本發(fā)明涉及一種含重組人表皮生長因子制劑，尤其涉及一種重組人表皮生長因子粉劑及其制備方法、皮膚修護(hù)劑及其制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
人表皮生長因子(hegf)廣泛存在于體液和多種腺體中，由于hegf體內(nèi)的含量極微，提取成本高且產(chǎn)品純度低，使hegf的應(yīng)用受到了限制。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，生物學(xué)家通過基因重組技術(shù)，成功利用大腸桿菌為宿主生產(chǎn)hegf，實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)rhegf。
hegf分子結(jié)構(gòu)由53個氨基酸組成，分子量6201道爾頓，分子內(nèi)有6個半胱氨酸組成的二硫鍵，形成3個分子內(nèi)環(huán)型結(jié)構(gòu)，組成生物活性所必須的受體結(jié)合區(qū)域。實驗研究表明，hegf可刺激多種細(xì)胞的增殖，主要是表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，可以用于角膜損傷、燒燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合取得了很好的療效；hegf還能促進(jìn)正常表皮細(xì)胞的新陳代謝，添加到美容護(hù)膚品中可以達(dá)到美白、抗皺、延緩衰老的作用。目前，國內(nèi)以hegf為原料生產(chǎn)的藥品制劑有凝膠、水劑、敷料等品種。
但是，現(xiàn)有的以hegf為原料生產(chǎn)的藥品制劑存在以下缺陷：
(1)由于hegf是一種生物活性蛋白質(zhì)，hegf在水溶液中活性一般只能保存7-10天，因此生產(chǎn)產(chǎn)品一般需要添加適當(dāng)保護(hù)劑以減緩hegf的失活，但目前還沒找到一種能完全避免hegf失活的物質(zhì)；
(2)產(chǎn)品做成凝膠、敷料的產(chǎn)品生長因子活性好于水劑，但由于添加hegf含量極微，凝膠和膏體流動性差，限制hegf到達(dá)表皮作用部位發(fā)揮作用，水劑流動性好，但失活半衰期比凝膠和膏體大。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種重組人表皮生長因子粉劑，該粉劑中的重組人表皮生長因子不僅能促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，可以用于角膜損傷、燒燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合，還能促進(jìn)正常表皮細(xì)胞的新陳代謝，起到美白、抗皺、延緩衰老的作用，而且保證了重組人表皮生長因子的活性，提高了重組人表皮生長因子的作用效率。
本發(fā)明的目的之二在于提供一種重組人表皮生長因子粉劑的制備方法，該制備方法制備為粉劑，既保證重組人表皮生長因子的活性和產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)有效性，而且步驟簡單易操作，節(jié)省了人力物力。
本發(fā)明的目的之三在于提供一種皮膚修護(hù)劑，該皮膚修護(hù)劑不僅包括促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和正常代謝的重組人表皮生長因子粉劑，而且包括促進(jìn)皮膚吸收的修護(hù)水劑，使得重組人表皮生長因子更容易地進(jìn)入皮膚發(fā)揮作用。
本發(fā)明的目的之四在于提供一種皮膚修護(hù)劑的制備方法，該制備方法將重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑分別制備后獨立包裝在同一個噴霧瓶中，使用時將兩者混合即可，該方法使得重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑相對獨立，這樣保證了重組人表皮生長因子活性的穩(wěn)定。
