本發(fā)明總體涉及新型共價網(wǎng)絡(luò)三元無機(jī)金屬硫化物，該新型共價網(wǎng)絡(luò)三元無機(jī)金屬硫化物包含二價金屬如mg、ca、mn、fe或zn和六價金屬如鉬或鎢，以及硫，其對于抑制癌癥和其它疾病的血管生成應(yīng)用可用于降低細(xì)胞內(nèi)銅濃度。
背景技術(shù)：
：血管生成(angiogenesis)，是新血管生成的過程，也稱為新血管形成(neovascularization)，是新血管形成的過程。在健康的成人中，該過程由各種血管生成因子和抑制劑嚴(yán)格調(diào)控和協(xié)調(diào)以達(dá)到平衡。相反，血管生成在腫瘤發(fā)生中為速率限制事件(rate-limitingevent)，因而是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。這個概念在過去的三十年中已激發(fā)研究人員尋找用于癌癥治療的血管生成抑制劑。目前，在美國有超過50種用于癌癥治療的抗血管生成藥物，它們或在市場上銷售或處于臨床實(shí)驗(yàn)的各個階段。所有的這些藥物曾經(jīng)被認(rèn)為在癌癥治療方面非常有前景，但并沒有達(dá)成這種高預(yù)期。這些血管生成抑制劑的主要問題是其療效有限，在不同種類的腫瘤中具有選擇性但不確定的效果，并且它們產(chǎn)生固有的或獲得性耐藥性。關(guān)于采用現(xiàn)有抑制劑的癌癥抗血管生成治療是否會引發(fā)更具侵襲性和轉(zhuǎn)移性的腫瘤在癌癥研究社區(qū)中一直在爭辯。這是因?yàn)槟[瘤血管生成是涉及若干平行信號通路(signalingpathway)的復(fù)雜和多步驟過程。越來越多的證據(jù)顯示，當(dāng)一個血管生成信號通路被封堵時，腫瘤可能利用不同的血管生成促進(jìn)子(promoter)引發(fā)其它的信號通路來使血管生長。用來解決腫瘤血管生成的復(fù)雜性以及基于對其它信號通路的更好理解來開發(fā)新一代藥物的研究將會繼續(xù)。同時，存在可能從更多創(chuàng)新路徑獲益的在目前的抗血管生成療法中尚未能應(yīng)對的醫(yī)療挑戰(zhàn)。本發(fā)明旨在通過在腫瘤生長中對銅離子進(jìn)行靶向而不是對多個細(xì)胞信號傳導(dǎo)生物分子進(jìn)行靶向，作為抗血管生成癌癥治療的新策略，從不同的角度來解決問題。1980年，在體外，mcauslan和reilly發(fā)現(xiàn)了銅鹽是會促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的腫瘤提取物中最簡單的血管生成成分。十多年后，在體外，銅被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。當(dāng)銅丸被植入血管生成兔角膜模型的基質(zhì)中時，其將引起基于劑量的新血管生成。最近，研究人員已發(fā)現(xiàn)銅是超過20幾種血管生成中涉及的主要血管生成促進(jìn)子或蛋白質(zhì)的共同輔助因子，這些血管生成促進(jìn)子或蛋白質(zhì)包括：1)血管生成素(angiogenin)；2)血管營養(yǎng)素(angiotropin)；3)血漿銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin)；4)膠原酶；5)fgf-1(酸性)；6)fgf-2(堿性)；7)fgf受體-1；8)纖連蛋白；9)神經(jīng)節(jié)甘脂；10)肝素；11)甘氨酸-組氨酸-賴氨酸(gly-his-lys)；12)il-1；13)il-6；14)il-8；15)核因子kb(nfkb)；16)前列腺素；17)e-1；18)突觸結(jié)合蛋白(synaptotagamin)；19)sparc；20)轉(zhuǎn)化生長因子β；21)腫瘤壞死因子α；以及22)血管內(nèi)皮生長因子(vegf)。在這些促進(jìn)子分子被激活后，在遷移、內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和分化以及基質(zhì)蛋白改形至微細(xì)管的管狀結(jié)構(gòu)的每一步，對銅都有特定要求。因此，在腫瘤和血管內(nèi)皮細(xì)胞中以及在腫瘤基質(zhì)微環(huán)境(stromalmicroenvironment，smt)中銅的消耗(depletion)將使不止一個血管生成信號通路沉寂，從而達(dá)到一石多鳥的目的。brem和同事將腫瘤移植到大鼠和兔的腦內(nèi)并發(fā)現(xiàn)輕微d-青霉胺(d-penicillamine)引起的銅缺乏極大降低腫瘤的生長以及它們的侵襲性。但是，當(dāng)隨后將d-青霉胺治療延伸到有腦腫瘤的病人時，沒有發(fā)現(xiàn)存活的改善，部分原因是作為小分子，d-青霉胺不能穿過血腦屏障(bloodbrainbarrier，bbb)以及其與銅離子較低的結(jié)合能力的事實(shí)。d-青霉胺，即(2s)-2-氨基-3-甲基-3-磺?；?丁酸((2s)-2-amino-3-methyl-3-sulfanyl-butanoicacid)(圖式1)是一種fda批準(zhǔn)的用來降低在患有威爾森氏病(wd)的患者的肝臟內(nèi)過量的銅積聚的藥物。圖式1臨床和實(shí)驗(yàn)藥抗銅藥的分子結(jié)構(gòu)該病也被稱為肝豆?fàn)詈俗冃?，其是一種隱性遺傳病，特征是在肝臟和其它重要器官中的過量銅積聚。由于wd是使人衰弱的疾病，并且如果不治療，它可導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾、需要肝臟移植以及死亡。在過去70年，在開發(fā)用來治療wd的螯合療法形式的臨床藥物方面投入了巨大的研究努力。在1951年，英國抗路易士藥劑(britishanti-lewisite，bal)被引入作為用于wd的第一個臨床藥物。該螯合劑在二戰(zhàn)期間最初被開發(fā)作為化學(xué)戰(zhàn)劑路易士藥劑的解毒藥，而后來被用于由砷、金、銻、鉛或汞引起的重金屬中毒的解毒(參見圖式1)。