相關(guān)申請(qǐng)

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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子，特別是多肽，更特別是融合蛋白，其包含絲氨酸蛋白酶(serpin)抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的氨基酸序列和第二多肽。另外，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的氨基酸序列、第二多肽和第三多肽。特別是，本發(fā)明涉及包含至少一種絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和第二多肽的融合蛋白，或包含至少一種絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽、第二多肽和第三多肽的融合蛋白，其中本發(fā)明的融合蛋白的第二和第三多肽可以是以下的至少一種：fc多肽或自fc多肽衍生的氨基酸序列；細(xì)胞因子靶向多肽或自細(xì)胞因子靶向多肽衍生的序列；包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽或自包含wap的多肽衍生的序列；或白蛋白多肽或自血清白蛋白多肽衍生的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及在各種治療性和診斷性適應(yīng)癥中使用這樣的分子的方法，以及產(chǎn)生這樣的分子的方法。

發(fā)明背景

異常絲氨酸蛋白酶活性或蛋白酶與蛋白酶抑制劑的失衡可導(dǎo)致蛋白酶-介導(dǎo)的組織破壞和炎性反應(yīng)。因此，對(duì)靶向異常絲氨酸蛋白酶活性和/或蛋白酶與蛋白酶抑制劑的失衡的治療劑和療法存在需要。此外，通過(guò)削弱異常細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)和絲氨酸蛋白酶活性，可獲得提高的治療效果。此外，絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白已經(jīng)證實(shí)了抗感染活性，而靶向炎性細(xì)胞因子已表明增加感染風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的融合蛋白具有抑制炎性細(xì)胞因子活性和限制感染風(fēng)險(xiǎn)的潛力。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本文所述的融合蛋白包含至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的氨基酸序列(多肽1)和第二多肽(多肽2)。另外，本文所述的融合蛋白包含絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的氨基酸序列(多肽1)、第二多肽(多肽2)和第三多肽(多肽3)。如本文可互換使用的，術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”和“融合多肽”是指可操作連接至至少第二多肽或自至少第二多肽衍生的氨基酸序列的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的氨基酸序列。融合蛋白的單個(gè)元件可以各種方式的任一種連接，包括例如，直接連接、使用中間肽或間隔肽、使用接頭區(qū)、使用鉸鏈區(qū)或使用接頭和鉸鏈區(qū)二者。在一些實(shí)施方案中，接頭區(qū)可落入鉸鏈區(qū)的序列內(nèi)，或者鉸鏈區(qū)可落入接頭區(qū)的序列內(nèi)。優(yōu)選地，接頭區(qū)是肽序列。例如，接頭肽大約包括0-40個(gè)氨基酸，例如0-35個(gè)氨基酸，0-30個(gè)氨基酸，0-25個(gè)氨基酸或0-20個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，鉸鏈區(qū)是肽序列。例如，鉸鏈肽大約包括0-75個(gè)氨基酸，例如0-70個(gè)氨基酸，0-65個(gè)氨基酸或0-62個(gè)氨基酸。在其中融合蛋白包括接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)二者的實(shí)施方案中，優(yōu)選地，接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)各自是肽序列。在這些實(shí)施方案中，鉸鏈肽和接頭肽一起大約包括0-90個(gè)氨基酸，例如0-85個(gè)氨基酸或0-82個(gè)氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和第二多肽可通過(guò)中間結(jié)合蛋白連接。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白的基于絲氨酸蛋白酶抑制劑的部分和第二多肽部分可經(jīng)非共價(jià)連接。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白在n-末端至c-末端方向上或在c-末端至n-末端方向上可具有以下各式之一：

多肽1(a)–鉸鏈m–多肽2(b)

多肽1(a)–接頭n–多肽2(b)

多肽1(a)–接頭n–鉸鏈m–多肽2(b)

多肽1(a)–鉸鏈m–接頭n–多肽2(b)

多肽1(a)–多肽2(b)–多肽3(c)

多肽1(a)–鉸鏈m–多肽2(b)–鉸鏈m–多肽3(c)

多肽1(a)–接頭n–多肽2(b)–接頭n–多肽3(c)

多肽1(a)–鉸鏈m–接頭n–多肽2(b)–鉸鏈m–接頭n–多肽3(c)多肽1(a)–接頭n–鉸鏈m–多肽2(b)–接頭n–鉸鏈m–多肽3(c)

其中n是0-20的整數(shù)，其中m是1-62的整數(shù)和其中a、b和c是至少1的整數(shù)。這些實(shí)施方案包括上式和其任何變體或組合。例如，式中多肽的順序還包括多肽3(c)–多肽1(a)–多肽2(b)、多肽2(b)–多肽3(c)–多肽1(a)、或其任何變體或組合。

在一些實(shí)施方案中，多肽1序列包括絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。絲氨酸蛋白酶抑制劑是一組具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白，其最初作為一組能夠抑制蛋白酶的蛋白被鑒定。適合用于本文提供的融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白，以非限制性實(shí)例的方式，包括α-1抗胰蛋白酶(aat)、抗胰蛋白酶-相關(guān)蛋白(絲氨酸蛋白酶抑制劑a2)、α1-抗胰凝乳蛋白酶(絲氨酸蛋白酶抑制劑a3)、kallistatin(絲氨酸蛋白酶抑制劑a4)、單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(絲氨酸蛋白酶抑制劑b1)、pi-6(絲氨酸蛋白酶抑制劑b6)、抗凝血酶(絲氨酸蛋白酶抑制劑c1)、纖溶酶原激活物抑制劑1(絲氨酸蛋白酶抑制劑e1)、α2-抗血纖維蛋白酶(絲氨酸蛋白酶抑制劑f2)、補(bǔ)體1-抑制劑(絲氨酸蛋白酶抑制劑g1)和神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑(絲氨酸蛋白酶抑制劑i1)。

在一些實(shí)施方案中，多肽1序列包括α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽序列或自aat衍生的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，多肽1序列包括aat蛋白的一部分。在一些實(shí)施方案中，多肽1序列包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分包括至少氨基酸序列：gteaagamfleaipmsippevkfnkseqidno:1)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，aat多肽序列或自aat衍生的氨基酸序列是人aat多肽序列或衍生自人aat多肽序列。

在一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括具有以下氨基酸序列的全長(zhǎng)人aat多肽序列：

1edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiata

61famlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglfl

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181vfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvl

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301svlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsi

361ppevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:2)

在一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括與seqidno:2的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的人aat多肽序列。

在一些實(shí)施方案中，aat多肽序列是genbank檢索號(hào)aab59495.1,caj15161.1,p01009.3,aab59375.1,aaa51546.1,caa25838.1,np_001002235.1,caa34982.1,np_001002236.1,np_000286.3,np_001121179.1,np_001121178.1,np_001121177.1,np_001121176.16,np_001121175.1,np_001121174.1,np_001121172.1和/或aaa51547.1所示的一個(gè)或多個(gè)人aat多肽序列，或自aat多肽衍生的氨基酸序列自所述一個(gè)或多個(gè)人aat多肽序列衍生。

在一些實(shí)施方案中，融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)突變。例如，融合蛋白包含在融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑部分的甲硫氨酸(met)殘基處的至少一個(gè)突變。在這些met突變中，met殘基可被任何氨基酸置換。例如，met殘基可被具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸，例如亮氨酸(leu,l)置換。不希望受理論的束縛，met突變防止本發(fā)明的融合蛋白的氧化和隨后抑制活性的失活。在一些實(shí)施方案中，met殘基可被帶電荷的殘基，例如谷氨酸(glu,e)置換。在一些實(shí)施方案中，met突變?cè)赼at多肽的位置358處。例如，met突變是met358leu(m358l)。在一些實(shí)施方案中，met突變?cè)赼at多肽的位置351處。例如，met突變是met351glu(m351e)。在一些實(shí)施方案中，met突變?cè)赼at多肽的位置351和位置358處，例如met突變是met351glu(m351e)和met358leu(m358l)。例如，融合aat多肽的該變體的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)具有以下序列：gteaagaefleaiplsippevkfnk(seqidno:32)。在一些實(shí)施方案中，met突變?cè)赼at多肽的位置351和位置358處，例如met突變是met351leu(m351l)和met358leu(m358l)。例如，融合aat多肽的該變體的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)具有以下序列：gteaagalfleaiplsippevkfnk(seqidno:33)。

在一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括包含在m351和m358處修飾的變體反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)的全長(zhǎng)人aat多肽序列，其具有以下氨基酸序列：

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301svlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagaefleaiplsi

361ppevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:80)

在一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括與seqidno:80的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的人aat多肽序列。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白的第二多肽(多肽2)是fc多肽或自fc多肽衍生。這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白”。本文所述的絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列和fc多肽或自fc多肽衍生的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白包括單一絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白包括超過(guò)一個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽，和這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-fc融合蛋白”，其中(a’)是至少2的整數(shù)。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-fc融合蛋白中的每個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-fc融合蛋白中的每個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括具有不同的氨基酸序列的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-fc融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽可位于融合蛋白內(nèi)的任何位置。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分包括至少seqidno:1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體包括至少seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽至少包括具有seqidno:2的氨基酸序列的全長(zhǎng)人aat多肽序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽至少包括具有seqidno:80的氨基酸序列的全長(zhǎng)人aat多肽序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括與seqidno:2或32或33或80的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的人aat多肽序列。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括aat多肽序列或自aat多肽衍生的氨基酸序列，所述aat多肽序列是genbank檢索號(hào)aab59495.1,caj15161.1,p01009.3,aab59375.1,aaa51546.1,caa25838.1,np_001002235.1,caa34982.1,np_001002236.1,np_000286.3,np_001121179.1,np_001121178.1,np_001121177.1,np_001121176.16,np_001121175.1,np_001121174.1,np_001121172.1和/或aaa51547.1所示的一個(gè)或多個(gè)人aat多肽序列，或自aat多肽衍生的氨基酸序列自所述一個(gè)或多個(gè)人aat多肽序列衍生。

在一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽是人fc多肽，例如人iggfc多肽序列或自人iggfc多肽序列衍生的氨基酸序列。例如，在一些實(shí)施方案中，fc多肽是人igg1fc多肽或自人igg1fc多肽序列衍生的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽是人igg2fc多肽或自人igg2fc多肽序列衍生的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽是人igg3fc多肽或自人igg3fc多肽序列衍生的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽是人igg4fc多肽或自人igg4fc多肽序列衍生的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽是人igmfc多肽或自人igmfc多肽序列衍生的氨基酸序列。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括具有以下氨基酸序列的人igg1fc多肽序列：

1apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktk

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181tvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:3)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括與融合蛋白的fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)，其中fc多肽包括具有以下氨基酸序列的人igg1fc多肽序列：

1dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvd

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181dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:43)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括與seqidno:3或43的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的人igg1fc多肽序列。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，fc多肽經(jīng)突變或修飾以提高fcrn結(jié)合。在這些實(shí)施方案中，突變的或修飾的fc多肽包括以下突變：met252tyr,ser254thr,thr256glu(m252y,s256t,t256e)或met428leu和asn434ser(m428l,n434s)或met428val和asn434ser(m428v,n434s)，使用kabat編號(hào)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，突變的或修飾的fc多肽包括選自met252tyr(m252y),ser254thr(s256t),thr256glu(t256e),met428leu(m428l),met428val(m428v),asn434ser(n434s)和其組合的一個(gè)或多個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，fc多肽部分經(jīng)突變或另外修飾，以破壞fc-介導(dǎo)的二聚化。在這些實(shí)施方案中，融合蛋白在性質(zhì)上是單體的。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，fc多肽被突變或修飾。在一些實(shí)施方案中，突變的或修飾的fc多肽包括在選自m252,t246,m428和其組合的位置處的一個(gè)或多個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，突變的或修飾的fc多肽包括以下突變：met252ile,thr256asp,met428leu(m252i,t256d,m428l)，使用kabat編號(hào)系統(tǒng)。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg1fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括在對(duì)應(yīng)于上述seqidno:3的殘基22,26和198或seqidno:43的殘基32,36和208的殘基m252,t256和m428處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

1apellggpsvflfppkpkdtliisrdpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktk

61preeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvyt

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181tvdksrwqqgnvfscsvlhealhnhytqkslslspgk(seqidno:44)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg1fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括在對(duì)應(yīng)于上述seqidno:3的殘基22,26和198或seqidno:43的殘基32,36和208的殘基m252,t256和m428處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記:

1dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtliisrdpevtcvvvdvshedpevkfnwyvd

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181dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvlhealhnhytqkslslspgk(seqidno:45)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg1fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括修飾的人igg1fc多肽序列，其中對(duì)應(yīng)于上述seqidno:3的殘基6或seqidno:43的殘基16的殘基g236被缺失，和具有以下氨基酸序列：

1apellgpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkp

61reeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytl

121ppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysklt

181vdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:46)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg1fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括修飾的人igg1fc多肽序列，其中對(duì)應(yīng)于上述seqidno:3的殘基6或seqidno:43的殘基16的殘基g236被缺失，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列：

1dkthtcppcpapellgpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdg

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181gsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:47)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg1fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括在對(duì)應(yīng)于上述seqidno:3的殘基4和5或seqidno:43的殘基14和15的殘基l234和l235處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

1apevaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktk

61preeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvyt

121lppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskl

181tvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:48)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg1fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括在對(duì)應(yīng)于上述seqidno:3的殘基4和5或seqidno:43的殘基14和15的殘基l234和l235處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

1dkthtcppcpapevaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvd

61gvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskak

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181dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:49)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg1fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括殘基g236處的缺失和殘基l234和l235處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181vdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:50)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg1fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括殘基g236處的缺失和殘基l234和l235處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181gsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:51)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg1fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括殘基g236處的缺失和殘基l234,l235,m252,t256和m428處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181vdksrwqqgnvfscsvlhealhnhytqkslslspgk(seqidno:52)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg1fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括殘基g236處的缺失和殘基l234,l235,m252,t256和m428處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181gsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvlhealhnhytqkslslspgk(seqidno:53)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg1fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg1fc多肽包括修飾的人igg1fc多肽序列，其與seqidno:44,45,46,47,48,49,50,51,52或53的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括人igg2fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：

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181vdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:4)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括人igg2fc多肽序列，其與seqidno:4的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg2fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg2fc多肽包括修飾的人igg2fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181vdksrwqqgnvfscsvlhealhnhytqkslslspgk(seqidno:54)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg2fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg2fc多肽包括修飾的人igg2fc多肽序列，其與seqidno:54的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括人igg3fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：

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181tvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgk(seqidno:5)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括人igg3fc多肽序列，其與seqidno:5的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg3fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg3fc多肽包括修飾的人igg3fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181tvdksrwqqgnifscsvlhealhnrftqkslslspgk(seqidno:55)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg3fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg3fc多肽包括修飾的人igg3fc多肽序列，其中對(duì)應(yīng)于上述seqidno:5的殘基6的殘基g236被缺失，和具有以下氨基酸序列：

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181vdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgk(seqidno:56)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg3fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg3fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:5的殘基4和5的殘基l234和l235處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181tvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgk(seqidno:57)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg3fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg3fc多肽包括殘基g236處的缺失和殘基l234和l235處的突變，和具有以下氨基酸序列：

1apevagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfkwyvdgvevhnaktkp

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181vdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgk(seqidno:58)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg3fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg3fc多肽包括殘基g236處的缺失和殘基l234,l235,m252,t256和m428處的突變，和具有以下氨基酸序列：

1apevagpsvflfppkpkdtliisrdpevtcvvvdvshedpevqfkwyvdgvevhnaktkp

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181vdksrwqqgnifscsvlhealhnrftqkslslspgk(seqidno:59)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg3fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg3fc多肽包括修飾的人igg3fc多肽序列，其與seqidno:55,56,57,58或59的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在一些實(shí)施方案中，人igg3fc區(qū)在氨基酸asn297(kabat編號(hào))處被修飾，以阻止抗體的糖基化，例如asn297ala(n297a)。在一些實(shí)施方案中，人igg3fc區(qū)在氨基酸435處被修飾，以延長(zhǎng)半壽期，例如arg435his(r435h)。在一些實(shí)施方案中，人igg3fc區(qū)缺少lys447(kabatetal1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest中的eu索引)。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括人igg4fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：

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181tvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:6)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括與融合蛋白的fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)，其中fc多肽包括人igg4fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：

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在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括人igg4fc多肽序列，其與seqidno:6或60的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg4fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基22,26和19或seqidno:60的殘基34,38和210的殘基m252,t256和m428處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181tvdksrwqegnvfscsvlhealhnhytqkslslslgk(seqidno:61)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg4fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基22,26和197或seqidno:60的殘基34,38和210的殘基m252,t256和m428處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg4fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括修飾的人igg4fc多肽序列，其中對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基6或seqidno:60的殘基19的殘基g236被缺失，和具有以下氨基酸序列：

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181vdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:63)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg4fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括修飾的人igg4fc多肽序列，其中對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基6或seqidno:60的殘基19的殘基g236被缺失，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列：

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在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg4fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基5或seqidno:60的殘基17的殘基l235處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181tvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:65)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg4fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基5或seqidno:60的殘基17的殘基l235處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg4fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基4和5或seqidno:60的殘基16和17的殘基l234和l235處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181tvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:67)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg4fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基4和5或seqidno:60的殘基16和17的殘基l234和l235處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181dsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:68)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg4fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:60的殘基10的殘基s228處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181dsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:69)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg4fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:60的殘基10和17的殘基s228和l235處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181dsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:70)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg4fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基5,22,26和197或seqidno:60的殘基17,34,38和210的殘基l235,m252,t256和m428處的突變，和具有以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

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181tvdksrwqegnvfscsvlhealhnhytqkslslslgk(seqidno:71)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg4fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:6的殘基5,22,26和197或seqidno:60的殘基17,34,38和210的殘基l235,m252,t256和m428處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

1eskygppcpscpapefeggpsvflfppkpkdtliisrdpevtcvvvdvsqedpevqfnwy

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181dsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvlhealhnhytqkslslslgk(seqidno:72)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括與修飾的igg4fc多肽的n-末端偶聯(lián)的鉸鏈區(qū)的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括對(duì)應(yīng)于上述seqidno:60的殘基10,17,34,38和210的殘基s228,l235,m252,t256和m428處的突變，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突變的氨基酸殘基用框標(biāo)記：

1eskygppcppcpapefeggpsvflfppkpkdtliisrdpevtcvvvdvsqedpevqfnwy

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在其中本發(fā)明的融合蛋白包括修飾的igg4fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的修飾的igg4fc多肽包括修飾的人igg4fc多肽序列，其與seqidno:61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括人igmfc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：

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121aippsfasifltkstkltclvtdlttydsvtiswtrqngeavkthtniseshpnatfsav

181geasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpkg(seqidno:7)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的fc多肽包括人igmfc多肽序列，其與seqidno:7的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的氨基酸序列，其可操作連接至fc多肽序列，所述fc多肽序列包括或衍生自seqidno:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一個(gè)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包括選自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包括與選自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分包括至少seqidno:1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)接頭區(qū)可操作連接，例如甘氨酸-絲氨酸接頭或基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)鉸鏈區(qū)可操作連接。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)可操作連接。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽直接連接。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體的氨基酸序列，其可操作連接至fc多肽序列，所述fc多肽序列包括或衍生自seqidno:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一個(gè)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包括選自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包括與選自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體包括至少seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)接頭區(qū)可操作連接，例如甘氨酸-絲氨酸接頭或基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)鉸鏈區(qū)可操作連接。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)可操作連接。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽直接連接。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白至少包括具有seqidno:2的氨基酸序列的全長(zhǎng)人aat多肽序列，其可操作連接至fc多肽序列，所述fc多肽序列包括或衍生自seqidno:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一個(gè)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包括選自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包括與選自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白包括與seqidno:2的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的人aat多肽序列，其可操作連接至fc多肽序列，所述fc多肽序列包括或衍生自seqidno:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一個(gè)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包括選自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包括與選自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)接頭區(qū)可操作連接，例如甘氨酸-絲氨酸接頭或基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)鉸鏈區(qū)可操作連接。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)可操作連接。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽直接連接。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白至少包括具有seqidno:80的氨基酸序列的全長(zhǎng)人aat多肽序列，其可操作連接至fc多肽序列，所述fc多肽序列包括或衍生自seqidno:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一個(gè)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白包括與seqidno:80的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的人aat多肽序列，其可操作連接至fc多肽序列，所述fc多肽序列包括或衍生自seqidno:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一個(gè)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)接頭區(qū)可操作連接，例如甘氨酸-絲氨酸接頭或基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)鉸鏈區(qū)可操作連接。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽通過(guò)接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)可操作連接。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和fc多肽直接連接。

在本文提供的融合蛋白的一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白的第二多肽(多肽2)是細(xì)胞因子靶向多肽或自細(xì)胞因子靶向多肽衍生。這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白”。本文所述的絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的氨基酸序列和細(xì)胞因子靶向多肽或其衍生物。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白包括單個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白包括超過(guò)一個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽，和這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白”，其中(a’)是至少2的整數(shù)。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白中的每個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑(a)-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白中的每個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括具有不同的氨基酸序列的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白的細(xì)胞因子靶向多肽是細(xì)胞因子受體或自細(xì)胞因子受體衍生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽或衍生自細(xì)胞因子受體的氨基酸序列是人細(xì)胞因子受體序列或衍生自人細(xì)胞因子受體序列。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽是抗體或抗體片段，例如抗-細(xì)胞因子抗體或抗-細(xì)胞因子抗體片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽或自抗體或抗體片段衍生的氨基酸序列，衍生自嵌合、人源化或全人抗體序列。術(shù)語(yǔ)抗體片段包括單鏈、fab片段、f(ab')2片段、scfv、scab、dab、單結(jié)構(gòu)域重鏈抗體和單結(jié)構(gòu)域輕鏈抗體。

