本發(fā)明涉及去鐵胺的一種新用途，即去鐵胺在制備用于治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應用。

背景技術：

非酒精性脂肪性肝病(nafld)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，肝臟組織學病變和酒精性脂肪肝具有相似的臨床癥狀和體征，可發(fā)展為肝硬化和肝癌。

近年來隨著生活水平的提高，nafld的發(fā)病率逐年攀升，普通人群中約有14％至24％患有nafld，已成為最常見的肝臟疾患之一。

目前，限制熱量攝取和運動是治療nafld唯一有效的手段，但對于多數(shù)患者而言常難以堅持。因此，開發(fā)治療nafld的有效藥物十分必要。

現(xiàn)有技術中，去鐵胺主要適用于治療急性鐵中毒和貧血治療中輸血產生的慢性鐵過載。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供去鐵胺的一種新用途，即去鐵胺在制備用于治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應用。

本發(fā)明首先保護物質甲或物質乙或物質丙在制備藥物中的應用；所述物質甲為去鐵胺；所述物質乙為去鐵胺藥物學可接受的鹽；所述物質丙為去鐵胺的溶劑合物；所述藥物的用途為治療和/或預防脂肪肝。

所述脂肪肝具體可為非酒精性脂肪肝。

所述脂肪肝具體可為高膽固醇引起的脂肪肝。

所述去鐵胺藥物學可接受的鹽具體可為甲磺酸去鐵胺。

本發(fā)明還保護一種藥物，其活性成分為物質甲或物質乙或物質丙；所述物質甲為去鐵胺；所述物質乙為去鐵胺藥物學可接受的鹽；所述物質丙為去鐵胺的溶劑合物；所述藥物的用途為治療和/或預防脂肪肝。

所述脂肪肝具體可為非酒精性脂肪肝。

所述脂肪肝具體可為高膽固醇引起的脂肪肝。

所述去鐵胺藥物學可接受的鹽具體可為甲磺酸去鐵胺。

本發(fā)明還保護物質甲或物質乙或物質丙在制備產品中的應用；所述物質甲為去鐵胺；所述物質乙為去鐵胺藥物學可接受的鹽；所述物質丙為去鐵胺的溶劑合物；所述產品的用途為如下(1)至(14)中的至少一種：

(1)抑制肝臟內脂肪的積累；

(2)改善肝臟的脂肪變性；

(3)抑制肝臟體重比增加；

(4)抑制谷丙轉氨酶升高；

(5)抑制肝細胞脂質蓄積；

(6)抑制脂肪酸合成相關基因的表達；

(7)抑制炎癥相關因子基因的表達；

(8)抑制脂肪肝患者的肝臟內脂肪的積累；

(9)改善脂肪肝患者的肝臟的脂肪變性；

(10)抑制脂肪肝患者的肝臟體重比增加；

(11)抑制脂肪肝患者的谷丙轉氨酶升高；

(12)抑制脂肪肝患者的肝細胞脂質蓄積；

(13)抑制脂肪肝患者的脂肪酸合成相關基因的表達；

(14)抑制脂肪肝患者的炎癥相關因子基因的表達。

以上任一所述脂肪肝具體可為非酒精性脂肪肝。

以上任一所述脂肪肝具體可為高膽固醇引起的脂肪肝。

所述去鐵胺藥物學可接受的鹽具體可為甲磺酸去鐵胺。

所述產品可為藥品或保健品。

所述脂肪酸合成相關基因具體可為srebp-1基因和/或fasn基因和/或scd5基因和/或scd1基因。

所述炎癥相關因子基因具體可為tnfα基因和/或il-8基因和/或il-1β基因。

去鐵胺作為治療鐵毒性和鐵過載的藥物已經在臨床應用多年，藥物的安全性好，毒副作用小。本發(fā)明公開了去鐵胺在治療非酒精性脂肪肝中的新用途。本發(fā)明的發(fā)明人通過建立高膽固醇動物模型證實了去鐵胺可以明顯改善高膽固醇誘導的肝組織病理學改變，減輕肝細胞的損傷，降低肝內脂質蓄積。本發(fā)明開發(fā)了去鐵胺的新用途，又為治療非酒精性脂肪肝提供了新途徑。