由于bal、d-pen的一些嚴(yán)重的副作用，包括中毒性腎損害和高血壓，在1956年引入了一種青霉素的代謝物作為用于wd的更好的臨床用藥。在1982年，引入了一種新的用于wd的臨床用藥三乙烯四胺(triethylenetetraamine)(曲恩汀，參見圖式1)，其是一種相比d-pen效果較差的銅螯合劑，主要用于對d-pen表現(xiàn)出不能忍受的患者。目前，在美國，三乙烯四胺的臨床使用受到限制，因?yàn)榇朔N應(yīng)用在歐洲尚未被批準(zhǔn)。在1997年，美國食品藥物管理局(fda)批準(zhǔn)了使用醋酸鋅作為用于wd的臨床用藥。不像用于wd的其它三種臨床用藥，該化合物不是螯合劑，但來自該藥物的鋅離子可刺激腸細(xì)胞中金屬硫蛋白(metallothionein)的產(chǎn)生，金屬硫蛋白繼而結(jié)合銅離子以抑制其吸收和輸送至肝臟。已經(jīng)證明醋酸鋅針對wd僅作為維持治療有效。最近，四硫鉬酸鹽(tetrathiomolybdate，ttm，參見圖示1)被引入作為針對wd的試驗(yàn)藥。研究已經(jīng)證明ttm在消化道中與銅和食物蛋白形成三元復(fù)合物的非生物可吸收形式，以阻止自膳食的銅腸道吸收，因而在體內(nèi)創(chuàng)建陰性銅平衡(negativecopperbalance)。在所有這些用于wd的藥物中，d-pen具有最高的療效，因此目前是全世界針對wd的最廣泛使用的藥物。然而，d-pen的副作用很多，并且其中的幾種是嚴(yán)重的。它們包括骨髓和免疫抑制、皮疹、口腔潰瘍、惡心以及多種神經(jīng)功能的退化。后面的副作用據(jù)信由d-pen調(diào)動儲存在身體組織里的銅離子并使它們重新進(jìn)入循環(huán)從而提高腦中的銅濃度的能力引起。據(jù)估計大約一半用d-pen治療的患者將表現(xiàn)出神經(jīng)退化，并且由于使用d-pen，四分之一的此類患者將遭受不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)損害。所有的這些副作用都可歸因于該藥是系統(tǒng)性地遞送而沒有器官特異性的事實(shí)，因而由于該藥的系統(tǒng)毒性引起多種副作用。在另一方面，已知ttm易于水解，在胃的酸性條件下經(jīng)由反應(yīng)mos42-+4h2o→moo42-+4h2s釋放硫化氫(h2s)。雖然由食物的厭氧消化在人的消化道內(nèi)時常產(chǎn)生少量的h2s并可由若干酶解毒，但該氣體被認(rèn)為比氰化氫(hcn)對神經(jīng)和循環(huán)系統(tǒng)的毒性更大。該事實(shí)表示ttm不適于作為藥物靜脈遞送。而且，ttm的制造、儲存和臨床使用將是一個安全問題。應(yīng)當(dāng)指出的是，所有這些抗銅藥物都基于小分子或離子(即ttm)。雖然小分子或離子更可能是可水溶的，以通過口服或靜脈施用進(jìn)行藥物遞送，但它們都有一個共同的問題，即由此類小分子或離子形成的銅復(fù)合物是不穩(wěn)定的，并且在生物體液和各種固體組織之間可被再分割，使從體內(nèi)清除螯合銅又慢又不完全。已知采用d-pen治療wd常?？烧{(diào)動儲存在身體組織內(nèi)的銅離子并將它們重新投入循環(huán)，從而增加腦中的銅濃度，導(dǎo)致多種神經(jīng)退化性疾病。而且，這些基于小分子的藥物欠缺穿透細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)銅離子進(jìn)行靶向用于消毒的能力或合適機(jī)制。它們通常用于降低體內(nèi)銅離子的系統(tǒng)濃度，從而使組織或器官特異性的銅消耗成為不可能。總之，消耗系統(tǒng)銅離子而非特定組織或器官的銅離子使在患者中引起銅缺乏相關(guān)副作用的趨勢增加。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明總體涉及新型共價網(wǎng)絡(luò)三元無機(jī)金屬硫化物，該新型共價網(wǎng)絡(luò)三元無機(jī)金屬硫化物包含二價金屬如mg、ca、mn、fe或zn和六價金屬如鉬或鎢，以及硫，其對于抑制癌癥和其它疾病的血管生成應(yīng)用可用于降低細(xì)胞內(nèi)銅濃度。共價網(wǎng)絡(luò)化合物或共價網(wǎng)絡(luò)固形物指這樣的化合物，其中在延伸貫穿整個物質(zhì)的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)中原子通過共價鍵結(jié)合。在共價鍵網(wǎng)絡(luò)固形物中，沒有個體分子，并且整個結(jié)構(gòu)可被認(rèn)為是一大分子。另外，它們不是芯殼納米顆粒。通常的共價網(wǎng)絡(luò)化合物在水中或任何有機(jī)溶劑中是不溶的，它們在溶液中也不離解釋放可溶陽離子或陰離子。共價網(wǎng)絡(luò)化合物的例子包括具有連續(xù)碳原子網(wǎng)絡(luò)的金剛石，以及具有sio2單元的連續(xù)三維網(wǎng)絡(luò)的二氧化硅或石英。具有共價網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的二元無機(jī)金屬硫化合物的例子包括在自然界中發(fā)現(xiàn)作為礦物質(zhì)閃鋅礦或纖維鋅礦的硫化鋅、在自然界中發(fā)現(xiàn)作為礦物質(zhì)黃鐵礦的二硫化鐵、在自然界中發(fā)現(xiàn)作為輝鉬礦并在工業(yè)中廣泛用作固體潤滑劑的二硫化鉬，以及在自然界中發(fā)現(xiàn)作為tustenite并在石油工業(yè)中廣泛用作氫脫硫化催化劑的二硫化鎢。采用三元無機(jī)金屬硫化物m1m2s4(m1獨(dú)立地為ca、mg、mn、fe或zn；m2為mo或w)作為對細(xì)胞內(nèi)銅離子進(jìn)行靶向以治療轉(zhuǎn)移癌(如膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌和子宮癌)的驅(qū)銅藥物(anti-copperdrugs)的最大的優(yōu)點(diǎn)是通過二價金屬離子(即mg2+、ca2+、mn2+、fe2+或zn2+)與銅離子之間的離子交換反應(yīng)，形成另一種三元金屬硫化物cu2mos4，并釋放生物上必須的二價金屬離子mg2+、ca2+、mn2+、fe2+或zn2+，從而實(shí)現(xiàn)在向細(xì)胞中輸送生物上必須的二價金屬離子的同時降低細(xì)胞內(nèi)銅濃度的最終結(jié)果。