在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽結(jié)合細(xì)胞因子受體和阻止細(xì)胞因子與受體的結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽是抗體或抗體片段，例如抗-細(xì)胞因子受體抗體或抗-細(xì)胞因子受體抗體片段。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分包括至少seqidno:1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體包括至少seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括或衍生自至少具有seqidno:2的氨基酸序列的全長(zhǎng)人aat多肽序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括或衍生自至少具有seqidno:80的氨基酸序列的全長(zhǎng)人aat多肽序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括人aat多肽序列，其與seqidno:2或32或33或80的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括aat多肽序列或自aat多肽衍生的氨基酸序列，其是或衍生自genbank檢索號(hào)aab59495.1,caj15161.1,p01009.3,aab59375.1,aaa51546.1,caa25838.1,np_001002235.1,caa34982.1,np_001002236.1,np_000286.3,np_001121179.1,np_001121178.1,np_001121177.1,np_001121176.16,np_001121175.1,np_001121174.1,np_001121172.1和/或aaa51547.1所示的一個(gè)或多個(gè)人aat多肽序列。

絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白可摻有絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的一部分。例如，抗體包含fc多肽。因此，在其中細(xì)胞因子靶向多肽是細(xì)胞因子-靶向抗體的一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白將摻有絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的一部分。此外，具有治療性功用的大多數(shù)受體融合蛋白是fc融合蛋白。因此，在其中絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白是絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子受體融合蛋白的一些實(shí)施方案中，除了絲氨酸蛋白酶抑制劑部分和細(xì)胞因子受體部分之外，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白還可摻有fc多肽。

在其中絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白包括fc多肽序列的一些實(shí)施方案中，fc多肽序列包括或衍生自seqidno:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一個(gè)的氨基酸序列。在其中絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白包括fc多肽序列的一些實(shí)施方案中，fc多肽序列與seqidno:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73的任一個(gè)氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和細(xì)胞因子靶向多肽通過(guò)接頭區(qū)可操作連接，例如甘氨酸-絲氨酸接頭或基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和細(xì)胞因子靶向多肽通過(guò)鉸鏈區(qū)可操作連接。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和細(xì)胞因子靶向多肽通過(guò)接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)可操作連接。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和細(xì)胞因子靶向多肽直接連接。

在本文提供的融合蛋白的一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白的第二多肽(多肽2)是包含乳清酸性蛋白(wap)結(jié)構(gòu)域的多肽，或衍生自包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列。這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白”。絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或至少自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列、包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括單個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap靶向多肽融合蛋白包括超過(guò)一個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白”，其中(a’)是至少2的整數(shù)。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括具有不同的氨基酸序列的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。

這些絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽或是或衍生自包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽的多肽序列。wap結(jié)構(gòu)域是50個(gè)氨基酸的進(jìn)化上保守的序列基序，其包含以特征性的4-二硫鍵核心排列存在的8個(gè)半胱氨酸(亦稱為4-二硫鍵核心基序)。wap結(jié)構(gòu)域序列基序是在許多蛋白中特征為絲氨酸蛋白酶抑制活性的功能基序。

適合用于本文提供的融合蛋白的包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽，以非限制性實(shí)例的方式，包括分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(slpi)、彈性蛋白酶抑制劑(elafin)和eppin。

在一些實(shí)施方案中，融合蛋白的包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽序列包括分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(slpi)多肽序列或衍生自slpi的氨基酸序列。這些實(shí)施方案在本文稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi-衍生的融合蛋白”。在一些實(shí)施方案中，slpi多肽序列包含slpi蛋白的一部分，例如wap2結(jié)構(gòu)域或其子部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，slpi多肽序列或衍生自slpi的氨基酸序列是或衍生自人slpi多肽序列。

在本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi-衍生序列包括具有以下氨基酸序列的全長(zhǎng)人slpi多肽序列：

1mkssglfpflvllalgtlapwavegsgksfkagvcppkksaqclrykkpecqsdwqcpgk

61krccpdtcgikcldpvdtpnptrrkpgkcpvtygqclmlnppnfcemdgqckrdlkccmg

121mcgkscvspvka(seqidno:8)

在本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi-衍生序列包括人slpi多肽序列，其與seqidno:8的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi-衍生序列包括全長(zhǎng)人slpi多肽序列的一部分，其中該部分具有以下氨基酸序列：

1sgksfkagvcppkksaqclrykkpecqsdwqcpgkkrccpdtcgikcldpvdtpnptrrk

61pgkcpvtygqclmlnppnfcemdgqckrdlkccmgmcgkscvspvka(seqidno:9)

在本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi-衍生序列包括人slpi多肽序列，其與seqidno:9的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi-衍生序列包括全長(zhǎng)人slpi多肽序列的wap2結(jié)構(gòu)域，其中wap2結(jié)構(gòu)域具有以下氨基酸序列：

1trrkpgkcpvtygqclmlnppnfcemdgqckrdlkccmgmcgkscvspvka(seqidno:10)

在本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi-衍生序列包括人slpi多肽序列，其與seqidno:10的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi融合蛋白的一些實(shí)施方案中，slpi多肽序列或自slpi多肽衍生的氨基酸序列是或衍生自genbank檢索號(hào)caa28187.1,np_003055.1,eaw75869.1,p03973.2,aah20708.1,cab64235.1,caa28188.1,aad19661.1和/或bag35125.1所示的一個(gè)或多個(gè)人slpi多肽序列。

在本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白的slpi多肽序列或slpi-衍生序列包括在甲硫氨酸(met)殘基處被修飾的人slpi多肽序列。在這些met突變中，met殘基可被任何氨基酸置換。例如，met殘基可被具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸置換，例如亮氨酸(leu,l)或纈氨酸(val,v)。不希望受理論的束縛，met突變阻止本發(fā)明的融合蛋白的氧化和隨后的抑制活性失活。在一些實(shí)施方案中，met突變?cè)趕lpi多肽的位置98。例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑-slpi的修飾的slpi多肽序列包括seqidno:8中的突變m98l或m98v。

在其它實(shí)施方案中，融合蛋白的包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽序列包括彈性蛋白酶抑制劑多肽序列或衍生自彈性蛋白酶抑制劑的氨基酸序列。這些實(shí)施方案在本文稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑–彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，彈性蛋白酶抑制劑多肽序列包括彈性蛋白酶抑制劑蛋白的一部分，例如wap結(jié)構(gòu)域或其子部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，彈性蛋白酶抑制劑多肽序列或衍生自彈性蛋白酶抑制劑的氨基酸序列是或衍生自人彈性蛋白酶抑制劑多肽序列。

在絲氨酸蛋白酶抑制劑–彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括全長(zhǎng)人彈性蛋白酶抑制劑多肽序列，其具有以下氨基酸序列：

1mrassflivvvfliagtlvleaavtgvpvkgqdtvkgrvpfngqdpvkgqvsvkgqdkvk

61aqepvkgpvstkpgscpiilircamlnppnrclkdtdcpgikkccegscgmacfvpq

(seqidno:11)

在絲氨酸蛋白酶抑制劑–彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括人彈性蛋白酶抑制劑多肽序列，其與seqidno:11的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在絲氨酸蛋白酶抑制劑–彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括全長(zhǎng)人彈性蛋白酶抑制劑多肽序列的一部分，其中該部分具有以下氨基酸序列：

1avtgvpvkgqdtvkgrvpfngqdpvkgqvsvkgqdkvkaqepvkgpvstkpgscpiilir

61camlnppnrclkdtdcpgikkccegscgmacfvpq(seqidno:12)

在絲氨酸蛋白酶抑制劑–彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括人彈性蛋白酶抑制劑多肽序列，其與seqidno:12的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在絲氨酸蛋白酶抑制劑–彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括全長(zhǎng)人彈性蛋白酶抑制劑多肽序列的wap結(jié)構(gòu)域，其中wap結(jié)構(gòu)域具有以下氨基酸序列：

1vstkpgscpiilircamlnppnrclkdtdcpgikkccegscgmacfvpq(seqidno:13)

在絲氨酸蛋白酶抑制劑–彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白的一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括人彈性蛋白酶抑制劑多肽序列，其與seqidno:13的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在絲氨酸蛋白酶抑制劑–彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白的一些實(shí)施方案中，彈性蛋白酶抑制劑多肽序列或自彈性蛋白酶抑制劑多肽衍生的氨基酸序列衍生自genbank檢索號(hào)p19957.3,np_002629.1,baa02441.1,eaw75814.1,eaw75813.1,q8iub2.1和/或np_542181.1所示的一個(gè)或多個(gè)人彈性蛋白酶抑制劑多肽序列。

在其它實(shí)施方案中，融合蛋白的包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽序列包括eppin多肽序列或衍生自eppin的氨基酸序列。這些實(shí)施方案在本文稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)–eppin融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑–eppin融合蛋白的eppin多肽序列包括eppin蛋白的一部分，例如wap結(jié)構(gòu)域或其子部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，eppin多肽序列或衍生自eppin的氨基酸序列是或衍生自人eppin多肽序列。

在絲氨酸蛋白酶抑制劑–eppin融合蛋白的一些實(shí)施方案中，eppin多肽序列或自eppin多肽衍生的氨基酸序列是或衍生自genbank檢索號(hào)o95925.1,np_065131.1,aah44829.2,aah53369.1,aag00548.1,aag00547.1和/或aag00546.1所示的一個(gè)或多個(gè)人eppin多肽序列。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分包括至少seqidno:1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的氨基酸序列包括至少seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少全長(zhǎng)人aat多肽序列，其具有seqidno:2的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括或衍生自至少全長(zhǎng)人aat多肽序列，其具有seqidno:80的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括人aat多肽序列，其與seqidno:2或32或33或80的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括aat多肽序列或自aat多肽衍生的氨基酸序列，所述aat多肽序列是genbank檢索號(hào)aab59495.1,caj15161.1,p01009.3,aab59375.1,aaa51546.1,caa25838.1,np_001002235.1,caa34982.1,np_001002236.1,np_000286.3,np_001121179.1,np_001121178.1,np_001121177.1,np_001121176.16,np_001121175.1,np_001121174.1,np_001121172.1和/或aaa51547.1所示的一個(gè)或多個(gè)人aat多肽序列，或所述自aat多肽衍生的氨基酸序列自所述一個(gè)或多個(gè)人aat多肽序列衍生。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白還可包括fc多肽或自fc多肽衍生的氨基酸序列。這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白”。在這些實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)不應(yīng)解釋為特定的順序。例如，融合蛋白的順序可以是絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc-wap結(jié)構(gòu)域、絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域-fc或其任何變體組合。本文所述的絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列、包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列，和fc多肽或自fc多肽衍生的氨基酸序列。