本發(fā)明的目的之五在于提供一種皮膚修護(hù)劑的使用方法，將噴霧瓶中相對獨立的重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑混合后，使重組人表皮生長因子粉劑溶解后，再噴涂至皮膚上，操作方便、使用便捷。
本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種重組人表皮生長因子粉劑，其是由如下以質(zhì)量百分比計的組分制備而成：
本發(fā)明的目的之二采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種重組人表皮生長因子粉劑的制備方法，包括，
備料步驟：按配比稱量甘露糖醇、甘氨酸、人血白蛋白和重組人表皮生長因子，倒入混合罐，加入第一純化水，攪拌，直至溶解，得到第一混合液；
過濾步驟：將第一混合液經(jīng)微孔過濾，得到第二混合液；
干燥步驟：將第二混合液放入真空冷凍干燥機(jī)中，抽真空升華，出料得到重組人表皮生長因子粉劑。
進(jìn)一步地，備料步驟中，攪拌的速度為500-1000r/min，攪拌時間為8-12min。
進(jìn)一步地，過濾步驟中，微孔濾膜的孔徑為0.2-0.3μm。
進(jìn)一步地，干燥步驟中，第二混合液放入真空冷凍干燥機(jī)后，真空冷凍干燥機(jī)先降溫至-40至-30℃，預(yù)凍0.5-1.2h，然后自動加熱，抽真空升華，升溫至30-35℃，保持5-7h，最后再停機(jī)出料。
進(jìn)一步地，干燥步驟中，真空壓強(qiáng)為9-11mpa。
本發(fā)明的目的之三采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種皮膚修護(hù)劑，其是由前述的重組人表皮生長因子粉劑以及修護(hù)水劑制備而成；所述修護(hù)水劑是由如下以質(zhì)量百分比計的組分制備而成：
本發(fā)明的目的之四采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種皮膚修護(hù)劑的制備方法，包括重組人表皮生長因子粉劑制備步驟、修護(hù)水劑制備步驟和組合包裝步驟；
重組人表皮生長因子粉劑制備步驟包括：
備料步驟：按配比稱量甘露糖醇、甘氨酸、人血白蛋白和重組人表皮生長因子，倒入混合罐，加入第一純化水，攪拌，直至溶解，得到第一混合液a；
過濾步驟：將第一混合液a經(jīng)微孔過濾，得到第二混合液a；
干燥步驟：將第二混合液a放入真空冷凍干燥機(jī)中，抽真空升華，出料得到重組人表皮生長因子粉劑；
修護(hù)水劑制備步驟包括：
配料步驟：按配比將透明質(zhì)酸、膠原蛋白倒入混合罐，加入1/4-1/2的第二純化水，加熱溶解后，得到第一混合液b；
填料步驟：將甘油、海藻糖和甘草類黃酮倒入第一混合液b中，加入剩余的第二純化水，攪拌均勻，得到第二混合液b；
微濾步驟：將第二混合液b經(jīng)孔徑為0.2-0.3μm的微孔過濾，得到修護(hù)水劑；
組合包裝步驟包括：
將重組人表皮生長因子粉劑填充在噴霧瓶的上層，將修護(hù)水劑填充在噴霧瓶的下層，即得皮膚修護(hù)劑。
進(jìn)一步地，修護(hù)水劑制備步驟的配料步驟中，加熱至75-85℃，溶解后，降溫至40-50℃，得到第一混合液b。
本發(fā)明的目的之五采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種皮膚修護(hù)劑的使用方法，該皮膚修護(hù)劑為前述的制備方法得到的皮膚修護(hù)劑，使用方法包括以下步驟，
混合步驟：將噴霧瓶上層的重組人表皮生長因子粉劑溶解于噴霧瓶下層的修護(hù)水劑中，混合均勻，得到皮膚修護(hù)劑；