三元金屬硫化物cu2mos4也是一種其中的銅離子被完全鎖定在其晶格位置的共價網(wǎng)絡(luò)化合物。該特征與上面提到的采用可溶小分子或離子來與銅離子螯合(其導(dǎo)致形成通常不穩(wěn)定且可在生物體液和各種固體組織之間被重新分隔的銅絡(luò)合物，使絡(luò)合銅從體內(nèi)的清除慢且不完全)形成鮮明對比。本發(fā)明的另一個目的是提供適用于細(xì)胞內(nèi)消耗銅以抑制血管生成的新型納米顆粒。由于這些三元金屬硫化物在水中是不溶的，帶有合適表面涂層的此類化合物的納米顆粒形式將為這些物質(zhì)賦予水分散性，因而使得它們經(jīng)由口服或靜脈注射能夠在患者體內(nèi)遞送。納米顆粒包含式m1mos4或m1ws4，其中m1獨(dú)立地為mg、ca、mn、fe或zn；并且所述納米顆粒獨(dú)立地具有約4納米至約900納米的直徑。一種制備用于治療癌癥和其它疾病的血管生成抑制劑的方法，包括向動物施用化學(xué)式為m1mos4的二價金屬m1的四硫鉬酸鹽(tetrathiomolybdate)或化學(xué)式為m1ws4的二價金屬m1的四硫鎢酸鹽(tetrathiotungstate)，或兩者，其中m1獨(dú)立地為mg、ca、mn、fe或zn。一種減少具有癌細(xì)胞和/或人血管內(nèi)皮細(xì)胞的人的細(xì)胞內(nèi)銅濃度的方法，包括以下步驟：形成水分散性m1mos4或m1ws4納米顆粒的共價網(wǎng)絡(luò)，其中m1獨(dú)立地為mg、ca、mn、fe或zn；以及向所述人體施用有效量的所述m1mos4或m1ws4納米顆粒，所述納米顆粒能夠引起離子交換反應(yīng)，從而所述銅被并入所述納米顆粒，進(jìn)而從所述癌細(xì)胞和/或人血管內(nèi)皮細(xì)胞消耗所述銅離子并抑制血管生成。一種減少具有癌細(xì)胞和/或人血管內(nèi)皮細(xì)胞的人的細(xì)胞內(nèi)銅濃度的方法，包括以下步驟：形成水分散性m1mos4或m1ws4納米顆粒的共價網(wǎng)絡(luò)，其中m1獨(dú)立地為mg、ca、mn、fe或zn，或它們的任何組合；以及施用有效量的所述m1mos4或m1ws4納米顆粒，以實(shí)現(xiàn)所述m1mos4或m1ws4納米顆粒的細(xì)胞攝取進(jìn)入所述癌細(xì)胞和/或人血管內(nèi)皮細(xì)胞，并從所述癌細(xì)胞和/或人血管內(nèi)皮細(xì)胞放出銅。一種減少人體內(nèi)癌細(xì)胞和/或人血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，包括以下步驟：形成水分散性m1mos4或m1ws4納米顆粒的延伸共價網(wǎng)絡(luò)，其中m1獨(dú)立地為mg、ca、mn、fe或zn，或它們的任何組合；以及用所述m1mos4或m1ws4化合物處理所述癌細(xì)胞和/或人血管內(nèi)皮細(xì)胞并減少所述癌細(xì)胞和/或人血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。一種制備m1m2s4納米顆粒的方法，包括以下步驟：將在酰胺溶液中的堿性硫化鉬或堿性硫化鎢單獨(dú)地與在包含巰基烷基酸和堿性氫氧化物的水溶液中的鎂鹽、鈣鹽、錳鹽或鐵鹽反應(yīng)，并生成所述m1m2s4化合物，其中m1獨(dú)立地為mg、ca、mn或fe，且m2為mo或w。附圖說明圖1示出pvp-涂覆的znmos4納米顆粒(nps)的透射電鏡(tem)圖像；圖2示出染料標(biāo)記的znmos4納米顆粒處理的huvec細(xì)胞的共焦熒光(右)和明場(左)圖像；圖3示出pvp-涂覆的znmos4納米顆粒處理的huvec細(xì)胞的細(xì)胞存活率曲線；圖4示出采用znmos4納米顆粒抑制fgf-2誘導(dǎo)的huvec細(xì)胞形成管，其中上面的板(panel)：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中用fgf-2處理的huvec細(xì)胞的明場圖像和鈣黃綠素染色的圖像，顯示出形成管；下面的板：對應(yīng)的圖像，示出納米顆粒的抑制效果。圖5示出了znmos4納米顆粒在huvec中對vegf誘導(dǎo)的管形成的抑制效果；圖6示出了znmos4納米顆粒抑制了vegf和fgf-2誘導(dǎo)的huvec細(xì)胞；圖7示出了znmos4納米顆粒降低了huvec遷移能力(migrationpotential)；圖8示出了znmos4納米顆粒對huvec內(nèi)皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞是非細(xì)胞毒性的；圖9示出了znmos4納米顆粒下調(diào)了vegf在pc3前列腺癌細(xì)胞中的mrna和蛋白質(zhì)水平表達(dá)；以及圖10示出了znmos4納米顆粒降低了vegf表達(dá)，而不影響pc3異種移植物的腫瘤生長。具體實(shí)施方式本發(fā)明的納米顆粒的制備可按下述方式進(jìn)行。本發(fā)明的一個主要目的是提供適用于細(xì)胞內(nèi)消耗銅以抑制血管生成的新型納米顆粒。通常的制備可按下述進(jìn)行：將約0.1ml至約300ml、理想地約1ml至約100ml、優(yōu)選地約25ml的具有1至約50個總碳原子、理想地1至約12個碳原子的巰基烷基酸(mercaptoalkylacid)，優(yōu)選3-巰基丙酸(3-mercaptopropionic)加入到約1ml至約200ml、理想地約2ml至約100ml、優(yōu)選地10ml的約0.01n至約18n、理想地0.1n至約10n、優(yōu)選地1n的nh4oh溶液中。其它適用的氫氧化物包括naoh、koh、ca(oh)2或na2co3。然后將有效量的m1鹽加入水中。