在其中絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括fc多肽序列的一些實(shí)施方案中，fc多肽序列可具有seqidno:3-7和43-73的氨基酸序列。在其中絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括fc多肽序列的其它實(shí)施方案中，fc多肽序列可與seqidno.3-7和43-73的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白還可包括白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白”。在這些實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)不應(yīng)解釋為特定的順序。例如，融合蛋白的順序可以是絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白-wap結(jié)構(gòu)域、絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域-白蛋白或其任何變體組合。本文所述的絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列、包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列，和白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。

在其中絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括白蛋白多肽序列的一些實(shí)施方案中，白蛋白多肽序列包括本文所述的seqidno:14-15的氨基酸序列。在其中絲氨酸蛋白酶抑制劑-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括白蛋白多肽序列的其它實(shí)施方案中，白蛋白多肽序列與具有seqidno:14或15的任何一個(gè)氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白的第二多肽(多肽2)是白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽。這些實(shí)施方案在本文統(tǒng)稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-白蛋白融合蛋白”。本文所述的絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列和白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。此外，本發(fā)明涉及絲氨酸蛋白酶抑制劑白蛋白結(jié)合多肽融合蛋白，其中白蛋白通過(guò)中間結(jié)合分子可操作連接至絲氨酸蛋白酶抑制劑。本文中，絲氨酸蛋白酶抑制劑非共價(jià)或共價(jià)連接至人血清白蛋白。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的實(shí)施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列是人血清白蛋白(hsa)多肽或自hsa衍生的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括具有以下氨基酸序列的hsa多肽序列：

dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl(seqidno:14)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的實(shí)施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括人血清白蛋白多肽序列，其與seqidno:14的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的實(shí)施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括人血清白蛋白多肽序列的結(jié)構(gòu)域3，具有以下氨基酸序列：

eepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklva(seqidno:15)

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的實(shí)施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括人血清白蛋白多肽序列，其與seqidno:15的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的一些實(shí)施方案中，融合蛋白通過(guò)中間白蛋白結(jié)合多肽連接至人血清白蛋白。白蛋白結(jié)合多肽可以是抗體或抗體片段或自抗體或抗體片段衍生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合多肽或衍生自抗體或抗體片段的氨基酸序列衍生自嵌合、人源化或全人抗體序列。術(shù)語(yǔ)抗體片段包括單鏈、fab片段、f(ab')2片段、scfv、scab、dab、單一結(jié)構(gòu)域重鏈抗體和單一結(jié)構(gòu)域輕鏈抗體。此外，白蛋白結(jié)合多肽可以是白蛋白結(jié)合肽。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是絲氨酸蛋白酶抑制劑白蛋白結(jié)合多肽融合物，其中白蛋白結(jié)合多肽是鏈球菌蛋白g的結(jié)構(gòu)域3或自鏈球菌蛋白g的結(jié)構(gòu)域3衍生的序列。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑(a’)-白蛋白融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分包括至少seqidno:1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，aat蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)部分的變體包括至少seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括至少全長(zhǎng)人aat多肽序列，其具有seqidno:2的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括或衍生自至少全長(zhǎng)人aat多肽序列，其具有seqidno:80的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括人aat多肽序列，其與seqidno:2或32或33或80的氨基酸序列具有至少50%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。

在一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽包括aat多肽序列或自aat多肽衍生的氨基酸序列，aat多肽序列或自aat多肽衍生的氨基酸序列是或衍生自genbank檢索號(hào)aab59495.1,caj15161.1,p01009.3,aab59375.1,aaa51546.1,caa25838.1,np_001002235.1,caa34982.1,np_001002236.1,np_000286.3,np_001121179.1,np_001121178.1,np_001121177.1,np_001121176.16,np_001121175.1,np_001121174.1,np_001121172.1和/或aaa51547.1所示的一個(gè)或多個(gè)人aat多肽序列。

在一些實(shí)施方案中，融合蛋白經(jīng)修飾以增加或以其它方式抑制蛋白水解裂解，例如通過(guò)突變一個(gè)或多個(gè)蛋白水解裂解位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，與未改變的融合蛋白相比，融合蛋白經(jīng)修飾以改變或以其它方式調(diào)節(jié)融合蛋白的fc效應(yīng)功能，同時(shí)保留結(jié)合和抑制功能。fc效應(yīng)功能，以非限制性實(shí)例的方式，包括fc受體結(jié)合，在與fc受體結(jié)合時(shí)阻止促炎性介質(zhì)釋放，吞噬作用，修飾的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)，修飾的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)，修飾的fc多肽asn297殘基處糖基化(kabat編號(hào)的eu索引,kabatetal1991sequencessofproteinsofimmunologicalinterest)。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白經(jīng)突變或以其它方式修飾以影響fc受體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，fc多肽經(jīng)修飾以增強(qiáng)fcrn結(jié)合。增強(qiáng)與fcrn結(jié)合的fc多肽突變的實(shí)例是met252tyr,ser254thr,thr256glu(m252y,s256t,t256e)(kabat編號(hào),dall’acquaetal2006,j.biolchemvol281(33)23514–23524)或met428leu和asn434ser(m428l,n434s)(zalevskyetal2010naturebiotech,vol.28(2)157-159).(kabatetal1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest的eu索引)或met428val和asn434ser(m428v,n434s)，使用kabat編號(hào)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，突變的或修飾的fc多肽包括選自met252tyr(m252y),ser254thr(s256t),thr256glu(t256e),met428leu(m428l),met428val(m428v),asn434ser(n434s)和其組合的一個(gè)或多個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，fc多肽部分經(jīng)突變或以其它方式修飾以破壞fc-介導(dǎo)的二聚化(yingetal2012j.biolchem287(23):19399–19408)。在這些實(shí)施方案中，融合蛋白在性質(zhì)上是單體的。

本文提供的融合蛋白和其變體顯示抑制活性，例如通過(guò)抑制絲氨酸蛋白酶，例如人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ne)，一種胰凝乳蛋白酶折疊的絲氨酸蛋白酶(chemotrypsin-foldserineprotease)，其由中性粒細(xì)胞在炎性反應(yīng)期間分泌。本文提供的融合蛋白在結(jié)合絲氨酸蛋白酶例如人絲氨酸蛋白酶或以其它方式與其相互作用時(shí)，完全或部分地減少或以其它方式調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性。當(dāng)融合蛋白和人絲氨酸蛋白酶蛋白、多肽和/或肽之間相互作用時(shí)，絲氨酸蛋白酶的生物功能的減少或調(diào)節(jié)是完全的或部分的。與不存在相互作用，例如與本文所述的融合蛋白結(jié)合時(shí)絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性水平相比，當(dāng)在存在融合蛋白時(shí)絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性的水平降低至少95%，例如96%,97%,98%,99%或100%時(shí)，融合蛋白被認(rèn)為完全抑制絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性。與不存在相互作用，例如與本文所述的融合蛋白結(jié)合時(shí)絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性水平相比，當(dāng)在存在融合蛋白時(shí)絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性的水平降低少于95%，例如10%,20%,25%,30%,40%,50%,60%,75%,80%,85%或90%時(shí)，融合蛋白被認(rèn)為部分地抑制絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性。

本文所述的融合蛋白可用于各種治療性、診斷性和預(yù)防性適應(yīng)癥。例如，融合蛋白可用于治療受試者的各種疾病和病癥。在一些實(shí)施方案中，包括本文所述的融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白可用于治療受試者的疾病或病癥、減輕其癥狀、改善受試者的疾病或病癥和/或延遲其進(jìn)展，所述受試者患有選自以下的疾病或病癥，或經(jīng)鑒定處于選自以下的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中：α-1-抗胰蛋白酶(aat)缺陷、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(copd)、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、變應(yīng)性哮喘、囊性纖維化、肺部癌癥、缺血-再灌注損傷、包括例如心臟移植后的缺血/灌注損傷、心肌梗塞、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩病、銀屑病、i型和/或ii型糖尿病、細(xì)菌感染、真菌感染、病毒感染、肺炎、膿毒癥、移植物抗宿主病(gvhd)、傷口愈合、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化。

依據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包括本發(fā)明的融合蛋白，其包含修飾的融合蛋白和其它變體，以及合適的載體。這些藥物組合物可包括在藥劑盒中，例如診斷性藥劑盒。

附圖簡(jiǎn)述

圖1a是根據(jù)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白的一些實(shí)施方案的示意圖。絲氨酸蛋白酶抑制劑可位于融合蛋白內(nèi)的任何位置。還提供了摻有超過(guò)一種絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽的絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc融合蛋白。圖1b是sds-page凝膠的照片，顯示血清來(lái)源的aat(泳道1)、aat-fc1(泳道2,人igg1fc)和aat-el-fc1(泳道3,aat內(nèi)的met351glu,met358leu突變,人igg1fc)。圖1c是顯示aat-fc融合蛋白抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的圖。圖1d是sds-page凝膠的照片，顯示四價(jià)aat-fc-aat，每個(gè)fc多肽具有兩個(gè)aat多肽。圖1e是顯示四價(jià)aat-fc-aat融合蛋白抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的圖。圖1f是顯示自蛋白a樹脂的低ph洗脫效果的圖，其中以低ph洗脫的aat-fc融合蛋白的ne抑制能力顯著降低。圖1g是顯示與野生型aat和單突變體aat-em-fc(met351glu)相比，雙重突變體aat-el-fc(met351glu,met358leu突變)抵抗h2o2失活(濃)的圖。圖1h是描述與給予10mg/kg蛋白的大鼠(3只大鼠/試驗(yàn)蛋白)中的aat-fc相比，血清來(lái)源的aat(sdaat)的血清清除速率的圖。aat-fc的半壽期顯著長(zhǎng)于sdaat。

圖2a是本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向融合蛋白的一些實(shí)施方案的示意圖。絲氨酸蛋白酶抑制劑可融合至抗體的重鏈、輕鏈或二者。還描述了絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子受體融合蛋白。圖2b是sds-page凝膠的照片，顯示d2e7抗體(泳道1)和具有融合至重鏈的aat的d2e7抗體(泳道2)。圖2c是顯示融合至aat的d2e7抗體抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的圖。對(duì)于ne抑制，血清來(lái)源的aat顯示為陽(yáng)性對(duì)照，而單獨(dú)的d2e7抗體顯示為陰性對(duì)照。

圖3a是絲氨酸蛋白酶抑制劑-fc-wap融合蛋白的一些實(shí)施方案的示意圖。圖3b是sds-page凝膠的照片，顯示aat-fc-彈性蛋白酶抑制劑(泳道1)和aat-fc-slpi(泳道2)。圖3c是顯示aat-fc-彈性蛋白酶抑制劑融合蛋白和aat-fc-slpi融合蛋白抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的圖。aat-fc融合蛋白和血清來(lái)源的aat包括在內(nèi)用于比較。