噴涂步驟：將噴霧瓶的噴射口放置于距離皮膚待修復(fù)位置5-10cm，按壓噴霧瓶的噴頭將皮膚修護(hù)劑噴涂于皮膚上，待皮膚修護(hù)劑被吸收即可。
相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
(1)本發(fā)明的重組人表皮生長因子粉劑，該粉劑中的重組人表皮生長因子不僅能促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，可以用于角膜損傷、燒燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合，還能促進(jìn)正常表皮細(xì)胞的新陳代謝，起到美白、抗皺、延緩衰老的作用，而且保證了重組人表皮生長因子的活性，提高了重組人表皮生長因子的作用效率；
(2)本發(fā)明的重組人表皮生長因子粉劑的制備方法，該制備方法制備為粉劑，既保證重組人表皮生長因子的活性和產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)有效性，而且步驟簡單易操作，節(jié)省了人力物力；
(3)本發(fā)明的皮膚修護(hù)劑，該皮膚修護(hù)劑不僅包括促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和正常代謝的重組人表皮生長因子粉劑，而且包括促進(jìn)皮膚吸收的修護(hù)水劑，使得重組人表皮生長因子更容易地進(jìn)入皮膚發(fā)揮作用；
(4)本發(fā)明的皮膚修護(hù)劑的制備方法，該制備方法將重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑分別制備后獨立包裝在同一個噴霧瓶中，使用時將兩者混合即可，該方法使得重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑相對獨立，這樣保證了重組人表皮生長因子活性的穩(wěn)定；
(5)本發(fā)明的皮膚修護(hù)劑的使用方法，將噴霧瓶中相對獨立的重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑混合后，使重組人表皮生長因子粉劑溶解后，再噴涂至皮膚上，操作方便、使用便捷。
具體實施方式
下面，結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，需要說明的是，在不相沖突的前提下，以下描述的各實施例之間或各技術(shù)特征之間可以任意組合形成新的實施例。
一種重組人表皮生長因子粉劑，其是由如下以質(zhì)量百分比計的組分制備而成：
上述重組人表皮生長因子粉劑的制備方法，包括，
備料步驟：按配比稱量甘露糖醇、甘氨酸、人血白蛋白和重組人表皮生長因子，倒入混合罐，加入第一純化水，攪拌，攪拌的速度為500-1000r/min，攪拌時間為8-12min，直至溶解，得到第一混合液；
過濾步驟：將第一混合液經(jīng)微孔過濾，微孔濾膜的孔徑為0.2-0.3μm，得到第二混合液；
干燥步驟：將第二混合液放入真空冷凍干燥機(jī)中后，真空冷凍干燥機(jī)先降溫至-40至-30℃，預(yù)凍0.5-1.2h，然后自動加熱，抽真空升華，真空壓強(qiáng)為9-11mpa，升溫至30-35℃，保持5-7h，最后再停機(jī)出料得到重組人表皮生長因子粉劑。
一種皮膚修護(hù)劑，其是由前述的重組人表皮生長因子粉劑以及修護(hù)水劑制備而成；修護(hù)水劑是由如下以質(zhì)量百分比計的組分制備而成：
上述皮膚修護(hù)劑的制備方法，包括重組人表皮生長因子粉劑制備步驟、修護(hù)水劑制備步驟和組合包裝步驟；
重組人表皮生長因子粉劑制備步驟包括：
備料步驟：按配比稱量甘露糖醇、甘氨酸、人血白蛋白和重組人表皮生長因子，倒入混合罐，加入第一純化水，攪拌，直至溶解，得到第一混合液a；
過濾步驟：將第一混合液a經(jīng)微孔過濾，得到第二混合液a；