附圖說明

圖1為實施例1中的肝臟表型比較、肝組織病理學分析、肝臟體重比和血漿谷丙轉氨酶活性分析的結果。

圖2為實施例1中肝臟中的膽固醇和甘油三酯的含量的結果。

圖3為實施例2中肝臟表型比較和肝組織病理學分析的結果。

圖4為實施例2中肝臟體重比和血漿谷丙轉氨酶活性的結果。

圖5為實施例3中油紅o染色的結果。

圖6為實施例3中脂肪酸合成相關基因和炎癥相關因子基因表達量分析的結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。圖表數(shù)據(jù)均經過統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計學分析使用ibmspssstatistics,version19進行雙樣本t-test和單因素方差分析檢驗，結果顯示為平均值±標準誤，p<0.05為有顯著性差異。

c57bl/6小鼠：北京維通利華實驗動物技術有限公司，品系代碼213。膽固醇(飼料用)：北京天啟化工科技有限公司。普通飼料為ain-93m飼料。高膽固醇飼料：98.5質量份普通飼料和1.5質量份膽固醇混合。基礎培養(yǎng)基為dmem高糖培養(yǎng)基：hyclone，sh30022.01。膽固醇(細胞實驗)：西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，貨號c3045。

實施例1和實施例2中所用的甲磺酸去鐵胺為得斯芬(注射用甲磺酸去鐵胺)，為白色至類白色疏松塊狀物或粉末，novartispharmasteinag(瑞士諾華制藥有限公司)，進口藥品注冊證號h20140678。實施例3中所用的甲磺酸去鐵胺為西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司生產，貨號d9533。

甲磺酸去鐵胺的結構式見式(ⅰ)。

甲磺酸去鐵胺溶液：將甲磺酸去鐵胺溶于滅菌后的0.9％生理鹽水溶液，使甲磺酸去鐵胺的濃度為0.00625g/ml。

hepg2細胞(人肝癌細胞)：americantypeculturecollection。

實施例1、動物試驗

一、分組處理

取17.5～23.3g、6-8周齡的雄性c57bl/6小鼠，適應性飼養(yǎng)2周，然后隨機分為四組(每組8只)，分別處理如下(分別處理的時間為22周，即第1周至第22周)：

空白對照組(ctr)：整個過程采用普通飼料飼喂；

藥物對照組(ctr+l72)：整個過程采用普通飼料飼喂；從第8周開始至第22周結束，每天注射甲磺酸去鐵胺溶液一次，單次注射劑量為“72mg甲磺酸去鐵胺/kg體重”；

模型組(hcd)：整個過程采用高膽固醇飼料飼喂；

藥物治療組(hcd+l72)：整個過程采用高膽固醇飼料飼喂；從第8周開始至第22周結束，每天注射甲磺酸去鐵胺溶液一次，單次注射劑量為“72mg甲磺酸去鐵胺/kg體重”。

二、相關檢測

第22周結束后，動物禁食8小時，稱重，通過戊巴比妥鈉腹腔注射全麻后處死，心臟穿刺取血并離心獲得血漿，肝臟灌注后取出稱重，拍照，并在冰上完成組織切分，立即放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1、肝臟表型比較

肝臟灌注后的照片見圖1a?？瞻讓φ战M小鼠的肝臟的顏色較深，肝臟體積較小。模型組小鼠的肝臟顏色淺，偏黃，肝臟體積較大。與模型組小鼠相比，藥物治療組小鼠的肝臟的顏色和體積都有所恢復。結果表明，去鐵胺可以抑制肝臟內脂肪的積累。

2、肝組織病理學分析(h&e染色)

取新鮮的肝組織，置于10％的中性福爾馬林溶液中固定，然后進行常規(guī)的組織學處理，之后用石蠟對組織塊進行包埋，石蠟切片(5μm)后用蘇木素和伊紅染色(h&e染色)進行組織病理學分析。

照片見圖1b。空白對照組小鼠的肝臟具有中央靜脈和輻射狀肝細胞的正常肝小葉結構，且肝細胞中并無過多脂肪積累。模型組小鼠的肝臟中肝臟細胞膨脹呈氣泡狀，肝細胞中充滿大量脂滴，細胞質疏松，細胞核呈固縮狀，細胞內有較大的脂滴。與模型組小鼠相比，藥物治療組小鼠的細胞形態(tài)有所改善，細胞質變得較緊密，細胞排列更加規(guī)則。結果表明，去鐵胺可以改善肝臟的脂肪變性。