圖4a是aat-hsa融合蛋白的一些實(shí)施方案的示意圖。圖4b是sds-page凝膠的照片，顯示aat-hsa融合物。圖4c是顯示與血清來(lái)源的aat相比，aat-hsa抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的圖。

發(fā)明詳述

人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ne)是一種胰凝乳蛋白酶折疊的絲氨酸蛋白酶，由中性粒細(xì)胞在炎癥期間分泌。ne的異?；钚詫?dǎo)致彈性蛋白組織的進(jìn)行性降解和肺中肺泡結(jié)構(gòu)的緩慢破壞，導(dǎo)致肺氣腫和肺纖維化(lungarellaetal2008int.j.biochemcellbiol40:1287)。通常，錯(cuò)誤指導(dǎo)的ne活性是由于蛋白酶與其天然抑制劑α1-抗胰蛋白酶(aat)的失衡。這種失衡可由于中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)至肺的升高導(dǎo)致，如在吸煙者和囊性纖維化(cf)或急性呼吸窘迫綜合征(ards)的患者的肺中所觀察到的。相反，aat缺陷，通常由于引起在肝中att聚集和累積的點(diǎn)突變導(dǎo)致，使肺暴露于未受抑制的ne活性。具有aat缺陷的個(gè)體處于增加的肺氣腫、copd、肝病和許多其它疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。

aat缺陷影響大約100,000名美國(guó)人(根據(jù)來(lái)自α-1基金會(huì)的估算)，和許多受累的人在他們30多歲和40多歲時(shí)死亡。目前僅有幾種fda-批準(zhǔn)的藥物用于治療att缺陷(prolastin?,aralast?,zemaira?,glassia?)。每種藥物是源自合并的人血漿的天然aat，這顯得不足以滿足預(yù)期的臨床需求。此外，這些產(chǎn)品具有短的血清半壽期(t1/2為大約5天)和需要高劑量(60mg/kg體重)每周輸注。這些藥物的當(dāng)前市場(chǎng)估值為大約4億美元。根據(jù)多至95%的aat-缺陷個(gè)體未被診斷的估算和以下事實(shí)，aat-樣藥物的市場(chǎng)可能顯著更大：這些藥物有可能在并非aat-缺陷的個(gè)體中有效治療特征為ne活性升高的病狀(例如，囊性纖維化(cf)、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、吸煙引起的肺氣腫和/或copd)。

aat已表明具有廣譜抗-炎活性(tilgetal1993jexpmed178:1629–1636,libertetal1996immunol157:5126–5129,pottetal,journalofleukocytebiology852009,janciauskieneetal2007j.biolchem282(12):8573–8582,nitaetal2007intjbiochemcellbiol39:1165–1176)。最近，已提出aat可用于治療除了通常提議的炎性肺病況之外的許多人病理的證據(jù)。人aat已顯示保護(hù)小鼠免于實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(eae)的臨床和組織病理學(xué)跡象，表明其可為自身免疫疾病的潛在治療，例如多發(fā)性硬化或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)(subramanianetal2011metabbraindis26:107–113)。血清aat已顯示在移植物抗宿主病(gvhd)的嚙齒動(dòng)物模型中的活性(tawaraetal2011proc.natl.acad.sci.usa109:564–569,marcondesetal2011bloodnov3;118(18):5031-9)，這導(dǎo)致使用aat治療類固醇無(wú)響應(yīng)性急性gvhd的個(gè)體的人類臨床試驗(yàn)(nct01523821)。另外，aat在i型和ii型糖尿病的動(dòng)物模型中是有效的，抑制炎癥，保護(hù)胰島細(xì)胞免于凋亡和使得能夠持久的胰島細(xì)胞同種異體移植(zhangetal2007diabetes56:1316–1323,lewisetal2005procnatlacadsciusa102:12153–12158,lewisetal2008procnatlacadsciusa105:16236–16241,kalisetal2010islets2:185–189)。目前，有使用血清來(lái)源的aat產(chǎn)品的許多i型糖尿病的早期人類臨床試驗(yàn)(nct01183468,nct01319331,nct01304537)。

目前血清來(lái)源的aat產(chǎn)品經(jīng)過(guò)廣泛純化和試驗(yàn)，以確保除去病原性病毒，然而，不能完全消除感染性病原傳播的風(fēng)險(xiǎn)。此外，血清是有限的，這限制了血清來(lái)源的aat的產(chǎn)生能力。解決血清來(lái)源產(chǎn)品和生產(chǎn)問(wèn)題的顧慮的嘗試已把目標(biāo)放在重組aat的表達(dá)上。然而，經(jīng)過(guò)20年的努力，治療上有活力的重組aat的產(chǎn)生仍未上市(karnaukhovaetal2006aminoacids30:317)。像血漿來(lái)源的產(chǎn)品一樣，重組形式的aat具有短的血清半壽期、低產(chǎn)率和差的肺分布。

與未修飾的aat分子相比，本發(fā)明的融合蛋白具有提高的功能。aat多肽與第二多肽(其與新生fc受體(fcrn)相互作用的)的融合用于增加血清半壽期，為患者提供許多需要的給藥益處。融合蛋白的這些fcrn相互作用多肽包括源自人igg1,igg2,igg3,igg4或igm的免疫球蛋白(ig)fc多肽和人白蛋白的衍生物。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白摻有aat部分的突變，其賦予分子更耐受氧化導(dǎo)致的失活。例如，met351glu,met358leu(aat-el-fc)證實(shí)耐受h2o2氧化導(dǎo)致的失活(圖1g)。盡管aat是天然的抗-炎性蛋白，但本發(fā)明的一些實(shí)施方案通過(guò)aat多肽和細(xì)胞因子靶向多肽的融合，提供了增強(qiáng)的炎癥抑制能力。來(lái)自aat和第二多肽的雙重抗-炎性功能的偶聯(lián)將提供比任一多肽本身更有效的治療性蛋白。此外，偶聯(lián)aat的抗-感染活性將減少大多數(shù)細(xì)胞因子靶向生物制品的感染風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)aat-多肽和包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽的融合，一些實(shí)施方案提供了更有效的抗-炎性和抗-感染性蛋白。預(yù)期本發(fā)明的融合蛋白具有大的治療性功用和優(yōu)于當(dāng)前血清來(lái)源的aat產(chǎn)品。

為了延長(zhǎng)重組aat的半壽期，重組dna技術(shù)用于產(chǎn)生aat基因與人igg1,igg2,igg3,igg4,igm的fc結(jié)構(gòu)域或hsa的融合，使得預(yù)期的蛋白產(chǎn)品是aat接著fc結(jié)構(gòu)域((aat-fc(igg1),aat-fc(igg2),aat-fc(igg3),aat-fc(igg4),aat-fc(igm))或aat接著hsa。盡管已知hsa或fc結(jié)構(gòu)域與一些蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域或肽的融合可延長(zhǎng)它們的半壽期(參見(jiàn)例如jazayerietal.biodrugs22,11-26,huangetal.(2009)curropinbiotechnol20,692-699,kontermannetal.(2009)biodrugs23,93-109,schmidtetal.(2009)curropindrugdiscovdevel12,284-295)，但不知道融合至aat的fc結(jié)構(gòu)域或hsa是否將允許正確折疊和保持ne抑制活性，或是否能延長(zhǎng)重組aat的半壽期。本發(fā)明的融合蛋白顯示是有效的ne抑制劑，具有延長(zhǎng)的血清半壽期，和在一些實(shí)施方案中耐受氧化。在其它實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白通過(guò)摻入其它功能多肽，包括細(xì)胞因子靶向多肽和包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽而具有不同的性質(zhì)。

中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ne)的主要來(lái)源，經(jīng)常在ne分泌的同時(shí)經(jīng)歷氧化發(fā)生。因此，在氧化環(huán)境中有活性的本發(fā)明的融合蛋白具有極大的治療性功用。aat在反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)內(nèi)在met351和/或met358處的氧化抑制aat抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的能力。如圖1g所示，氧化失活可通過(guò)seqidno:32中所示的突變met351glu和met358leu(m351e/m358l)而減少。此外，met252和met428處的fc區(qū)氧化已表明減少fcrn結(jié)合和隨后減少包含fc的蛋白的血清半壽期。met252和met428的突變減少fc區(qū)的氧化。本發(fā)明公開和優(yōu)化了aat-fc融合蛋白，其中其通過(guò)m351和m358處的突變耐受在融合蛋白的aat部分內(nèi)的氧化-失活；和通過(guò)m252和m428處的突變耐受fcrn相互作用的氧化破壞，和通過(guò)m252i,t256d和m428l的組合突變具有延長(zhǎng)的半壽期。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，fc多肽經(jīng)突變或修飾以增強(qiáng)fcrn結(jié)合。在這些實(shí)施方案中突變的或修飾的fc多肽包括以下突變：met252ile,thr256asp和met428leu(m252i,t256d,m428l)，使用kabat編號(hào)系統(tǒng)。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，fc多肽是修飾的igg1fc多肽，和融合蛋白包括至少seqidno:53的氨基酸序列。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，fc多肽是修飾的igg1fc多肽，和融合蛋白包括至少seqidno:73的氨基酸序列。

在其中本發(fā)明的融合蛋白包括fc多肽的一些實(shí)施方案中，fc多肽經(jīng)突變或修飾以減少對(duì)fc-γ受體(fcgr)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，減少的fcgr結(jié)合可通過(guò)修飾asn297的fc糖基化來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，asn297ala(n297a)或asn297gln(n297q)的突變。在一些實(shí)施方案中，減少的fcgr結(jié)合通過(guò)修飾fc的下游鉸鏈區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，fc多肽衍生自人igg1。在這些實(shí)施方案的一些中，下游鉸鏈區(qū)經(jīng)修飾，通過(guò)leu234val和leu235ala(l235v/l235a)的突變和gly236(δg236)的缺失以模擬igg2，使用kabat編號(hào)系統(tǒng)：

igg1-鉸鏈wt:dkthtcppcpapellggps(seqidno:74)

igg1-vaδg鉸鏈:dkthtcppcpapeva-gps(seqidno:75)

在這些實(shí)施方案的一些中，融合蛋白包括至少seqidno:51的氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，fc多肽衍生自人igg4。在這些實(shí)施方案的一些中，下游鉸鏈區(qū)通過(guò)leu235glu(l235e)的突變被修飾。此外，在其中fc多肽衍生自igg4的本發(fā)明的實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)通過(guò)穩(wěn)定突變ser228pro(s228p)被修飾，使用kabat編號(hào)系統(tǒng)：

igg4-鉸鏈wt:eskygppcpscpapeflggps(seqidno:76)

igg4-鉸鏈pe:eskygppcppcpapefeggps(seqidno:77)

