉。

進(jìn)一步的，所述介孔生物活性玻璃小球替換為乙二醇乳酸共聚物（peg-pla）納米微球。

進(jìn)一步的，所述種子細(xì)胞為臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞，即humscs。

進(jìn)一步的，所述種子細(xì)胞選自：許旺細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的一種或幾種組合。

該技術(shù)方案將神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子復(fù)合膜載體與組織工程干細(xì)胞科學(xué)有機(jī)結(jié)合，以負(fù)載神經(jīng)活性因子的復(fù)合膜支架結(jié)合種子細(xì)胞humscs，希望更有效地修復(fù)脊髓損傷。該支架利用殼聚糖良好的組織相容性和干細(xì)胞易在其上粘附和增殖的特性，利用生物活性玻璃對(duì)生物活性因子（bfgf、bd-nf、nt-3、igf）有效負(fù)載與控制持續(xù)以一定濃度釋放特性，通過使其同時(shí)具備以下作用：

1，復(fù)合膜可以直接貼敷于損傷脊髓部位，一方面克服了生物活性因子不能通過血腦屏障的問題，另一方面不需要對(duì)損傷部位周邊的脊髓進(jìn)行清除，避免了該處脊髓細(xì)胞的進(jìn)一步損失。

2，根據(jù)生物活性因子作用時(shí)限，修復(fù)周邊脊髓細(xì)胞需要的有效濃度，科學(xué)設(shè)計(jì)介孔生物活性玻璃小球的載藥總量和釋放速度、濃度，提高作用效能；

3，致密外層無法通過活性因子及干細(xì)胞，使得活性因子及干細(xì)胞只能向內(nèi)層方向（即損傷部位）定向釋放，如圖3中箭頭。

4，復(fù)合膜支架周邊以醫(yī)用生物膠封閉，以保證活性因子及干細(xì)胞不從支架周圍溢出，保證了載藥系統(tǒng)一方面定向釋放，另一方面保證的釋放的時(shí)間和濃度；

5，復(fù)合膜具有超薄的特點(diǎn)（厚度不超過2mm），不會(huì)因?yàn)轶w積過大壓迫脊髓，同時(shí)有利于縫合硬脊膜，防止腦脊液漏形成。

需要做一個(gè)特別說明的是，和本發(fā)明最接近的現(xiàn)有技術(shù)，為：一種用于橋接缺損神經(jīng)的復(fù)合修復(fù)材料及其支架cn201510716279.8。其公開了一種用于橋接缺損神經(jīng)的復(fù)合修復(fù)材料及其支架，包括：所述復(fù)合材料是由絲素層-膠原層-高分子聚合物層依次排列組成，高分子聚合層呈t型或長(zhǎng)方形設(shè)計(jì)，應(yīng)用時(shí)通過折疊或卷折形成絲素層為內(nèi)層、膠原層為中層、高分子聚合物層為外層的神經(jīng)橋接支架。但是其所要解決的技術(shù)問題，和起到的技術(shù)效果，和本發(fā)明是完全不一樣的。

cn201510716279.8解決的技術(shù)問題是實(shí)現(xiàn)缺損神經(jīng)快速橋接，其實(shí)質(zhì)即為背景技術(shù)中介紹的“橋接截?cái)嗟纳窠?jīng)束”。其使用時(shí)，先將支架通過折疊或卷折形成絲素層為內(nèi)層、膠原層為中層、高分子聚合物層為外層的神經(jīng)橋接支架，其次將折疊或者券折后的支架兩端和截?cái)嗟纳窠?jīng)束兩端通過外科手術(shù)方法縫合。其中絲素層不僅引導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)，而且隔開不同神經(jīng)，防止形成神經(jīng)瘤。膠原層提供神經(jīng)軸突生長(zhǎng)/所需的各種養(yǎng)分。高分子聚合物層，具有良好的力學(xué)性能，提供手術(shù)縫合或吻合所需的力學(xué)強(qiáng)度，并且防止周圍神經(jīng)的侵入，防止纖維疤痕的形成。