3、計算各組小鼠的肝臟體重比(即肝臟重量與體重的比值)。

肝臟體重比是指示肝臟腫大、肝臟脂肪積累和非酒精性脂肪肝的一個重要指標。肝臟體重比的結果見圖1c。與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠的肝臟體重比顯著增加。與模型組小鼠相比，藥物治療組小鼠的肝臟體重比顯著降低。結果表明，去鐵胺可以抑制肝臟體重比增加。

4、血漿谷丙轉氨酶(alt)活性分析

血漿alt的活性反映了肝細胞損傷的程度。當肝細胞發(fā)生炎癥、壞死等損傷時，轉氨酶可釋放到血液里，導致轉氨酶升高，因此轉氨酶水平是臨床反應肝細胞損傷的敏感指標。血漿谷丙轉氨酶活性的結果見圖1d。與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠血漿谷丙轉氨酶活性顯著升高(p＜0.05)，約為空白對照組小鼠的2.64倍。與模型組小鼠相比，藥物治療組小鼠的血漿谷丙轉氨酶活性顯著降低，降低幅度約為51.4％。結果表明，去鐵胺可以抑制谷丙轉氨酶升高。

5、肝臟中的膽固醇和甘油三酯的含量

取冷凍的肝臟組織，在液氮環(huán)境中研磨成粉，用“氯仿：甲醇(1:2，體積比)+h2o”進行脂質提取，然后采用lc-ms進行脂質的檢測和分析。

肝臟組織中膽固醇(cho)、膽固醇酯(ce)、三酰甘油(tag)、二酰甘油(dag)的含量見圖2。圖2中，a為肝臟組織中的膽固醇含量，b為肝臟組織中的膽固醇酯含量，c為肝臟組織中的三酰甘油含量，d為肝臟組織中的二酰甘油含量。與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟內的膽固醇、膽固醇酯、三酰甘油、二酰甘油均顯著升高。與模型組小鼠相比，藥物治療組小鼠肝臟內的膽固醇、膽固醇酯、三酰甘油、二酰甘油均顯著降低。由于脂質在肝細胞內沉積是非酒精性脂肪肝發(fā)生發(fā)展的必要條件。所以，一定程度上肝臟內脂質沉積反應了脂質在體內的蓄積水平。結果表明，去鐵胺可以抑制肝細胞脂質蓄積。