在這些實(shí)施方案的一些中，融合蛋白包括至少seqidno:70的氨基酸序列。

本文所述的融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列和第二多肽。在一些實(shí)施方案中，例如，本發(fā)明提供融合至人igg1-fc,igg2-fc,igg3-fc,igg4-fc,igm-fc或hsa衍生物的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。本文所述的絲氨酸蛋白酶抑制劑-融合物預(yù)期可用于治療各種適應(yīng)癥，以非限制性實(shí)例的方式包括α-1-抗胰蛋白酶(aat)缺陷、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(copd)、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、變應(yīng)性哮喘、囊性纖維化、肺部癌癥、缺血-再灌注損傷包括例如心臟移植后的缺血/灌注損傷、心肌梗塞、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩病、銀屑病、i型和/或ii型糖尿病、細(xì)菌感染、真菌感染、病毒感染、肺炎、膿毒癥、移植物抗宿主病(gvhd)、傷口愈合、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自aat的氨基酸序列和第二多肽。例如，本發(fā)明提供融合至人igg1-fc,igg2-fc,igg3-fc,igg4-fc,igm-fc或hsa衍生物的α-1-抗胰蛋白酶(aat)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的氨基酸序列和細(xì)胞因子靶向多肽或自細(xì)胞因子靶向多肽衍生的氨基酸序列。例如，本發(fā)明提供了絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的序列，其融合至人細(xì)胞因子受體或衍生物。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的序列，其融合至細(xì)胞因子靶向抗體例如抗-細(xì)胞因子抗體，或自細(xì)胞因子靶向抗體例如抗-細(xì)胞因子抗體衍生的序列，或自細(xì)胞因子靶向抗體的片段例如抗-細(xì)胞因子抗體的片段衍生的序列。例如，本發(fā)明提供了絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽衍生的序列，其融合至細(xì)胞因子靶向多肽，其中細(xì)胞因子靶向多肽結(jié)合任何以下人細(xì)胞因子：tnfα,ige,il-12,il-23,il-6,il-1α,il-1β,il-17,il-13,il-4,il-10,il-2,il-18,il-27或il-32。

例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽靶向tnfα和包括任何以下tnfα-靶向多肽或自以下tnfα-靶向多肽衍生的序列：remicade?,humira?,simponi?,cimiza?,enbrel?或atn-103和atn-192。

例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽靶向ige和包括任何以下ige-靶向多肽或自以下ige-靶向多肽衍生的序列：xolair或fcεri。

例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽靶向il-12和il-23的共有p40亞基，和包括stelara?多肽或自stelara?多肽衍生的序列。

例如stelara?細(xì)胞因子靶向多肽靶向il-13和包括cdp7766多肽或自cdp7766多肽衍生的序列。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自aat的氨基酸序列，和細(xì)胞因子靶向多肽或自細(xì)胞因子靶向多肽衍生的氨基酸序列。例如，本發(fā)明提供α-1-抗胰蛋白酶抑制劑(aat)，其融合至細(xì)胞因子靶向多肽，其中細(xì)胞因子靶向多肽結(jié)合任何以下人細(xì)胞因子：tnfα,ige,il-6,il-1α,il-1β,il-12,il-17,il-13,il-23,il-4,il-10,il-2,il-18,il-27或il-32。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽結(jié)合細(xì)胞因子受體和阻止細(xì)胞因子的結(jié)合。例如，本發(fā)明包括融合至細(xì)胞因子受體靶向抗體的絲氨酸蛋白酶抑制劑。例如，本發(fā)明提供了融合至細(xì)胞因子靶向多肽的α-1-抗胰蛋白酶抑制劑(aat)，其中細(xì)胞因子靶向多肽結(jié)合任何以下人細(xì)胞因子的受體：tnfα,ige,il-6,il-1α,il-1β,il-12,il-17,il-13,il-23,il-12和il-23的p40亞基,il-4,il-10,il-2,il-18,il-27或il-32。

例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子靶向多肽靶向il-6受體和包括actemra?多肽(描述于專利公開號(hào)ep0628639)或alx-0061多肽(描述于wo2010/115998)或自actemra?多肽或alx-0061多肽衍生的序列。

例如，actemra?細(xì)胞因子靶向多肽靶向il-6受體和包括tocilizumab多肽或自tocilizumab多肽衍生的序列。

通過(guò)蛋白治療劑靶向炎性細(xì)胞因子和免疫刺激劑已證實(shí)了在許多炎性病況中的臨床成功。用作細(xì)胞因子靶向劑的最常見(jiàn)的蛋白是可溶性細(xì)胞因子受體和單克隆抗體和其片段。靶向細(xì)胞因子的明顯缺點(diǎn)是在這些患者中感染風(fēng)險(xiǎn)增加，如通過(guò)tnfα靶向生物制品remicade?,humira?,simponi?,cimiza?和enbrel?和il-12/23p40靶向抗體stelara?所證明的。這可能是靶向炎性細(xì)胞因子的常見(jiàn)問(wèn)題，在患者中導(dǎo)致免疫抑制。aat和其它絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白引人關(guān)注，在于它們證實(shí)了抗-感染和抗-炎性活性二者。因此，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑-細(xì)胞因子靶向多肽融合蛋白可抑制異常細(xì)胞因子活性，同時(shí)降低感染風(fēng)險(xiǎn)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列，包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列，和fc多肽或自fc多肽衍生的氨基酸序列。例如，本發(fā)明提供了以任何功能組合可操作連接在一起的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽、包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽和人igg1-fc,igg2-fc,igg3-fc,igg4-fc或igm-fc衍生物。在一些實(shí)施方案中，包含wap結(jié)構(gòu)域的蛋白是人slpi或自人slpi衍生。在其它實(shí)施方案中，包含wap結(jié)構(gòu)域的蛋白是人彈性蛋白酶抑制劑(elafin)或自人彈性蛋白酶抑制劑衍生。在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自aat的氨基酸序列，和slpi多肽或衍生自slpi的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少aat多肽或衍生自aat的氨基酸序列，和彈性蛋白酶抑制劑多肽或衍生自彈性蛋白酶抑制劑的氨基酸序列。

slpi和彈性蛋白酶抑制劑是包含wap結(jié)構(gòu)域的蛋白，其顯示絲氨酸蛋白酶抑制活性。這兩種蛋白具有抗-炎性功能。此外，這些蛋白對(duì)許多細(xì)菌、病毒和真菌的菌株具有廣泛的抗-感染能力。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列和人血清白蛋白(hsa)多肽或衍生自hsa多肽的氨基酸序列。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案包括絲氨酸蛋白酶抑制劑-白蛋白結(jié)合多肽融合蛋白，其中白蛋白結(jié)合多肽負(fù)責(zé)締合絲氨酸蛋白酶抑制劑和hsa。由此，本發(fā)明包括共價(jià)和非共價(jià)連接的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽和hsa多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或hsa多肽衍生的序列。例如，本發(fā)明提供了融合至人hsa或hsa衍生物或hsa結(jié)合肽或多肽的絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自aat的氨基酸序列，和hsa多肽或衍生自hsa多肽的氨基酸序列。例如，本發(fā)明提供了融合至hsa或自hsa衍生的片段或白蛋白結(jié)合多肽的α-1-抗胰蛋白酶(aat)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或自絲氨酸蛋白酶抑制劑衍生的氨基酸序列、hsa多肽或衍生自hsa多肽的氨基酸序列和包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自aat的氨基酸序列和hsa多肽或衍生自hsa多肽的氨基酸序列，和slpi多肽或衍生自slpi的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自aat的氨基酸序列和hsa多肽或衍生自hsa多肽的氨基酸序列，和彈性蛋白酶抑制劑多肽或衍生自彈性蛋白酶抑制劑的氨基酸序列。

本發(fā)明的融合蛋白可容易地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。例如，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞、人胚腎(hek)293細(xì)胞、cos細(xì)胞、per.c6?、ns0細(xì)胞、sp2/0、yb2/0可容易地用于表達(dá)本文所述的絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白。重要的是，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生通常更適于治療性應(yīng)用的蛋白。與基于細(xì)菌、昆蟲或酵母的表達(dá)系統(tǒng)相反，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生具有糖基化模式的蛋白，其與天然人蛋白中發(fā)現(xiàn)的類似或相同。蛋白的合適的糖基化可極大地影響血清穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布、蛋白折疊和功能性。因此，在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生治療性蛋白的能力具有不同于其它系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。此外，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(例如，cho,ns0,per.c6?細(xì)胞)可容易地在商業(yè)生產(chǎn)設(shè)施中放大規(guī)模以產(chǎn)生治療性蛋白來(lái)滿足臨床要求。相較于天然形式的aat，本文所述的融合蛋白具有提高的功能和可在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生用于臨床和商業(yè)供應(yīng)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括能夠分離保留其抑制ne的能力的絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白的純化系統(tǒng)。重要的是，本發(fā)明的純化過(guò)程可容易地并入現(xiàn)今的基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的商業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中。

除非另外定義，否則結(jié)合本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另外要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)，和復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。通常，結(jié)合本文所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)和蛋白和寡或多核苷酸化學(xué)和雜交使用的命名法和其中的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的和通常使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組dna、寡核苷酸合成和組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)。酶反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，或按本領(lǐng)域通常進(jìn)行的或如本文所述進(jìn)行。前述技術(shù)和程序通常根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法和按本說(shuō)明書中引用和論述的各種一般性和更具體的參考文獻(xiàn)中所述進(jìn)行。參見(jiàn)例如，sambrooketal.molecularcloning:alaboratorymanual(2ded.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989))。結(jié)合本文所述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)和醫(yī)學(xué)和制藥化學(xué)使用的命名法和其中的實(shí)驗(yàn)室程序和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的和通常使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、制劑和遞送，和治療患者。術(shù)語(yǔ)患者包括人和獸醫(yī)受試者。

將理解，根據(jù)本發(fā)明的治療性實(shí)體的給予將與合適的載體、緩沖液、賦形劑和其它試劑一起給予，其可摻入制劑中以提供改進(jìn)的運(yùn)輸、遞送、耐受性等。各種合適的制劑可見(jiàn)于所有藥物化學(xué)家已知的藥典：remington'spharmaceuticalsciences(15thed,mackpublishingcompany,easton,pa(1975))，特別是其中blaug,seymour的第87章。這些制劑包括例如，粉劑、糊劑、軟膏劑、凝膠劑、蠟、油、脂質(zhì)、包含脂質(zhì)(陽(yáng)離子或陰離子)的囊泡(例如lipofectin?)、dna綴合物、無(wú)水吸收糊劑、水包油和油包水乳劑、乳液聚乙二醇(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠和包含聚乙二醇的半固體混合物。任何前述混合物可適合于根據(jù)本發(fā)明的治療和療法，只要制劑中的活性成分沒(méi)有被制劑失活，和制劑與所述給予途徑是生理學(xué)上相容和耐受的。對(duì)于關(guān)于藥物化學(xué)家眾所周知的制劑、賦形劑和載體的另外信息，還參見(jiàn)baldrickp.“pharmaceuticalexcipientdevelopment:theneedforpreclinicalguidance.”regul.toxicolpharmacol.32(2):210-8(2000),wangw.“l(fā)yophilizationanddevelopmentofsolidproteinpharmaceuticals.”int.j.pharm.203(1-2):1-60(2000),charmanwn“l(fā)ipids,lipophilicdrugs,andoraldrugdelivery-someemergingconcepts.”jpharmsci.89(8):967-78(2000),powelletal.“compendiumofexcipientsforparenteralformulations”pdajpharmscitechnol.52:238-311(1998)和其中的引文。