干燥步驟：將第二混合液a放入真空冷凍干燥機(jī)中，抽真空升華，出料得到重組人表皮生長因子粉劑；
修護(hù)水劑制備步驟包括：
配料步驟：按配比將透明質(zhì)酸、膠原蛋白倒入混合罐，加入1/4-1/2的第二純化水，加熱至75-85℃，溶解后，降溫至40-50℃，得到第一混合液b；
填料步驟：將甘油、海藻糖和甘草類黃酮倒入第一混合液b中，加入剩余的第二純化水，攪拌均勻，得到第二混合液b；
微濾步驟：將第二混合液b經(jīng)孔徑為0.2-0.3μm的微孔過濾，得到修護(hù)水劑；
組合包裝步驟包括：
將重組人表皮生長因子粉劑填充在噴霧瓶的上層，將修護(hù)水劑填充在噴霧瓶的下層，即得皮膚修護(hù)劑。
一種皮膚修護(hù)劑的使用方法，該皮膚修護(hù)劑為前述的制備方法得到的皮膚修護(hù)劑，使用方法包括以下步驟，
混合步驟：將噴霧瓶上層的重組人表皮生長因子粉劑溶解于噴霧瓶下層的修護(hù)水劑中，混合均勻，得到皮膚修護(hù)劑；
噴涂步驟：將噴霧瓶的噴射口放置于距離皮膚待修復(fù)位置5-10cm，按壓噴霧瓶的噴頭將皮膚修護(hù)劑噴涂于皮膚上，待皮膚修護(hù)劑被吸收即可。
本發(fā)明的重組人表皮生長因子(活性7500萬u/g)由深圳華生元基因工程發(fā)展有限公司提供，其余原料為市售醫(yī)藥級原料。
實施例1-5：
實施例1-5的皮膚修護(hù)劑，均是由重組人表皮生長因子粉劑以及修護(hù)水劑制備而成；重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑是由如下以質(zhì)量百分比計的組分制備而成：
表1實施例1-5的重組人表皮生長因子粉劑以及修護(hù)水劑配比
上述皮膚修護(hù)劑均按照如下制備方法制備得到，制備方法包括重組人表皮生長因子粉劑制備步驟、修護(hù)水劑制備步驟和組合包裝步驟；
重組人表皮生長因子粉劑制備步驟包括：
備料步驟：按配比稱量甘露糖醇、甘氨酸、人血白蛋白和重組人表皮生長因子，倒入混合罐，加入第一純化水，攪拌，攪拌的速度為500-1000r/min，攪拌時間為8-12min，直至溶解，得到第一混合液；
過濾步驟：將第一混合液經(jīng)微孔過濾，微孔濾膜的孔徑為0.2-0.3μm，得到第二混合液；
干燥步驟：將第二混合液放入真空冷凍干燥機(jī)中后，真空冷凍干燥機(jī)先降溫至-40至-30℃，預(yù)凍0.5-1.2h，然后自動加熱，抽真空升華，真空壓強(qiáng)為9-11mpa，升溫至30-35℃，保持5-7h，最后再停機(jī)出料得到重組人表皮生長因子粉劑；
修護(hù)水劑制備步驟包括：
配料步驟：按配比將透明質(zhì)酸、膠原蛋白倒入混合罐，加入1/4-1/2的第二純化水，加熱至75-85℃，溶解后，降溫至40-50℃，得到第一混合液b；
填料步驟：將甘油、海藻糖和甘草類黃酮倒入第一混合液b中，加入剩余的第二純化水，攪拌均勻，得到第二混合液b；
微濾步驟：將第二混合液b經(jīng)孔徑為0.2-0.3μm的微孔過濾，得到修護(hù)水劑；
組合包裝步驟包括：
將重組人表皮生長因子粉劑填充在噴霧瓶的上層，將修護(hù)水劑填充在噴霧瓶的下層，即得皮膚修護(hù)劑。
對比例：
對比例為一種皮膚修護(hù)液，其是由重組人表皮生長因子粉劑以及修護(hù)水劑制備而成；重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑與實施例2的組分和配比相同，只是a溶液不需冷凍干燥步驟，直接與b溶液混合得到產(chǎn)品。
該皮膚修護(hù)液的制備方法包括：
1)按配比稱量透明質(zhì)酸、膠原蛋白，倒入混合罐，加入1/2純化水，開動攪拌，升溫，加熱至80℃，繼續(xù)攪拌15分鐘，直至所有物質(zhì)溶解后，降溫至45℃，得到a溶液；
2)按配比稱量甘露糖醇、甘氨酸、人血白蛋白、重組人表皮生長因子、甘油、海藻糖和甘草類黃酮，再加入剩余純化水，攪拌10分鐘，得到b溶液；
3)將a溶液與b溶液混合均勻，用0.22um微孔濾膜過濾，得到皮膚修護(hù)液。