本發(fā)明的復(fù)合膜支架，應(yīng)用于修復(fù)截?cái)嗷蛘卟糠质軗p的神經(jīng)束，不需要縫合，直接將復(fù)合膜貼附在神經(jīng)束的受損部位即可（如圖2）。其致密外層用于阻擋夾心層和內(nèi)層的活性因子及干細(xì)胞向該方面滲透并且通過該層膜向外界滲出（如圖3）；夾心層用于在一定時(shí)間內(nèi)，形成持續(xù)濃度藥物的析出；內(nèi)層提供干細(xì)胞。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，復(fù)合膜各層在復(fù)合膜中各自的作用和起到的技術(shù)效果，與cn201510716279.8完全不一樣，具有創(chuàng)造性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的三明治式復(fù)合膜支架示意圖。

圖2是本發(fā)明的三明治式復(fù)合膜支架貼附于脊髓示意圖。

圖3是復(fù)合膜支架藥物釋放方向（路徑）。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1）制作將一定分子量的聚乳酸（質(zhì)均分子量為5000-1000000，優(yōu)選5000-100000），溶解到有機(jī)溶劑中（有機(jī)溶劑包括1,4-二氧六環(huán)，丙酮，三氯甲烷/乙醇混合溶劑，二氯甲烷，四氫呋喃，及上述溶劑的混合溶劑），濃度為0.1-10wt%，采用旋涂、滴涂等方法制備聚乳酸薄膜，作為外側(cè)密封層；

2）將一定分子量的殼聚糖膜（質(zhì)均分子量為5000-1000000，優(yōu)選5000-100000），溶解到酸性水溶液中（采用的酸包括鹽酸、乙酸、硝酸），濃度為0.1-10wt%，采用旋涂、滴涂等方法制備殼聚糖薄膜，作為內(nèi)側(cè)控釋層及干細(xì)胞支架；

3）將干細(xì)胞懸液，采用逐層注入的方法使其均勻浸入上一步的殼聚糖薄膜內(nèi)部進(jìn)行培養(yǎng)；

4）制作介孔生物活性玻璃的制備過程，具體如下所述。將原硅酸乙酯，硝酸鈣，f127，2m的硝酸按一定質(zhì)量比加入無水乙醇的混合液中攪拌（典型比例為2.7gteos，1.18gca(no3)2?4h2o，4.2gf127以及0.08g2mhno3加入8g無水乙醇），室溫下攪拌3h獲得溶膠。將所得溶膠放入真空干燥箱中在50℃進(jìn)行溶膠凝膠過程，待溶膠凝膠化干燥后，于馬弗爐中600℃下燒結(jié)除去模板劑，即得介孔生物活性玻璃。然后將所得介孔生物活性玻璃研磨成均勻粉末，此粉末即為mbgs。配制神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子的飽和溶液，采用灌注法將其負(fù)載到介孔生物活性玻璃（以下稱之為mbgs）中，具體實(shí)施方法如下：用一定濃度的藥物溶液浸潤已知質(zhì)量的mbgs粉末，將其置于真空干燥箱中，真空條件下使其快速干燥，完成一次灌注周期。多次重復(fù)灌注可調(diào)節(jié)其載藥量，最后載藥完成后，置于干燥箱中，備用。記錄灌注次數(shù)，計(jì)算理論載藥量。以介孔生物活性玻璃負(fù)載生物活性因子作為夾心層.

5）疊加方式構(gòu)建三明治式復(fù)合膜載體方法如下：采用旋涂、滴涂等方法制備聚乳酸薄膜作為外側(cè)密封層，以生物活性玻璃負(fù)載生物活性因子并覆蓋于聚乳酸薄膜，再通過將殼聚糖膜或者殼聚糖溶液覆蓋在生物活性玻璃層上構(gòu)建三明治式復(fù)合膜載體。

實(shí)施例2

和實(shí)施例1相比，實(shí)施例2的區(qū)別之處在于，5）將各層以能夠滲透神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子和干細(xì)胞的醫(yī)用生物膠進(jìn)行粘連。