專利名稱：石榴花多酚在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種石榴花多酚在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高、生活方式的轉(zhuǎn)變以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，代謝性疾病的發(fā)病率逐年上升。其中以糖尿病和非酒精性脂肪肝較為常見。目前非酒精性脂肪肝(NAFLD)日益受到重視，但其發(fā)病機制仍不明了。1998年Day提出的“二次打擊”理論認(rèn)為各種誘因引起胰島素抵抗(IR)，即初次打擊。胰島素抵抗可促進外周脂解増加、高胰島素血癥，増加肝細(xì)胞脂肪堆積。同時增加肝細(xì)胞對損害因子的敏感性。二次打擊即氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化等因素進ー步損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生。肝臟是機體脂代謝的重要器官，游離脂肪酸(FFA)通過血液進入肝臟，之后經(jīng)過兩條途徑進行代謝，被氧化生成ATP和被酯化轉(zhuǎn)變成甘油三酯(TG)，生成的TG—部分儲存在肝細(xì)胞內(nèi)，另一部分形成極低密度脂蛋白(VLDL)。脂肪過量和脂肪組織功能障礙引起體內(nèi)FFA和TG過多，使得大量TG沉積在肝細(xì)胞中，從而形成NAFLD。此外，當(dāng)患有非酒精性脂肪肝時機體糖基化產(chǎn)物和糖氧化產(chǎn)物形成增加和抗氧化機制的減弱，活性氧簇(ROS)増加，自由基反應(yīng)明顯增強。過多的自由基會通過損傷胰島B細(xì)胞導(dǎo)致外周組織對胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低。丙ニ醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，反映脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的濃度，它對細(xì)胞及其成分具有毒性效應(yīng)。超氧化物歧化酶(SOD)屬于機體抗氧化酶系統(tǒng)，能持續(xù)清除R0S，防止生物膜脂質(zhì)過氧化損傷，其活性間接反映機體清除氧自由基的能力。資料顯示，非酒精性脂肪肝患者血清中ALT的水平與肝臟的IR相關(guān)，提示ALT的升高可以反映肝臟脂肪的變化。這種變化可先于糖尿病的發(fā)生，因此，對肝臟轉(zhuǎn)氨酶的檢測，尤其是重視ALT的變化，對于預(yù)測該類疾病的發(fā)生和發(fā)展有著重要的意義。此外轉(zhuǎn)氨酶水平的升高也提示患者的脂肪肝病變程度加重，有向脂肪肝性肝炎發(fā)展的趨勢，需積極的防治，阻止肝細(xì)胞進一歩受損。對氧磷酶(PON)是能夠水解有機磷酸鹽基質(zhì)對氧磷的ー種酶，它包括PONl、P0N2和P0N3。與肝臟疾病發(fā)生有關(guān)的PONl和P0N3主要在肝臟中合成，在腎和腦中也有表達。研究顯示PON有重要的抗氧化作用，在脂肪肝的發(fā)病機理中，病人由于氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化增加，導(dǎo)致肝功能損害，抑制了 PON的合成。而PON又與高密度脂蛋白(HDL)的生理作用密切相關(guān)，因此PON的含量也是檢測肝臟功能的重要指標(biāo)。非酒精性脂肪肝的患者多存在肝功能障礙，而臨床治療常用藥，大多在肝臟進行代謝，因此長期應(yīng)用可能會加重脂肪蓄積和肝功損害。鑒于長期服用化學(xué)藥物引起的諸多不良反應(yīng)，在植物藥中尋找既能降低血糖、血脂又能保護肝臟的藥物，具有積極的臨床意義。研究顯示，植物多酚在治療非酒精性脂肪肝方面具有療效顯著、副作用小的特點。實驗研究表明黒茶多酚提取物可抑制此類患者體內(nèi)胰脂酶活性，減少TG的吸收，減少患者進餐后血脂的增高；Kaleaa等發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓中的多酚類物質(zhì)能夠降低血清中低密度脂蛋白(LDL)和機體氧化應(yīng)激反應(yīng)。石槽科(Punicaceae)植物石槽(Punicagranatum L.)的花為中藥和維吾爾常用藥。研究發(fā)現(xiàn)，石榴花提取物在降糖的同時，對血脂也有調(diào)節(jié)作用。與對照組相比，石榴花提取物顯著減少ZDF大鼠心肌中甘油三酯和總膽固醇的含量，其機制為上調(diào)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) a 2mRNA水平。Li Y.等給予ZDF大鼠ロ服石榴花醇提物500mg *kg^6周后，肝TG和脂滴含量顯著減少。