適用的m1鹽包括乙酸鋅、氯化鋅、硫酸鋅、高氯酸鋅、硝酸鋅，以及非鋅鹽例如乙酸鎂、氯化鎂、硫酸鎂、高氯酸鎂、硝酸鎂；乙酸鈣、氯化鈣、硫酸鈣、高氯酸鈣、硝酸鈣；乙酸錳、氯化錳、硫酸錳、高氯酸錳、硝酸錳；乙酸亞鐵、氯化亞鐵、硫酸亞鐵、高氯酸亞鐵、硝酸亞鐵；或它們的任意組合。m1鹽適用的量的范圍為約1mg至約250mg，理想地約100mg至約200mg，優(yōu)選地約110mg至約150mg。因此，約130mg的zn(o2cch3)2(h2o)2被加入到約0.1ml至約300ml、理想地約1ml至約100ml、優(yōu)選地6ml的水逐滴加入上述混合物中。然后，將約1.0mg至約400mg，理想地約10mg至約300mg，優(yōu)選地約130mg的堿性鉬硫化物(nh4)2mos4或(nh4)2ws4加入到約0.1ml至約500ml、理想地約1ml至約100ml、優(yōu)選地約28ml的甲酰胺和水的混合物中(體積比為約0.1至約100，理想地約1至約20，優(yōu)選地從1：14)。所述硫化物與水和甲酰胺的溶液在強(qiáng)烈攪拌下逐滴加入上述混合物，導(dǎo)致顏色變?yōu)橥咙S色。最后，將約1g至約10g、理想地約2g至約6g、優(yōu)選地3.00g的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)或分子量為大約8000的其它相當(dāng)?shù)姆稚⑿跃酆衔锛尤氲椒磻?yīng)混合物中，并在室溫下連續(xù)攪拌約0.1小時至約72小時，理想地約1至約24小時，優(yōu)選地攪拌6小時。然后，將反應(yīng)混合物用分子量為約800至約20000，理想地約1200至約12000，優(yōu)選地約3000的細(xì)胞膜在蒸餾水中透析，并且凍干以提供淺棕色粉末。在一種類似的方式中，其它血管生成抑制無機(jī)硫化物基化合物可采用鉬或鎢與各種所述的鹽如鎂、鈣、錳或鐵(代替鋅)。即，采用基本上相同的所述加工步驟、各種化合物彼此之間的相似比將獲得新的、迄今為止未曾制取過的m1m2s4化合物，其中m1為mg、ca、mn、fe，且m2為mo或w。因而，在本說明書的任何其它部分，當(dāng)使用zn時，包含ca、mg、mn或fe的化合物可進(jìn)行替代并使用。本發(fā)明的m1m2s4納米顆粒的尺寸通常的范圍為約4至約900納米，理想地約10至約300納米，且優(yōu)選地為約15至約200納米。本發(fā)明的m1m2s4納米顆粒理想地被封端或包含覆蓋劑(即封端劑)，諸如生物相容聚合物，或水溶性聚合物，或它們的任意組合。生物相容性聚合物的例子包括右旋糖酐、聚乙二醇以及其它葡萄糖的聚合物。水溶性聚合物的例子包括聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇等等。優(yōu)選的聚合物是多元醇(n-乙烯吡咯烷酮)(polyol(n-vinylpyrrolidone))。為了評估包括mgmos4、mgws4,、camos4、caws4、mnmos4、mnws4、femos4以及fews4的不同金屬三元硫化物m1m2s4在水溶液中對cu2+離子的選擇性，首選將100mg的上述化合物的樣品研磨為細(xì)粉末，并密封在透析袋中，然后將透析袋浸在含50ppm水平的cu2+離子的溶液中。在24小時的溫育時間后，取出一份溶液，用2％的hno3稀釋，并用原子吸收光譜法(atomicadsorptionspectrometry)進(jìn)行分析，以確定銅金屬離子的濃度。移除前和移除后銅金屬離子的濃度的差別以銅金屬離子的移除百分比表示。結(jié)果在表1中給出。表1.各種m1mos4和m1ws4(m1＝mg、ca、mn、fe；m2＝mo或w)銅金屬離子的移除百分比化合物cu移除百分比mgmos433mgws430camos431caws430mnmos436mnws432femos447fews449上述銅離子的移除百分比通常范圍為約30％至約50％的銅離子移除。這些值被認(rèn)為非常好，因?yàn)榇罅康你~離子被移除，這與從人體移除相關(guān)。即，它們移除有害的、過量的銅。更高的移除量是不期望的，因?yàn)殂~對生存是必須的，而高移除量可使人受到傷害，甚至可能導(dǎo)致死亡。本發(fā)明的m1mos4或m1ws4銅消耗化合物通?？赏ㄟ^常規(guī)的方式加入到人體中。因此，此類物質(zhì)可以如包含在水中的方式口服加入。作為另外一種選擇，它們可被靜脈注射到例如血管中，或者注射到肌肉中。一旦已從癌細(xì)胞和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞提取了人體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)銅濃度，它們將以自然的方式排出，如通過排尿或排便排出。生物測定結(jié)果所述反應(yīng)混合物采用細(xì)胞膜袋在蒸餾水中進(jìn)行透析(mwco＝3000)，并凍干以提供淡褐色粉末。pvp涂覆的納米顆粒的透射電鏡(transmissionelectronicmicroscopy，tem)圖像顯示出具有窄尺寸分布(約8±2nm(圖1))的球形納米顆粒。在人體血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)中的pvp涂覆的znmos4的細(xì)胞攝入采用共焦熒光顯微技術(shù)進(jìn)行了確認(rèn)。在與細(xì)胞溫育之前，首先將納米顆粒與熒光染料羧基熒光素進(jìn)行綴合。用所述染料標(biāo)記的納米顆粒處理過的活huvec細(xì)胞的熒光圖像在細(xì)胞的細(xì)胞核周圍區(qū)域顯示出強(qiáng)的熒光信號，表明在細(xì)胞質(zhì)中納米顆粒的非靶分布，對該區(qū)域中的任何小細(xì)胞器不存在特異性結(jié)合。該觀察結(jié)果提示出這些納米顆粒的細(xì)胞攝入是通過內(nèi)吞作用進(jìn)行的(圖2)。實(shí)施例1采用mtt方法進(jìn)行細(xì)胞存活測定。huvec細(xì)胞接種于96孔板中，密度為每孔1×104個細(xì)胞，孔中有包含10％fbs(胎牛血清(fatalbovineserum))和1％青霉素-鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)生長介質(zhì)-2(ebm-2)，在37℃、5％co2和95％空氣的氣氛中溫育5小時以附接至表面。