實施例2、動物試驗

一、分組處理

取16.7～21.3g、6周齡的雄性c57bl/6小鼠，適應性飼養(yǎng)2周，然后進行試驗，試驗分為連續(xù)進行的兩個階段。

第一階段如下：

將所述小鼠隨機分為二組，對照組(25只)和模型組(55只)；

對照組(ctr)：采用普通飼料飼喂18周；

模型組(hcd)：采用高膽固醇飼料飼喂18周。

第一階段的18周后(時間點1)，每組隨機取5只小鼠處死，采用實施例1的步驟二的方法進行相關檢測。剩余的小鼠進行第二階段。

第二階段如下：

剩余的20只對照組小鼠隨機分成兩組，空白對照組和藥物對照組，每組10只。

剩余的50只模型組小鼠隨機分成五組，模型組、藥物治療低劑量組、藥物治療高劑量組、改變食物治療方案組和改變食物配合藥物治療方案組，每組10只；

空白對照組(ctr)：采用普通飼料飼喂18周；

藥物對照組(ctr+l72)：采用普通飼料飼喂18周；每天注射甲磺酸去鐵胺溶液一次，單次注射劑量為“72mg甲磺酸去鐵胺/kg體重”；

模型組(hcd)：采用高膽固醇飼料飼喂18周；

藥物治療低劑量組(hcd+l36)：采用高膽固醇飼料飼喂18周；每天注射甲磺酸去鐵胺溶液一次，單次注射劑量為“36mg甲磺酸去鐵胺/kg體重”；

藥物治療高劑量組(hcd+l72)：采用高膽固醇飼料飼喂18周；每天注射甲磺酸去鐵胺溶液一次，單次注射劑量為“72mg甲磺酸去鐵胺/kg體重”；

改變食物治療方案組(chow)：采用普通飼料飼喂18周；

改變食物配合藥物治療方案組(chow+l72)：采用普通飼料飼喂18周；每天注射甲磺酸去鐵胺溶液一次，單次注射劑量為“72mg甲磺酸去鐵胺/kg體重”。

第二階段的9周后(時間點2)，每組隨機取5只小鼠處死，采用實施例1的步驟二的方法進行相關檢測。

第二階段的18周后(時間點3)，每組剩余的5只小鼠處死，采用實施例1的步驟二的方法進行相關檢測。

肝臟灌注后的照片見圖3的a、b和c。肝組織病理學分析(h&e染色)的照片見圖3的d、e和f。肝臟體重比的結果見圖4的a、b和c。血漿谷丙轉氨酶活性的結果見圖4的d、e和f。結果與實施例1的結果一致。通過對比低劑量組和高劑量組的差異，顯示了劑量效應關系。并且，去鐵胺的治療效果同已經驗證的改變飲食治療方案有高度的相似性趨勢。

實施例3、細胞實驗

hepg2細胞饑餓處理24h，然后分為三組，分別處理如下：

空白對照組：在含10g/100mlbsa的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h；

模型組：在含10g/100mlbsa和100μg/ml膽固醇的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h；

治療組：在含10g/100mlbsa、100μg/ml膽固醇和50μm甲磺酸去鐵胺的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。

完成上述分組處理后，吸棄培養(yǎng)上清，用pbs緩沖液沖洗細胞，然后加入4％pfa溶液并37℃固定10min，然后用60％異丙醇溶液浸洗30s，然后用油紅o工作液染色30min，然后加入60％異丙醇溶液沖洗，然后用pbs緩沖液沖洗3遍，然后在顯微鏡(nikoneclipseti)下觀察染色。照片見圖5。與空白對照組相比，模型組的脂質蓄積顯著增多。與模型組相比，治療組的脂質蓄積顯著變少。

完成上述分組處理后，提取總rna，以gapdh基因為內參基因，采用rt-pcr檢測srebp-1基因、fasn基因、scd5基因、scd1基因等脂肪酸合成基因以及tnfα基因、il-8基因、il-1β基因等細胞炎癥因子基因的表達水平。結果見圖6。

用于檢測gapdh基因的引物如下：

上游引物(序列1)：5’-accacagtccatgccatcac-3’；

下游引物(序列2)：5’-tccaccaccctgttgctgta-3’。

用于檢測srebp-1基因的引物如下：

上游引物：5’-ctggtctaccataagctgcac-3’；

下游引物：5’-gactggtcttcactctcaatg-3’。

用于檢測fasn基因的引物如下：

上游引物：5’-gtgccttccaactggacgct-3’；

下游引物：5’-tgcctccggctcctccgcaa-3’。

用于檢測scd5基因的引物如下：

上游引物：5’-tcgaaagctctgagggcggcggcggc-3’；

下游引物：5’-tctccccagatgtaccagggcacca-3’。

用于檢測scd1基因的引物如下：

上游引物：5’-catgctccaagagatctccagttc-3’；

下游引物：5’-ttgcgcacaagcagccaacccacgt-3’。

用于檢測tnfα基因的引物如下：

上游引物：5’-gaaagcatgatccgggacgtg-3’；

下游引物：5’-ctgatggtgtgggtgaggag-3’。

用于檢測il-8基因的引物如下：

上游引物：5’-aagaaaccaccggaaggaacc-3’；

下游引物：5’-gtgttggcgcagtgtggtc-3’。

用于檢測il-1β基因的引物如下：

上游引物：5’-agaagtacctgagctcgcca-3’；

下游引物：5’-caccacttgttgctccatatc-3’。

以上結果表明，去鐵胺可以有效地降低由于膽固醇處理所引起的脂肪酸合成相關基因(srebp-1基因、fasn基因、scd5基因和scd1基因)以及炎癥相關因子基因(tnfα基因、il-8基因和il-1β基因)的表達升高。

結果表明，去鐵胺確實具有抑制脂質合成和炎癥發(fā)生的作用。

序列表

<110>中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所

<120>去鐵胺在制備用于治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應用

<130>gncyx171064

<160>2

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