同時石榴花醇提物可通過改善次氮基三こ酸鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)保護肝臟。本課題組先前 研究發(fā)現(xiàn)，石榴花多酚能夠明顯降低高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)，増加組織對胰島素的敏感性，有效減輕IR程度。同時還可明顯降低糖尿病大鼠血清中的TG、LDL-C的含量。其中藥量為300mg -kg^1的效果尤為明顯。此結(jié)果提示石榴花多酚能對非酒精性脂肪肝具有一定的保護作用。本研究以高脂飼料聯(lián)合腹腔注射STZ的造模方法復(fù)制非酒精性脂肪肝的大鼠模型。在實驗過程中通過對大鼠血清和肝臟組織進行生化指標(biāo)的檢測、病理組織學(xué)的觀察，進一步確定脂肪肝的嚴(yán)重程度，探討建立動物模型的最佳方案。在此基礎(chǔ)上，觀察石榴花多酚對大鼠非酒精性脂肪肝的影響，探討石榴花多酚的作用機制。本發(fā)明與此前本課題組所作的石榴花多酚對糖尿病大鼠血糖和血脂的影響有明顯的區(qū)別。在前期的工作中本發(fā)明人研究提供了石榴花多酚對糖尿病大鼠具有良好的降糖調(diào)脂功效，鑒于此本發(fā)明人進ー步研究了石榴花多酚對非酒精性脂肪肝大鼠的治療作用，由于非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制與胰島素抵抗和高脂相關(guān)，因此動物造模也通常采用腹腔注射STZ伴高脂飼料喂養(yǎng)的方法，通過肝臟病理檢測確定模型是否成功。給予非酒精性脂肪肝大鼠石榴花多酚進行干預(yù)四周，檢測相應(yīng)指標(biāo)以判斷受試物的藥效，并進一歩分析其作用機制。結(jié)果顯示石榴花多酚對非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟具有良好的保護作用。其機制可能與石榴花多酚良好的抗氧化能力；對肝臟中PONl蛋白的合成影響；增加血清中高密度脂蛋白的合成等因素有夫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供ー種石榴花多酚在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的用途，經(jīng)過大量的實驗及肝臟的病理切片證明石榴花多酚對非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟具有良好的保護作用。其作用機制能通過降低大鼠血清FBG、Flns，緩解胰島素抵抗，延緩“ニ次打擊學(xué)說”中的第一次打擊，降低血清中TG、TC、LDL升高HDL含量；改善機體氧化應(yīng)激狀態(tài)；可顯著升高大鼠肝臟組織中PONl的表達等作用來緩解第二次打擊；從而起到防止肝臟進ー步發(fā)生變性、壞死及纖維化的作用。本發(fā)明所述的ー種石榴花多酚的用途，該石榴花多酚在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的用途。


圖I為本發(fā)明正常對照組大鼠肝臟組織HE染色切片(X400)圖；圖2為本發(fā)明模型組大鼠肝臟組織HE染色切片(X400)圖3為本發(fā)明ニ甲雙胍組大鼠肝臟組織HE染色切片(X400)圖；圖4為本發(fā)明PFP I組大鼠肝臟組織HE染色切片(X400)圖；圖5為本發(fā)明PFP II組大鼠肝臟組織HE染色切片(X400)圖；圖6為本發(fā)明PFP III組大鼠肝臟組織HE染色切片(X400)圖；圖7為本發(fā)明正常對照組肝臟組織PONl的表達圖；圖8為本發(fā)明模型組肝臟組織PONl的表達圖；圖9為本發(fā)明ニ甲雙胍組肝臟組織PONl的表達圖；圖10為本發(fā)明PFP I組肝臟組織PONl的表達圖；圖11為本發(fā)明PFP II組肝臟組織PONl的表達圖；圖12為本發(fā)明PFP III組肝臟組織PONl的表達圖。
具體實施例方式實施例本發(fā)明所述的石榴花多酚的用途，該石榴花多酚在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的用途，具體步驟為材料與方法實驗材料 受試藥物石榴花多酚，由中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所提供，分裝后，于溫度-20°C避光保存?zhèn)溆?，用時以蒸餾水配制，現(xiàn)配先用。實驗動物清潔級健康雄性SD大鼠75只，體重140_160g，均由新疆大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK (新)2009-0001。