然后，每個孔中的細(xì)胞用包含各種濃度的納米顆粒的100μl新鮮介質(zhì)溫育24小時和48小時。對照孔包含相同的介質(zhì)但沒有納米顆粒。每種濃度重復(fù)三次進(jìn)行測試。在上述溫育期結(jié)束時，將10μl的5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(mtt))加入至每個孔中并另外溫育3小時。然后，將100μl的清潔劑加入至每個孔中在37℃繼續(xù)溫育另外4小時。最后采用bioradelisa酶標(biāo)儀在570nm確定吸光度。測定結(jié)果顯示為活細(xì)胞百分比。存活百分比(viabilitypercentage)由經(jīng)受處理的細(xì)胞的吸光度與未處理控制樣的吸光度之比確定。結(jié)果表明在采用50μm納米顆粒溫育48小時后，細(xì)胞存活率保持在高位(>79％)(圖3)。通過znmos4納米顆粒抑制血管生成由采用血管生成的體外模型得以證明。具體地，由培養(yǎng)在基膜(basementmembrane)提取物上的huvec導(dǎo)管形成的誘導(dǎo)被用作該模型。在由纖維母細(xì)胞生長因子2(fgf2)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vegf)處理誘導(dǎo)后，huvec細(xì)胞的長出和分枝在存在或不存在znmos4納米顆粒的情況下進(jìn)行了測量。結(jié)果清楚地表明銅消耗用znmos4納米顆粒壓制fgf2誘導(dǎo)管形成以及由huvec細(xì)胞的分枝(圖4)。實(shí)施例2m1mos4和m1m2s4(m1獨(dú)立地為mg、ca、mn或fe；m2為mo或w)化合物在體外血管生成模型中阻止內(nèi)皮細(xì)胞管形成。所有的這些化合物都能通過下面的反應(yīng)經(jīng)由與三元化合物里的二價離子的離子交換降低在該模型研究中采用的內(nèi)皮細(xì)胞中的銅濃度以及培養(yǎng)基中的銅濃度：cun+(n＝1或2)+m1m2s4→cum2s4+m12+。由于銅在內(nèi)皮細(xì)胞管形成過程中是許多血管生成因子(包括vegf、bfgf、血管生成素)所需的輔助因子，因此血管生成被抑制。其它的測試進(jìn)行如下：管形成實(shí)驗(yàn)(tubeformationassay)是一種常用來測定內(nèi)皮細(xì)胞形成“管”(即，類似于血管壁的三維結(jié)構(gòu))能力的體外血管生成模型。管形成實(shí)驗(yàn)在采用來自馬里蘭州蓋士堡艾美捷公司(trevigen,gaithersburg,md)的體外血管生成實(shí)驗(yàn)盒的96孔板形式中進(jìn)行。在管形成實(shí)驗(yàn)前，huvec細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的egm-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中受餓過夜。為了準(zhǔn)備試驗(yàn)用腔室，基膜提取物(bme)溶液放在冰箱中過夜在2-4℃的冰水浴(ice-waterbath)中變暖，然后將50μl的bme溶液分份到96孔板的每一個孔中并在37℃溫育一小時以進(jìn)行凝膠。收集細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)，并制備1×106細(xì)胞/ml的單細(xì)胞懸液。在存在或不存在血管生成誘導(dǎo)劑vegf(50ng/ml)或fgf2(50ng/ml)以及m1m2s4或sulfophorane(5μm)納米顆粒抑制劑的情況下在ebm基礎(chǔ)培養(yǎng)基中稀釋上述細(xì)胞。在不妨礙凝膠的bme的情況下以1×104個細(xì)胞/每100μl的濃度將細(xì)胞加入到每個孔中，并在37℃于co2溫育器中溫育16小時。在37℃將huvec細(xì)胞用鈣黃綠素am(2μm)溫育30分鐘以對活細(xì)胞進(jìn)行染色，用于成像。采用200倍的總放大倍數(shù)的熒光顯微鏡(485nm激發(fā)/520nm發(fā)射)使管形成可視化。對隨機(jī)選擇的六個視場中的每一個的分枝點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，并對每種情況進(jìn)行平均。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。統(tǒng)計顯著性采用學(xué)生t-實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。由于管形成實(shí)驗(yàn)是采用huvec細(xì)胞在vegf處理下內(nèi)皮細(xì)胞形成類似于人血管的三維結(jié)構(gòu)的能力的測定，因此證明了在三元金屬硫化物m1m2s4中與mo或w結(jié)合的包括mg、ca、mn、fe和zn的所有二價金屬在上述生物實(shí)驗(yàn)中在抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成管方面有效。例如，采用znmos4納米顆粒的更多抑制效應(yīng)的定性測定表明以下結(jié)果：相比于單獨(dú)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，vegf(50ng/ml)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞管形成和分枝點(diǎn)的顯著增加(圖5a和圖5b)。但是，相比之下，當(dāng)huvec細(xì)胞用vegf和高劑量(50ng/ml)或低劑量(10ng/ml)的znmos4納米顆粒處理時，在兩種劑量下都具有對管形成的抑制(圖5c和5d)以及分枝點(diǎn)的減少(圖5f)。類似地，sulfophorane(一種已知的血管形成抑制劑)也阻止管形成，并在我們的試驗(yàn)中用作陰性對照(圖5e)。