本發(fā)明涉及卵巢癌的基因治療領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及rpl10的抑制劑在制備治療卵巢癌的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。卵巢癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、化學(xué)治療和放射治療等，但難以徹底治愈。另外，由于復(fù)發(fā)、耐藥問(wèn)題以及放化療的毒副反應(yīng)等造成其預(yù)后極差。如何提高卵巢癌患者生存率、降低腫瘤復(fù)發(fā)率成為現(xiàn)階段臨床研究的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)和病毒學(xué)的發(fā)展，基因治療得以迅速發(fā)展?；蛑委熓侵冈诨颊叩哪[瘤細(xì)胞中插入某種特定的基因片段、核酸物質(zhì)或克隆基因，從而抑制、誘導(dǎo)、殺死或改變腫瘤細(xì)胞的行為。

核糖體蛋白l10(rpl10，又名qm)是核糖體蛋白家族成員之一。核糖體蛋白家族是人體細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的主要成員，在遺傳信息的傳遞過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用，但是合成蛋白質(zhì)傳遞遺傳信息并不是核糖體蛋白的唯一功能，其還發(fā)揮著蛋白質(zhì)翻譯以外的功能，大量研究證實(shí)了多種核糖體蛋白在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，部分在腫瘤中表達(dá)下調(diào)。目前的研究結(jié)果證明，核糖體蛋白家族通過(guò)調(diào)控癌基因和抑癌基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡、促進(jìn)血管生成、協(xié)同染色體上的基因發(fā)揮更加廣泛的作用，如調(diào)節(jié)腫瘤增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移惡性生物學(xué)行為。rpl10最早于1991年被發(fā)現(xiàn)作為wilms腫瘤的抑癌因子?，F(xiàn)有研究表明rpl10在斑節(jié)對(duì)蝦的卵巢中高表達(dá)，但是在人卵巢組織及卵巢腫瘤中尚無(wú)相關(guān)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供rpl10抑制劑的新用途。

本發(fā)明提供了rpl10的抑制劑在制備治療卵巢癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了rpl10的抑制劑在制備試劑中的應(yīng)用，所述的試劑用于：

a)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖；

b)抑制卵巢癌細(xì)胞遷移；

c)抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲；或

d)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，所述的抑制劑選自以rpl10蛋白或它們的轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制其蛋白表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄的反義核酸；或能表達(dá)或形成所述反義核酸的構(gòu)建物。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述的抑制劑為一種sirna分子，其正義鏈和反義鏈的序列分別如seqidno:3和seqidno:4所示。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述的抑制劑為一種shrna分子，其編碼序列如seqidno:7和seqidno:8所示。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述的抑制劑為一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物為包含seqidno:7和seqidno:8所示序列的載體。

本發(fā)明還提供了一種治療卵巢癌的sirna分子，所述的sirna分子的正義鏈和反義鏈的序列分別如seqidno:3和seqidno:4所示。

本發(fā)明還提供了一種治療卵巢癌的shrna分子，所述的shrna分子的編碼序列如seqidno.7和seqidno.8所示。

本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物為包含seqidno:7和seqidno:8所示序列的載體。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含如上所述的sirna分子、如上所述的shrna分子，或如上所述的構(gòu)建物，以及藥學(xué)上可接受的藥物載體。

如本文所用，所述的“rpl10抑制劑”包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等，只要它們能夠下調(diào)rpl10的表達(dá)水平。它們可以是化合物、化學(xué)小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是抑制rpl10表達(dá)的病毒產(chǎn)品。所述的rpl10抑制劑是指任何可降低rpl10的活性、降低rpl10的穩(wěn)定性、下調(diào)rpl10的表達(dá)、減少rpl10有效作用時(shí)間的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對(duì)于下調(diào)rpl10有用的物質(zhì)。例如，所述的抑制劑是：核酸抑制物，蛋白抑制劑，核酸酶，核酸結(jié)合分子，只要其能夠下調(diào)rpl10的表達(dá)。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)敲除rpl10后可抑制卵巢癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)rpl10后可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲，細(xì)胞凋亡減少，提示rpl10具有抑制卵巢癌發(fā)生發(fā)展的作用，可作為新興治療靶點(diǎn)，針對(duì)卵巢癌rpl10高表達(dá)的病人給予降低rpl10的表達(dá)，存在潛在治療效果，rpl10的抑制劑可用于制備治療卵巢癌的藥物。

2、本發(fā)明合成的sirna敲低效果顯著優(yōu)于其他sirna，具備良好的藥物開(kāi)發(fā)前景，取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。