包括本發(fā)明的融合蛋白的本發(fā)明的治療性制劑可用于治療或改善受試者中與異常絲氨酸蛋白酶活性有關(guān)的疾病或病癥的相關(guān)癥狀。本發(fā)明還提供了治療或減輕受試者中與異常絲氨酸蛋白酶活性有關(guān)的疾病或病癥的相關(guān)癥狀方法。治療性方案通過(guò)以下進(jìn)行：使用標(biāo)準(zhǔn)方法，包括各種臨床和/或?qū)嶒?yàn)室程序中的任一種，鑒定受試者，例如患有(或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生)與異常絲氨酸蛋白酶活性有關(guān)的疾病或病癥的人患者。術(shù)語(yǔ)患者包括人和獸醫(yī)受試者。術(shù)語(yǔ)受試者包括人和其它哺乳動(dòng)物。

治療功效結(jié)合用于診斷或治療與異常絲氨酸蛋白酶活性有關(guān)的特定疾病或病癥的任何已知的方法確定。與異常絲氨酸蛋白酶活性有關(guān)的疾病或病癥的一種或多種癥狀的改善指示融合蛋白產(chǎn)生臨床益處。

篩選具有需要的特異性的融合蛋白的方法包括但不限于，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)、酶測(cè)定法、流式細(xì)胞術(shù)和本領(lǐng)域已知的其它免疫學(xué)介導(dǎo)的技術(shù)。

本文所述的融合蛋白可用于本領(lǐng)域已知的涉及靶標(biāo)例如絲氨酸蛋白酶的定位和/或定量的方法，例如用于測(cè)量在合適的生理學(xué)樣品中這些靶標(biāo)的水平，用于診斷性方法，用于使蛋白成像等等。術(shù)語(yǔ)“生理學(xué)樣品”和“生物學(xué)樣品”，可互換使用，在本文意欲包括自受試者分離的組織、細(xì)胞和生物流體，以及受試者內(nèi)存在的組織、細(xì)胞和流體。因此，包括在術(shù)語(yǔ)“生理學(xué)樣品”和“生物學(xué)樣品”的使用范圍內(nèi)的是血液和血液的級(jí)分或組分，包括血清、血漿或淋巴。

在給定的實(shí)施方案中，對(duì)給定的靶標(biāo)或其衍生物、片段、類似物或同源物特異性的融合蛋白，其包含靶標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，用作藥理學(xué)活性化合物(下文稱為“治療劑”)。

使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如免疫親和、色譜或免疫沉淀，本發(fā)明的融合蛋白可用于分離特定靶標(biāo)。可通過(guò)偶聯(lián)(即物理連接)融合蛋白至可檢測(cè)物質(zhì)促進(jìn)檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉抗生物素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白，和合適的放射性材料的實(shí)例包括¹²⁵i,¹³¹i,³⁵s或³h。

本發(fā)明的融合蛋白的治療性有效量通常涉及實(shí)現(xiàn)治療性目標(biāo)需要的量。如上所述，這可以是融合蛋白和其靶標(biāo)之間的結(jié)合相互作用，其在某些情況下，干擾靶標(biāo)發(fā)揮功能。另外，需要給予的量將取決于融合蛋白對(duì)其特異性靶標(biāo)的結(jié)合親和力，和還將取決于給予的融合蛋白自其所給予的其它受試者的自由體積耗盡的速率。以非限制性實(shí)例的方式，本發(fā)明的融合蛋白或其片段的治療有效劑量的通常范圍可以是約0.1mg/kg體重至約250mg/kg體重。通常的給藥頻率范圍可以是例如每日兩次至每月一次。

在使用融合蛋白片段的情況下，特異性結(jié)合靶標(biāo)的最小抑制片段是優(yōu)選的。例如，可設(shè)計(jì)保留結(jié)合靶標(biāo)的能力的肽分子。這樣的肽可經(jīng)化學(xué)合成和/或通過(guò)重組dna技術(shù)產(chǎn)生。(參見(jiàn)例如,marascoetal.,proc.natl.acad.sci.usa,90:7889-7893(1993))。按需要，制劑還可包含超過(guò)一種對(duì)治療的特定適應(yīng)癥的活性化合物，優(yōu)選地沒(méi)有不利彼此影響的具有互補(bǔ)活性的那些。備選地，或另外，組合物可包含增強(qiáng)其功能的試劑，例如細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、化學(xué)治療劑、生長(zhǎng)抑制劑、抗炎劑或抗感染劑。這樣的分子適合于以對(duì)預(yù)期目的有效的量組合存在。

活性成分還可包封在例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微囊中，例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)中或在粗乳液中。

用于體內(nèi)給予的制劑必須是無(wú)菌的。這通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾容易地實(shí)現(xiàn)。

可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適實(shí)例包括包含融合蛋白的固體疏水性聚合物的半滲透基質(zhì)，所述基質(zhì)為成型物品的形式，例如膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利號(hào)3,773,919)、l-谷氨酸和l-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如luprondepot^tm(可注射微球由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成)和聚-d-(-)-3-羥基丁酸。盡管聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠釋放分子超過(guò)100天，但某些水凝膠在更短的時(shí)間內(nèi)釋放蛋白。

藥物組合物

本發(fā)明的融合蛋白(本文亦稱為“活性化合物”)和其衍生物、片段、類似物和同源物，可摻入適合于給予的藥物組合物中。這樣的組合物通常包含融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”意欲包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗微生物和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等，其與藥物給予相容。合適的載體描述于本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考書remington’spharmaceuticalsciences的最新版本中，其通過(guò)引用并入本文。這樣的載體或稀釋劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于水、鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。脂質(zhì)體和非水性溶媒例如固定油也可使用。用于藥物活性物質(zhì)的這樣的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，否則考慮其在組合物中的用途。補(bǔ)充的活性化合物也可摻入組合物中。

本發(fā)明的藥物組合物經(jīng)配制以與其預(yù)期給予途徑相容。給予途徑的實(shí)例包括胃腸外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服(例如吸入)、透皮(即，局部)、透粘膜和直腸給予。用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下施用的溶液或混懸液可包括以下組分：無(wú)菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫納；螯合劑，例如乙二胺四乙酸(edta)；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用于調(diào)節(jié)張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。ph可用酸或堿調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制劑可包裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶。

適合于注射使用的藥物組合物包括無(wú)菌水性溶液(水溶性時(shí))或分散液和用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)注射，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、cremophorel?(basf,parsippany,n.j.)或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。在所有情況下，組合物必須是無(wú)菌的，和應(yīng)該為流體的，至容易注射的程度。其在制備和貯存的條件下必須是穩(wěn)定的，和必須針對(duì)微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用防腐。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適的混合物。合適的流動(dòng)性可例如通過(guò)使用包衣料例如卵磷脂，在分散劑的情況下通過(guò)保持需要的粒徑，和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持。阻止微生物作用可通過(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)。

無(wú)菌可注射溶液可通過(guò)將需要量的活性化合物摻入合適的溶劑，按需要含上述一種成分或各成分的組合，接著過(guò)濾除菌來(lái)制備。通常，分散劑通過(guò)將活性化合物摻入包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和需要的上述其它成分的無(wú)菌溶媒來(lái)制備。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉劑的情況下，制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其得到活性成分加來(lái)自之前其無(wú)菌過(guò)濾溶液的任何其它需要的成分的粉末。

口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可包封在明膠膠囊中或壓制成片劑。為口服治療性給予的目的，活性化合物可摻有賦形劑和以片劑、錠劑或膠囊劑的形式使用?？诜M合物還可使用用作漱口劑的流體載體制備，其中流體載體中的化合物口服施用和漱口，并吐出或咽下。藥學(xué)上相容的粘合劑和/或輔助材料可作為組合物的一部分包括在內(nèi)。片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可包含任何以下成分或具有類似性質(zhì)的化合物：粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如藻酸、primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂或sterotes；助流劑，例如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或矯味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙矯味劑。

對(duì)于通過(guò)吸入給予，化合物以氣溶膠噴霧劑的形式自包含合適的拋射劑，例如氣體，例如二氧化碳的加壓容器或分配器，或噴霧器中遞送。

系統(tǒng)給予也可通過(guò)透粘膜或透皮方式。對(duì)于透粘膜或透皮給予，適合于待滲透的屏障的滲透劑用于制劑。這樣的滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的，和對(duì)于透粘膜給予，包括例如去垢劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。透粘膜給予可通過(guò)使用鼻噴霧劑或栓劑實(shí)現(xiàn)。對(duì)于透皮給予，活性化合物配制為軟膏劑、藥膏、凝膠或霜?jiǎng)绫绢I(lǐng)域通常已知的。

化合物也可以栓劑(例如用常規(guī)栓劑基質(zhì)，例如可可脂和其它甘油酯)或滯留灌腸劑的形式制備用于直腸遞送。

在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物用保護(hù)化合物免于自身體快速消除的載體制備，例如控制釋放制劑，包括植入劑和微膠囊遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。所述材料也可市售獲自alzacorporation和novapharmaceuticals,inc。脂質(zhì)體混懸液也可用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備，例如描述于美國(guó)專利號(hào)4,522,811。

特別有利的是，配制呈容易給予和劑量均勻的單位劑型的口服或胃腸外組合物。本文使用的單位劑型是指適合作為用于待治療的受試者的單位劑量的物理離散單位；每個(gè)單位包含預(yù)定量的活性化合物，其經(jīng)計(jì)算以與需要的藥用載體結(jié)合產(chǎn)生需要的治療性效果。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格由活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和實(shí)現(xiàn)的特定治療效果，以及配制用于治療個(gè)體的這樣的活性化合物的領(lǐng)域中固有的局限性規(guī)定和直接取決于它們。

藥物組合物可與給藥說(shuō)明書一起包括在容器、包裝或分配器中。

本發(fā)明將在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不限制權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1：aat-fc融合蛋白和變體

根據(jù)本發(fā)明的aat-fc融合蛋白的實(shí)例性而非限制性的實(shí)例包括以下序列。盡管這些實(shí)例包括鉸鏈序列和/或接頭序列，但本發(fā)明的融合蛋白可使用長(zhǎng)度和/或柔韌性合適的任何鉸鏈序列和/或接頭序列制備?；蛘撸诤系鞍卓刹皇褂勉q鏈和/或接頭序列制備。例如，多肽組分可直接連接。