管形成被定量化并表達(dá)為用znmos4納米顆粒高劑量處理的圖5f所示的每個視場分枝點(diǎn)的平均數(shù)。如圖5所示，融合性huvec在ebm-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中過夜，沒有成長因子。收獲huvec細(xì)胞、計數(shù)并在存在(板b-e)或不存在(板a)vegf(50ng/ml)以及50ng/ml的znmos4納米顆粒(板c)和10ng/ml的znmos4納米顆粒(板d)的情況下在egm-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中稀釋。所述細(xì)胞在96孔板中接種在膠凝的bme上，并在37℃于5％co2溫育器中溫育24小時。板e示出用血管生成抑制劑sulfophorane(5μm)處理的vegf誘導(dǎo)的細(xì)胞。管形成在明視野顯微鏡下可見，并得到了顯微照片。示出了代表性的顯微照片(放大100倍)。通過對每個視場分枝點(diǎn)的平均數(shù)進(jìn)行計數(shù)對管形成進(jìn)行定量評價。其中條表示平均值±sd(n＝6)；相比vegf的統(tǒng)計顯著性采用學(xué)生t-實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定(p<0.05)。實(shí)施例3：znmos4和m1m2s4(m1獨(dú)立地為mg、ca、mn或fe；m2為mo或w)化合物減少huvec內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移對血管生成是必須的。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移受驅(qū)化性(chemotactic)、形合性(hapotactic)和驅(qū)機(jī)性(mechanotactic)的刺激因子定向調(diào)控，且進(jìn)一步涉及細(xì)胞外基質(zhì)的降解以能夠使遷移細(xì)胞進(jìn)展。采用一種稱為博伊登室實(shí)驗(yàn)(boydenchamberassay)的體外遷移生物實(shí)驗(yàn)來研究納米顆粒對huvec內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。具體地，huvec細(xì)胞于35mm組織培養(yǎng)皿內(nèi)的egm-2生長介質(zhì)中生長直到80-90％融合。在收獲之前使細(xì)胞在ebm-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中受餓24小時，計數(shù)，并以1×106個細(xì)胞/ml在ebm-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重新懸浮。將50μl的細(xì)胞懸浮液與任何所列出的血管生成抑制劑低劑量納米顆粒(10ng/ml)、高劑量納米顆粒(50ng/ml)添加至頂室，或者將采用蘿卜硫素(5μm)的對照引入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。在每個孔的底室中添加150μl包含化學(xué)引誘物(vegf(50μg/μl)或fgf-2(50μg/μl))的介質(zhì)和上述的相同抑制劑。在37℃的co2溫育器中允許細(xì)胞遷移24小時。用100μl(1×)清洗緩沖液(艾美捷遷移實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)盒)清洗頂室和底室，然后將100μl的結(jié)晶紫加入到底室來染色遷移細(xì)胞，并將細(xì)胞在37℃的co2溫育器溫育30分鐘。將100μl的細(xì)胞分離液添加到實(shí)驗(yàn)盤的底室并溫育30分鐘。在底室中的染色細(xì)胞的吸光率在od560nm處讀取。通過測量已知數(shù)量的huvec細(xì)胞數(shù)量在od560nm處的吸光率針對huvec細(xì)胞先前確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線將相對吸光率轉(zhuǎn)換成細(xì)胞數(shù)。遷移的細(xì)胞的百分比通過將遷移細(xì)胞數(shù)除以裝載到上部腔室中總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行確定。條表示平均值±sd(n＝3)；統(tǒng)計顯著性采用學(xué)生t-實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定(p<0.05)。在該生物實(shí)驗(yàn)中當(dāng)采用三元金屬硫化物m1m2s4中與mo或w結(jié)合的包括mg、ca、mn、fe和zn的二價金屬時觀察到huvec內(nèi)皮細(xì)胞遷移的減少。此處，焦點(diǎn)是由使用znmos4納米顆粒獲得的定量測量結(jié)果。首先，評估了在存在或不存在用高劑量(50ng/ml)或低劑量(10ng/ml)處理的情況下vegf(50μg/ml)誘導(dǎo)的接種huvec細(xì)胞的細(xì)胞遷移特性。遷移的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，且分離細(xì)胞的吸光率在od560處進(jìn)行測量，針對三個孔確定遷移細(xì)胞的百分比，對每個處理示出平均值。如圖6a所示，相比未經(jīng)處理的細(xì)胞而言，高劑量znmos4處理和低劑量znmos4處理兩者都減少了huvec細(xì)胞遷移的數(shù)量。該抑制劑類似于由5μm的蘿卜硫素產(chǎn)生的結(jié)果。該結(jié)果通過采用fgf2(50μg/ml)作為另一種血管生成誘導(dǎo)劑得到了證實(shí)(圖6b)。還采用了一種替代方法來測試znmos4對huvec遷移的影響，該方法采用所謂的“創(chuàng)傷愈合(woundhealing)”實(shí)驗(yàn)，其中細(xì)胞填充單層細(xì)胞中的刮傷。用無菌1000μl吸管端穿過huvec細(xì)胞融合單層的中心刮出傷口。