效果評價及性能檢測
為了考察活性物質(zhì)重組人表皮生長因子不同比例對效果的影響，因此對實施例1-3以及對比例進(jìn)行實驗驗證。
一、產(chǎn)品表皮生長因子活性穩(wěn)定性試驗對比
試驗樣品按規(guī)定溫度條件保存，每隔一短時間取樣檢測，比較表皮生長因子活性，評價穩(wěn)定性效果。表皮生長因子活性檢測：按《中國藥典》三部附錄xh重組人表皮生長因子生物學(xué)活性測定方法。
1、按常規(guī)儲存條件2-8℃保存
表2實施例2與對比例常規(guī)存儲活性對比
從表2可見，實施例2的皮膚修護(hù)劑明顯保持表皮生長因子活性穩(wěn)定，12個月活力僅下降1％，而對比例的皮膚修護(hù)液12個月活性下降超過43.38％。
2、破壞性試驗(儲存溫度30度)
表3實施例2與對比例破壞存儲活性對比
由表3可見，皮膚修護(hù)劑穩(wěn)定性比皮膚修護(hù)劑高，對比例的皮膚修護(hù)液30℃條件儲存12個月液體產(chǎn)品活力下降70％，實施例2的皮膚修護(hù)劑僅為15.89％。
二、應(yīng)用效果對比
1、試驗方法
選小鼠的balb3t3細(xì)胞，在含有10％fbs(gibco公司)的dmem(gibco公司)培養(yǎng)基置37℃co2培養(yǎng)箱(memmertinco246)培養(yǎng)，將貼壁細(xì)胞洗脫、離心，用dmem培養(yǎng)基稀釋使細(xì)胞濃度為1×105左右，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長較緊密的連接成單層后，用寬度為1.5mm的金屬片在培養(yǎng)孔中央垂直劃一道痕跡，吸出原培養(yǎng)液，每孔加100μl培養(yǎng)液洗兩次，洗凈懸浮細(xì)胞，然后各孔加入不同終濃度的培養(yǎng)液100μl，空白對照僅加入dmem培養(yǎng)液100μl，每個濃度組做3個平行樣。分別測量不同培養(yǎng)時間(0、6、12、18、24h)的劃痕創(chuàng)面愈合情況。按創(chuàng)面愈合率％＝(0h創(chuàng)面面積-th創(chuàng)面面積)/0h創(chuàng)面面積×100％，計算樣品對細(xì)胞修復(fù)的影響，數(shù)據(jù)處理用imagepro-plus圖像分析軟件計算。
試驗樣品說明：空白為不添加(自然愈合)；實施例1、實施例2、實施例3和對比例的樣品均為8℃儲存一個月后使用。
2、試驗結(jié)果
表4實施例1-3以及對比例應(yīng)用效果對比
由表4可見，實施例1-3比空白對照組明顯愈合快，相同成分配比的實施例2與對比例比較，實施例2的18h可以100％愈合，直接配制表皮生長因子到溶液樣品的對比例要24h才愈合，皮膚修護(hù)劑明顯比單純液態(tài)的皮膚修護(hù)液效果顯著。
綜上所述，本發(fā)明的皮膚修護(hù)劑不僅包括促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和正常代謝的重組人表皮生長因子粉劑，該粉劑中的重組人表皮生長因子不僅能促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，可以用于角膜損傷、燒燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合，還能促進(jìn)正常表皮細(xì)胞的新陳代謝，起到美白、抗皺、延緩衰老的作用，也保證了重組人表皮生長因子的活性，提高了重組人表皮生長因子的作用效率，而且包括促進(jìn)皮膚吸收的修護(hù)水劑，使得重組人表皮生長因子更容易地進(jìn)入皮膚發(fā)揮作用；同時，重組人表皮生長因子粉劑和修護(hù)水劑相對獨立，這樣保證了重組人表皮生長因子活性的穩(wěn)定。
上述實施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。