實驗方法動物模型制備取75只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后，根據(jù)體重隨機取8只作為正常對照組，其余大鼠按照第一部分的造模方法，先以高脂飼料喂養(yǎng)10周，第8周腹腔注射STZ 30mg kg—1 ；動物分組和給藥方法將非酒精性脂肪肝大鼠隨機分為5組模型組給予Iml IOOg-1蒸餾水灌胃；ニ甲雙胍組給予ニ甲雙胍IOOmg kg-1 ；PFP I組給予石榴花多酚75mg kg—1灌胃；PFP II組給予石榴花多酚150mg kg—1灌胃；PFP III組給予石榴花多酚300mg kg—1灌胃；各組大鼠每日灌胃一次，共4周；標(biāo)本留取于給藥第4周末，禁食12小時，以麻醉藥(安定氯胺酮阿托品=1:1: 1)0. 2ml IOOg-1體重的劑量進行腹腔麻酔，腹主動脈取血，分離血清，留作血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、空腹血清(Flns)測定；切取肝臟最大葉距離邊緣Icm處肝臟組織，置于4%多聚甲醛固定液留做病理學(xué)觀察，剰余肝臟標(biāo)本保存于溫度-80°C冰箱用于制備組織勻漿、提取RNA等；觀察指標(biāo)與方法一般情況觀察大鼠一般情況精神狀態(tài)、飲食及活動情況、毛色、飲水量、尿量
坐寸o生化指標(biāo)測定用BECKMAN CX7 全自動生化分析儀檢測血清 TG、TC、HDL-C, LDL-C, ALT、AST。血清胰島素水平測定按照碘胰島素放射免疫分析藥盒說明書的步驟，測定大鼠 血清中Flns的含量。組織勻漿中總蛋白含量測定取制備完成的肝組織勻漿，用生理鹽水(0. 9% )按I 9稀釋，按考馬思亮蘭蛋白測定試劑盒說明書的步驟進行定各組織勻漿中總蛋白含量。各組大鼠血清和肝組織中SOD和MDA的測定按照SOD和MDA試劑盒說明書的步驟操作。肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察采血后，摘取大鼠肝臟，在肝臟最大葉距邊緣0. 5cm處取
0.5X0. 5X0. 5cm3大小的肝組織浸泡于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后以4 y m厚度切片，行蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察。結(jié)果分析根據(jù)肝臟外觀及HE染色，所有切片均由有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師盲法閱片作出診斷，每張切片觀察5個X250視野，對肝脂肪變性程度分級。PONl蛋白表達的測定采用免疫組化PV(Power Vision)法測定。統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17. 0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量資料用S表示，采用單因素方差分析，以P < 0. 05，P < 0. 01為統(tǒng)計學(xué)上差異顯著。結(jié)果動物分組及一般情況觀察將造模成功的56只大鼠進一步分為5組模型組、ニ甲雙胍組、石榴花多酚低、中、高組，均以高脂飼料喂養(yǎng)4周。正常對照組和模型組予以等體積量的蒸餾水灌胃4周，ニ甲雙胍組、石榴花多酚低、中、高劑量組分別以ニ甲雙胍IOOmg kg'石槽花多酹 75、150、300mg kg-1 灌胃 4 周；灌胃期間各組大鼠一般狀態(tài)尚好，與正常對照組相比，模型組大鼠進食、飲水量和尿量偏多，精神差，毛色枯黃，行動緩慢，ニ甲雙胍和石榴花多酚干預(yù)組大鼠狀態(tài)介于正常對照組和模型組之間。各組大鼠一般資料的比較干預(yù)4周末，模型組大鼠體重顯著低于正常對照組(P
<0. 01)。與模型組相比，ニ甲雙胍和石榴花多酚干預(yù)后，大鼠體重較模型組無顯著改變(P
<0. 01)。見表 I :表I各組大鼠體重的變化(mmol じ1，n = 8)
權(quán)利要求
1. ー種石榴花多酚的用途，其特征在于該石榴花多酚在制備治療非酒精性脂肪肝的藥 物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種石榴花多酚在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的用途，經(jīng)過大量的實驗證明石榴花多酚可明顯降低大鼠血清Flns、IRI，延緩“二次打擊學(xué)說”中的第一次打擊，起到防止肝臟進一步發(fā)生變性、壞死及纖維化的作用，石榴花多酚可顯著升高大鼠肝臟組織中PON1的表達，升高HDL含量并改善大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
文檔編號A61K133/00GK102641312SQ20121015782
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者何雯, 帕爾哈提·克熱木, 曲姍姍, 程路峰, 閆冬, 阿依仙木·加帕爾, 阿吉艾克拜爾·艾薩, 馬曉玲, 魏媛媛 申請人:新疆醫(yī)科大學(xué)