在有或沒有znmos4納米顆粒處理的情況下將細(xì)胞在單獨(dú)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中溫育16小時(圖7a)或具有vegf(50μg/ml)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中溫育16小時(圖7b)。在刮傷時(左板)和16小時時(右板)照相，并用imagej對圖像進(jìn)行分析以確定在16小時時保持開放的傷口的百分比。結(jié)果表明vegf處理的huvec細(xì)胞遷移并且填充了受傷區(qū)域的絕大部分。相比之下，低劑量znmos4納米顆粒比僅有vegf降低了huvec細(xì)胞的遷移(圖7c)，而在高劑量時，遷移被完全阻止(圖7d)。這些結(jié)果證明了znmos4納米顆粒能夠降低由vegf引發(fā)的huvec細(xì)胞的遷移能力。圖6-znmos4納米顆粒處理抑制了vegf和fgf-2誘導(dǎo)的huvec細(xì)胞遷移。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的huvec細(xì)胞(5×104個細(xì)胞/孔)與血管生成抑制劑蘿卜硫素(5μm)一起或與低劑量(10ng/ml)或高劑量(50ng/ml)znmos4納米顆粒處理一起被接種到頂室內(nèi)。在具有或不具有fgf-2(圖6b)或vegf(圖6a)的情況下將介質(zhì)加入至底室，并包含高劑量(50ng/ml)或低劑量(10ng/ml)的znmos4納米顆粒。根據(jù)本文所描述計算遷移細(xì)胞的平均百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。統(tǒng)計顯著性采用學(xué)生t-實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)(p<0.05)。圖7-znmos4納米顆粒降低了huvec遷移能力。融合的huvec細(xì)胞用吸管端刮傷(板a-d)。將細(xì)胞在單獨(dú)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中溫育16小時(板a)或具有vegf(50ug/ml)(板b-d)并由低劑量(10ng/ml)znmos4納米顆粒處理(板c)或高劑量(50ng/ml)znmos4納米顆粒處理(板d)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中溫育16小時(圖7b)。刮傷的區(qū)域在0小時和16小時處照相。每種情況示出一張代表性顯微照片(放大100倍)。保持開放的“傷口”的面積由imagej測量，并確定四個圖像的平均開口面積。板e以遷移的平均開口面積百分比示出了細(xì)胞遷移的定量評價。其中的條代表平均值±sd(n＝4)；與vegf相比，p<0.05。實(shí)施例4：znmos4和m1m2s4(m1獨(dú)立地為mg、ca、mn或fe；m2為mo或w)化合物對血管內(nèi)皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞(即pc3和lncap細(xì)胞)是無毒的。采用mtt細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)來測量細(xì)胞存活性和細(xì)胞增值以定量化細(xì)胞群對znmos4和m1m2s4(m1獨(dú)立地為mg、ca、mn或fe；m2為mo或w)化合物納米顆粒的響應(yīng)。測試了這些納米顆粒是否對上述三種細(xì)胞系的增值和存活性有負(fù)面影響。mtt細(xì)胞存活性實(shí)驗(yàn)基于在活的新陳代謝活躍細(xì)胞中形成的溶解的mtt(四唑鹽3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)甲臜晶體，其正比于活細(xì)胞的數(shù)量。將106個/ml的單細(xì)胞懸浮液(每孔104個細(xì)胞)接種在96孔板中。以不同的濃度(0-150μm)將納米顆粒加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中以將每孔的總體積變成100μl。作為控制，將細(xì)胞毒性劑量的依托泊苷(etoposide)加至一些孔中以代替納米顆粒。將細(xì)胞溫育過夜，然后將mtt劑和清潔劑加入到每個孔中，并將細(xì)胞在暗處再溫育2小時。每個孔中的吸光率在酶標(biāo)儀中570nm處進(jìn)行測量，并且三個孔的平均值通過減去每種處理?xiàng)l件下的空白的平均值來確定。活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)通過將納米顆粒處理的孔的吸光率除以未處理的孔的吸光率計算確定。進(jìn)行學(xué)生t-實(shí)驗(yàn)來確定顯著性。發(fā)現(xiàn)znmos4和m1m2s4(m1獨(dú)立地為mg、ca、mn或fe；m2為mo或w)化合物的納米顆粒對實(shí)驗(yàn)的三個細(xì)胞系是無毒的。下面給出的代表性數(shù)據(jù)由采用znmos4納米顆粒獲得。首先，znmos4納米顆粒在寬廣的濃度范圍內(nèi)沒有降低huvec細(xì)胞存活率。尤其引人注目的是，當(dāng)細(xì)胞被150μm的znmos4納米顆粒處理時，發(fā)現(xiàn)高于80％的細(xì)胞存活率。第二，znmos4納米顆粒不降低pc3和lncap細(xì)胞的細(xì)胞存活率。類似地，在150μm的znmos4納米顆粒的情況下，對于pc3和lncap細(xì)胞兩者，發(fā)現(xiàn)高于80％的細(xì)胞是存活的(圖8b和圖8c)?？傊瑉nmos4納米顆粒對huvec和前列腺癌細(xì)胞系都是無毒的，從而提示出znmos4納米顆粒抑制管形成，而不殺死細(xì)胞。圖8：znmos4納米顆粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞是非細(xì)胞毒性的。a.