附圖說(shuō)明

圖1.western-blot方法驗(yàn)證rpl10-sirna的敲低效果。

圖2.phy-310慢病毒載體圖譜。

圖3.western-blot方法驗(yàn)證rpl10-shrna-388的敲低效果。

圖4.rpl10對(duì)細(xì)胞增殖的影響。a和c：rpl10-shrna的敲低表達(dá)驗(yàn)證；e：增殖實(shí)驗(yàn)顯示rpl10敲低(rpl10-shrna)可抑制細(xì)胞增殖；b和d：rpl10-plasmid的高表達(dá)驗(yàn)證；f：增殖實(shí)驗(yàn)顯示rpl10表達(dá)增高后(rpl10-plasmid)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖5.transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。a：rpl10敲低后的遷移和侵襲，rpl10-shrna可抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲；b：rpl10過(guò)表達(dá)后的遷移和侵襲，rpl10-plasmid可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖6.流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。a：rpl10-shrna及其對(duì)照組control的流式檢測(cè)凋亡結(jié)果，rpl10-shrna的早期凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組多；b：rpl10-plasmid及其對(duì)照組vector的流式檢測(cè)凋亡結(jié)果，rpl10-plasmid的早期凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組少。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

一、合成rpl10-sirna

1、rpl10-sirna序列信息

rpl10-humo-339s1：

sense(5'-3')：5'cauggugucagaugaauau3'(seqidno:1)

antisense(5'-3')：5'auauucaucugacaccaug3'(seqidno:2)

rpl10-humo-388s2：

sense(5'-3')：5'gcccgaauuugugccaaua3'(seqidno:3)

antisense(5'-3')：5'uauuggcacaaauucgggc3'(seqidno:4)

rpl10-humo-723s3：

sense(5'-3')：5'guccaccuaugucuuugua3'(seqidno:5)

antisense(5'-3')：5'uacaaagacauagguggac3'(seqidno:6)

在以上各序列的3'端均增加tt以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。

2、rpl10-sirna-388s2沉默效果最佳

卵巢癌細(xì)胞ovcar-3鋪板24小時(shí)給予rpl10-sirna及對(duì)照組c-sirna轉(zhuǎn)染(羅氏x(chóng)-tremegenesirna轉(zhuǎn)染試劑10μl+sirna2μg)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取蛋白。結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)rpl10-sirna-388(s2)敲低效果最明顯，敲低效率高達(dá)99％，顯著高于其他sirna序列的敲低效率(p<0.05)。

二、合成rpl10-shrna

1、慢病毒干擾載體的構(gòu)建

(1)rpl10-shrna-388s2序列信息

由于rpl10-sirna-388s2的敲低效果最為明顯，以此合成shrna。

topstrand：

5'-gatccgcccgaatttgtgccaatattcaagagatattggcacaaattcgggcttttttg-3'(seqidno:7)

bottomstrand：

5'-aattcaaaaaagcccgaatttgtgccaatatctcttgaatattggcacaaattcgggcg-3'(seqidno:8)

(2)rnai慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1)shrna的退火；

2)shrna載體(phy-310慢病毒載體，購(gòu)于漢尹生物科技(上海)有限公司，載體圖譜如圖2所示)的酶切及回收；

3)shrna載體與引物的連接；

4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化；

5)重組質(zhì)粒的制備；

6)測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。

最終shrna的編碼序列插入到phy-310慢病毒載體的bamhi和ecori位點(diǎn)之間，經(jīng)過(guò)比對(duì)，重組克隆中插入片段序列與設(shè)計(jì)的oligo序列完全一致。2、慢病毒的包裝和病毒滴度的測(cè)定

使用hgtransgenereagent將構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，包裝ovcar-3病毒，收集病毒原液，超濾濃縮，并測(cè)定滴度為1*10⁹tu/ml。

3、rpl10-shrna-388沉默效果驗(yàn)證

使用rpl10-shrna干預(yù)卵巢癌細(xì)胞株：以moi＝20(ovcar-3)加入病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(rpl10-shrna)。對(duì)照組空轉(zhuǎn)等量慢病毒顆粒(control)。使用western-blot方法驗(yàn)證敲除效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)圖3，rpl10-shrna-388敲低效果較對(duì)照下降60％。

三、rpl10對(duì)細(xì)胞增殖的影響

以moi＝20(ovcar-3)建立rpl10敲低表達(dá)的rpl10-shrna細(xì)胞株，對(duì)照組空轉(zhuǎn)等量慢病毒顆粒(control)。同時(shí)合成rpl10質(zhì)粒接慢病毒轉(zhuǎn)染ovcar-3細(xì)胞，以moi＝15建立rpl10過(guò)表達(dá)的rpl10-plasmid細(xì)胞株，對(duì)照組空轉(zhuǎn)等量接有空質(zhì)粒的慢病毒顆粒(vector)。

經(jīng)western-blot(圖4中a、b、c和d)驗(yàn)證敲除效率，wst法(圖4中e和f)檢測(cè)增殖效率，分別用酶標(biāo)儀測(cè)24h、48h、72hod450nm的吸光度。各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)之前，每孔加10μlwst-1，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。結(jié)果表明卵巢癌細(xì)胞株ovcar-3敲除rpl10后可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。

四、rpl10對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲功能的影響

1、rpl10低表達(dá)的transwell遷移實(shí)驗(yàn)

ovcar-3細(xì)胞用無(wú)血清rpmi-1640培養(yǎng)基混懸，計(jì)數(shù)50000個(gè)/100μl，上室加入100μl細(xì)胞懸液，下室加入600μl含10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)基，36小時(shí)后取出上室，pbs洗3遍，4％多聚甲醛固定15分鐘，結(jié)晶紫浸泡30分鐘，pbs洗3遍，用棉簽輕輕擦掉小時(shí)上面的細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的遷移細(xì)胞，分別重復(fù)三次。結(jié)果(圖5中a)顯示rpl10-shrna細(xì)胞遷移能力較對(duì)照細(xì)胞低。

2、rpl10低表達(dá)的transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

用不含血清的培養(yǎng)基rpmi-1640稀釋matrigel基質(zhì)膠至終濃度為250μg/ml，上室加入80μl稀釋后的matrigel膠，放37度靜置4小時(shí)，吸棄上清析出液。ovcar-3細(xì)胞用無(wú)血清rpmi-1640培養(yǎng)基混懸，計(jì)數(shù)50000個(gè)/100μl，上室加入100μl細(xì)胞懸液，下室加入600μl含10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)基，48小時(shí)后取出上室，pbs洗3遍，4％多聚甲醛固定15分鐘，結(jié)晶紫浸泡30分鐘，pbs洗3遍，用棉簽輕輕擦掉小室上面的細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的侵襲細(xì)胞，分別重復(fù)3次。結(jié)果(圖5中a)顯示rpl10-shrna細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照細(xì)胞低。

3、rpl10過(guò)表達(dá)的transwell遷移實(shí)驗(yàn)

ovcar-3細(xì)胞用無(wú)血清rpmi-1640培養(yǎng)基混懸，計(jì)數(shù)50000個(gè)/100μl，上室加入100ul細(xì)胞懸液，下室加入600μl含10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)基，36小時(shí)后取出上室，pbs洗3遍，4％多聚甲醛固定15分鐘，結(jié)晶紫浸泡30分鐘，pbs洗3遍，用棉簽輕輕擦掉小時(shí)上面的細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的遷移細(xì)胞，分別重復(fù)三次。結(jié)果(圖5中b)顯示rpl10-plasmid細(xì)胞遷移能力較對(duì)照細(xì)胞增強(qiáng)。

4、rpl10過(guò)表達(dá)的transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

用不含血清的培養(yǎng)基rpmi-1640稀釋matrigel基質(zhì)膠至終濃度為250μg/ml，上室加入80μl稀釋后的matrigel膠，放37度靜置4小時(shí)，吸棄上清析出液。ovcar-3細(xì)胞用無(wú)血清rpmi-1640培養(yǎng)基混懸，計(jì)數(shù)50000個(gè)/100μl，上室加入100μl細(xì)胞懸液，下室加入600μl含10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)基，48小時(shí)后取出上室，pbs洗3遍，4％多聚甲醛固定15分鐘，結(jié)晶紫浸泡30分鐘，pbs洗3遍，用棉簽輕輕擦掉小室上面的細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的侵襲細(xì)胞，分別重復(fù)3次。結(jié)果(圖5中b)顯示rpl10-plasmid細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照細(xì)胞增強(qiáng)。

五、rpl10對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

取處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的rpl10-shrna及其對(duì)照組control，rpl10-plasmid及其對(duì)照vector，pbs清洗、胰酶(不含edta)消化、離心(800rpm，5min，25℃)。此過(guò)程中，培養(yǎng)細(xì)胞用的舊培養(yǎng)基、pbs清洗液等液體均要回收；完全培養(yǎng)基終止消化后，回收上清液，pbs清洗，離心(800rpm，8min，4℃)；重復(fù)上步驟兩次；棄殘留液體后，加入1×bindingbuffer100μl重懸；分別加入5μlapc(rpl10-shrna及其對(duì)照組control)或5μlfitc(rpl10-plasmid及其對(duì)照vector)和5μlpi，操作過(guò)程中避光；室溫靜置15min，避光；加入1×bindingbuffer400μl重懸；一小時(shí)內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果(圖6)顯示rpl10-shrna細(xì)胞凋亡較對(duì)照組增多，rpl10-plasmid細(xì)胞凋亡較對(duì)照組減少。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院

<120>rpl10的抑制劑在制備治療卵巢癌的藥物中的應(yīng)用

<130>/

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

cauggugucagaugaauau19

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>2

auauucaucugacaccaug19

<210>3

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>3

gcccgaauuugugccaaua19

<210>4

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>4

uauuggcacaaauucgggc19

<210>5

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>5

guccaccuaugucuuugua19

<210>6

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>6

uacaaagacauagguggac19

<210>7

<211>59

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gatccgcccgaatttgtgccaatattcaagagatattggcacaaattcgggcttttttg59

<210>8

<211>59

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

aattcaaaaaagcccgaatttgtgccaatatctcttgaatattggcacaaattcgggcg59