用znmos4納米顆粒或依托泊苷溫育24小時后的huvec細(xì)胞的存活率由mtt實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測量。示出的是相比于僅由溶劑(0μm的znmos4納米顆粒)處理的細(xì)胞的存活百分比。還測量了用znmos4納米顆?；蛞劳胁窜諟赜?4小時后的pc3存活率(板b)和lncap的存活率(板c)。描述如a。用細(xì)胞毒素濃度的依托泊苷的處理用作細(xì)胞毒性陽性對照。其中的條表示±sd(n＝3)；通過學(xué)生t-實(shí)驗(yàn)來確定統(tǒng)計顯著性，在znmos4納米顆粒處理的細(xì)胞的生存能力與未經(jīng)處理的對照之間不存在統(tǒng)計學(xué)上的差異。實(shí)施例5：znmos4和m1m2s4(m1獨(dú)立地為mg、ca、mn或fe；m2為mo或w)化合物的納米顆粒下調(diào)vegf的mrna和蛋白質(zhì)表達(dá)。為了確定vegfmrna表達(dá)是否因znmos4納米顆粒處理而降低，融合的單層pc3細(xì)胞經(jīng)受血清饑餓整夜，然后用高劑量(50ng/ml)或低劑量(10ng/ml)的znmos4納米顆粒處理24小時。圖9a示出了由taqman定量聚合酶鏈反應(yīng)(taqmanquantitativepcr)測量的vegfmrna表達(dá)對znmos4納米顆粒的響應(yīng)并歸一化至18smrna。如圖9a所示，相比于未處理的對照，在低劑量和高劑量的znmos4納米顆粒處理時，vegf表達(dá)都顯著降低。考慮到在znmos4納米顆粒處理后mrna降低，還通過在低劑量和高劑量處的znmos4納米顆粒處理在pc3細(xì)胞中檢驗(yàn)了vegf蛋白質(zhì)表達(dá)。如圖9b所示，在低劑量znmos4納米顆粒處理時，vegf蛋白質(zhì)表達(dá)降低，且在高劑量處理24小時后檢測不到。圖9：znmos4納米顆粒下調(diào)vegf在pc3前列腺癌細(xì)胞中的mrna和蛋白質(zhì)表達(dá)。(a)vegf在用低劑量(10ng/ml)或高劑量(50ng/ml)的znmos4納米顆粒處理的pc3前列腺癌細(xì)胞中的mrna表達(dá)采用taqman實(shí)時熒光定量pcr(taqmanqrtpcr)測量。采用18srrna表達(dá)來使vegf表達(dá)歸一化。數(shù)值表示出相對于未處理的對照的成倍變化。進(jìn)行學(xué)生t-實(shí)驗(yàn)來確定統(tǒng)計顯著性。(*p<0.05)。(b)vegf在用低劑量(10ng/ml)或高劑量(50ng/ml)的znmos4納米顆粒處理24小時的pc3細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。帶有40μg蛋白質(zhì)的免疫印跡(westernblot)用多克隆vegf抗體和抗兔hrp結(jié)合的二級抗體進(jìn)行探測。由ecl溫育和fujilas3000檢測系統(tǒng)進(jìn)行可視化。將印跡剝離并采用b-肌動蛋白抗體(b-actinantibody)作為加載對照進(jìn)行重新探測。實(shí)施例6：znmos4納米顆粒降低vegf表達(dá)而不影響pc3異種移植物的腫瘤生長。znmos4納米顆粒的腫瘤治療通過監(jiān)控免疫功能不全雄性小鼠(nu/nu品系，杰克遜實(shí)驗(yàn)室(jacksonlaboratory))中的腫瘤生長和血管生成進(jìn)行了檢驗(yàn)。將大約6×106個pc3細(xì)胞懸浮在0.1ml的無菌不含血清的培養(yǎng)基中，然后皮下注射到24個雄性裸鼠的右腰脅(rightflank)內(nèi)。在腫瘤注射48小時后，裸鼠分三組處理，第一組腹腔注射0.1ml無菌pbs對照，第二組注射高劑量(2mg/裸鼠)的znmos4納米顆粒和pbs的混合物，第三組注射低劑量(0.2mg/裸鼠)的znmos4納米顆粒。每周用千分尺測量腫瘤尺寸，并且腫瘤體積由下式計算：長×寬2×0.5236。28天后，或如果腫瘤體積大于500mm3，對裸鼠施行安樂死，收集腫瘤并稱重。結(jié)果顯示znmos4納米顆粒沒有降低平均或中值腫瘤重量(圖10a)或腫瘤體積(圖10b)。但是，觀察到兩個處理組(10mg/kg低劑量組和100mg/kg高劑量組)中腫瘤重量有大變化。對于用高劑量的znmos4納米顆粒處理的裸鼠，相比對照組更頻繁地觀察到更小重量的腫瘤。腫瘤重量的偏差可能與處理有關(guān)。然而，用千分尺測量的腫瘤體積并未顯示出這種變化。這些觀察結(jié)果與znmos4納米顆粒對pc3細(xì)胞無毒的事實(shí)一致，因此不能作為抗癌藥發(fā)揮作用。然而，由vegf表達(dá)指示的血管生成水平受到處理的影響，即，根據(jù)實(shí)時pcr定量，znmos4在低劑量處理組和高劑量處理組中都降低了vegfmrna表達(dá)(圖10c)，從而確認(rèn)了該藥物在動物模型中可抑制血管生成，因而具有治療癌轉(zhuǎn)移的潛力。圖10：znmos4納米顆粒降低vegf表達(dá)而不影響pc3異種移植物的腫瘤生長。在每一處理中，測量8只裸鼠的腫瘤重量(板a)和體積(板b)，并與每組的中值一起顯示。板c示出了在13個腫瘤樣品中測得的vegf基因表達(dá)。rna提取自冷凍裸鼠腫瘤樣品。按照文本中的描述采用vegf和18s(歸一化子)引物進(jìn)行taqmanqrt-pcr。所顯示的是在用znmos4納米顆粒(高劑量和低劑量)處理的裸鼠的pc3腫瘤組織中的18s歸一化的vegf表達(dá)相對于未經(jīng)處理的腫瘤組織中的18s歸一化的vegf表達(dá)之比。統(tǒng)計顯著性由學(xué)生t-實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定，相比未經(jīng)處理的控制組，p<0.05。盡管根據(jù)專利法的規(guī)定，本發(fā)明已經(jīng)描述了最佳實(shí)施方式和優(yōu)選的實(shí)施例，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，而是由所附的權(quán)利要求書的范圍進(jìn)行限定。當(dāng)前第1頁12