實(shí)例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-hfc1(人igg1fc)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)和融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜體表示(seqidno:3)。

aat-hfc1(人igg1fc)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:16)

實(shí)例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-hfc2(人igg2fc)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)和融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜體表示(seqidno:4)。

aat-hfc2(人igg2fc)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkerkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:17)

實(shí)例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-mm-el-hfc1(人igg1fc,met351glu/met358leu)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:34)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜體表示(seqidno:3)和met351glu突變用框盒表示，和met358leu突變用灰色陰影表示。

aat-mm-el-hfc1(人igg1fc,met351glu/met358leu)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagaefleaiplsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:18)

實(shí)例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-mm-el-hfc2(人igg2fc,met351glu/met358leu)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:34)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜體表示(seqidno:4)，met351glu突變用框盒表示，和met358leu突變用灰色陰影表示。

aat-mm-el-hfc2(人igg2fc,met351glu/met358leu)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagaefleaiplsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkerkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:19)

實(shí)例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-mm-ll-hfc1(人igg1fc,met351leu/met358leu)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:35)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜體表示(seqidno:3)，met351leu突變用黑色陰影表示，和met358leu突變用灰色陰影表示。

aat-mm-ll-hfc1(人igg1fc,met351leu/met358leu)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagalfleaiplsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:36)

實(shí)例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-mm:ll-hfc2(人igg2fc,met351leu/met358leu)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:35)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜體表示(seqidno:4)，met351leu突變用黑色陰影表示和met358leu突變用灰色陰影表示。

aat-mm:ll-hfc2(人igg2fc,met351leu/met358leu)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagalfleaiplsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkerkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:20)

實(shí)例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-hfc1-aat(人igg1)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜體表示(seqidno:3)。

aat-hfc1-aat(人igg1)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkastgsedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:21)

aat-el-fc-igg1-dv,δg,idl(aat:met351glu/met358leu;fcigg1:leu234val/leu235ala,缺失gly236,met252ile,thr256asp,met428leu)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagaefleaiplsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkggggdkthtcppcpapevagpsvflfppkpkdtliisrdpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvlhealhnhytqkslslspgk(seqidno:78)

aat-el-fc-igg4-pe,idl(aat:met351glu/met358leu;fcigg4:ser228proleu235glu,met252ile,thr256asp,met428leu)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagaefleaiplsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkeskygppcppcpapefeggpsvflfppkpkdtliisrdpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvlhealhnhytqkslslslgk(seqidno:79)

這些實(shí)例性的aat-fc融合蛋白使用以下技術(shù)制備。

編碼人aat的基因自人肝cdna(zyagen)經(jīng)pcr擴(kuò)增。編碼aat或fc區(qū)的基因內(nèi)的特定點(diǎn)突變通過(guò)重疊pcr產(chǎn)生。aat編碼基因與編碼鉸鏈區(qū)、接著人igg1,igg2,igg3,igg4或igm的ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的基因符合讀框地克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，所述載體包含在aat基因插入位點(diǎn)上游的哺乳動(dòng)物分泌信號(hào)序列。將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞(具體是hek293或cho細(xì)胞)和在8%co237℃生長(zhǎng)數(shù)天。重組aat-fc融合蛋白自表達(dá)細(xì)胞上清液通過(guò)蛋白a色譜純化。重要的是，使用接近中性的ph緩沖液(gentleag/abelutionbuffer,thermoscientific)以自蛋白a樹脂洗脫aat-fc融合蛋白。aat-fc融合蛋白不能使用標(biāo)準(zhǔn)的低ph洗脫自蛋白a樹脂洗脫，因?yàn)閍at抑制ne的能力在低ph處理后受損，可能歸因于低ph介導(dǎo)的aat寡聚化。圖1f顯示低ph洗脫對(duì)aat抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的能力的影響。aat-fc融合蛋白可通過(guò)蛋白a和接近中性的ph洗脫緩沖液，或通過(guò)captureselect?α-1抗胰蛋白酶親和基質(zhì)(bacbv)純化。

通過(guò)確定其抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ne)的能力，測(cè)試純化的aat-fc融合蛋白的活性。圖1b和1d顯示純化的血清來(lái)源的aat(sdaat)和aat-fc融合蛋白的還原性sds-page凝膠(圖1b-泳道1:sdaat,泳道2:aat-fc(seqidno:16),泳道3:aat-el-fc(seqidno:18)，圖1daat-fc-aat(seqidno:20)。蛋白通過(guò)用考馬斯藍(lán)染色可視化。

為了監(jiān)測(cè)人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ne)活性，使用熒光微板測(cè)定法。使用以下測(cè)定法，通過(guò)殘留ne活性的伴隨降低，測(cè)量抑制活性。該測(cè)定緩沖液包含100mmtrisph7.4,500mmnacl和0.0005%tritonx-100。人ne以終濃度5nm使用(但也可以1-20nm使用)。在該測(cè)定法中熒光肽底物aavp-amc以終濃度100μm使用。來(lái)自moleculardevices的geminiem讀板儀用于讀出測(cè)定動(dòng)力學(xué)，使用分別為370nm和440nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，和420nm的截止值。該測(cè)定法在室溫下讀數(shù)10min，每5-10秒掃描。vmax/秒對(duì)應(yīng)于殘留ne活性，其對(duì)抑制劑的各濃度作圖。x-軸的截距表示在測(cè)定中完全失活起始濃度的ne需要的抑制劑的濃度。人血清來(lái)源的aat(sdaat)在這些測(cè)定法中用作陽(yáng)性對(duì)照。aat-fc融合蛋白顯示有效的ne抑制活性，如圖1c所示。其中兩個(gè)aat多肽融合至單個(gè)fc多肽的融合物(aat-fc-aat)顯示比sdaat和包含單個(gè)aat多肽的aat-fc融合蛋白提高的效力(圖1e)。此處提供的這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果首次證實(shí)了aat可融合至fc區(qū)和保持其抑制ne的能力。特別重要的是，發(fā)現(xiàn)aat-fc-aat融合蛋白是更有效的ne抑制劑。

圖1f證實(shí)了aat-el-fc(m351e,m358l)融合蛋白對(duì)氧化失活的抗性。在ne抑制測(cè)定法中，aat融合蛋白、aat-fc(wt)、aat-el-fc(m351e,m358l)和aat-em-fc(m351e)用33mmh2o2處理和與未處理的融合蛋白比較。aat-el-fc抑制ne不受氧化的損害，這與測(cè)試的其它蛋白相反。

此外，在大鼠中與血清來(lái)源的aat相比，aat-fc融合蛋白顯示更長(zhǎng)的血清半壽期(圖1h)。在這些研究中，向3只大鼠/各試驗(yàn)蛋白i.v.注射10mg/kg的sdaat或aat-fc。在48小時(shí)期間在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得血清樣品。血清att濃度使用elisa測(cè)量。這些結(jié)果證實(shí)了對(duì)于治療許多人炎性病況和感染性疾病，與血清來(lái)源的aat相比，本發(fā)明的融合蛋白具有改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)并且是優(yōu)越的治療形式。

實(shí)施例2：aat-tnfα靶向分子融合蛋白

本文提供的研究描述了包含融合至抗-tnfα抗體或tnfα受體衍生物的人aat的重組aat衍生物的數(shù)個(gè)非限制性實(shí)例。這些實(shí)例在下文提供以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的不同特征。實(shí)例還說(shuō)明了實(shí)施本發(fā)明的有用方法。這些實(shí)例不限制，也不意欲限制本發(fā)明的范圍。

下文的融合蛋白包括來(lái)自或衍生自以下的細(xì)胞因子靶向多肽序列：(i)抗-tnfα抗體d2e7(亦稱為adalimumab或humira?)或(ii)2型tnfα受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(tnfr2-ecd)。融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示，抗體恒定區(qū)(ch1-鉸鏈-ch2-ch3，或cl)用斜體表示，和d2e7-vh、d2e7-vk和tnfr2-ecd用黑體表示。盡管這些實(shí)例包括鉸鏈序列和/或接頭序列，但本發(fā)明的融合蛋白可使用長(zhǎng)度和/或柔韌性合適的任何鉸鏈序列和/或接頭序列制備?；蛘?，融合蛋白可不使用鉸鏈和/或接頭序列制備。

實(shí)例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的d2e7-輕鏈-aat(g3s)2接頭。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，d2e7-vk用黑體表示(seqidno:37)和抗體恒定區(qū)用斜體表示(seqidno:38)。

d2e7-輕鏈-aat(g3s)2接頭

diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirnylawyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqrynrapytfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecgggsgggsedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:22)

實(shí)例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的d2e7-輕鏈-aatastgs接頭。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，d2e7-vk用黑體表示(seqidno:37)，和抗體恒定區(qū)用斜體表示(seqidno:38)。

d2e7-輕鏈-aatastgs接頭

diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirnylawyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqrynrapytfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecastgsedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:23)

實(shí)例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的d2e7-重鏈-aat(g3s)2接頭。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，d2e7-vh用黑體表示(seqidno:39)和抗體恒定區(qū)用斜體表示(seqidno:40)。

d2e7-重鏈-aat(g3s)2接頭

evqlvesggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsaitwnsghidyadsvegrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycakvsylstassldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkgggsgggsedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:24)

實(shí)例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的d2e7-重鏈-aatastgs接頭。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，d2e7-vh用黑體表示(seqidno:39)，和抗體恒定區(qū)用斜體表示(seqidno:40)。

d2e7-重鏈-aatastgs接頭

evqlvesggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsaitwnsghidyadsvegrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycakvsylstassldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkastgsedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:25)

實(shí)例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的tnfr2-ecd-fc1-aat(g3s)2接頭。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，tnfr2-ecd用黑體表示(seqidno:41)，和抗體恒定區(qū)用斜體表示(seqidno:42)。

tnfr2-ecd-fc1-aat(g3s)2接頭

lpaqvaftpyapepgstcrlreyydqtaqmccskcspgqhakvfctktsdtvcdscedstytqlwnwvpeclscgsrcssdqvetqactreqnrictcrpgwycalskqegcrlcaplrkcrpgfgvarpgtetsdvvckpcapgtfsnttsstdicrphqicnvvaipgnasmdavctstsptrsmapgavhlpqpvstrsqhtqptpepstapstsfllpmgpsppaegstgdepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpqvkfnwyvdgvqvhnaktkpreqqynstyrvvsvltvlhqnwldgkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkgggsgggsedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:26)

實(shí)例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的tnfr2-ecd-fc1-aatastgs接頭。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，tnfr2-ecd用黑體表示(seqidno:41)，和抗體恒定區(qū)用斜體表示(seqidno:42)。

tnfr2-ecd-fc1-aatastgs接頭

lpaqvaftpyapepgstcrlreyydqtaqmccskcspgqhakvfctktsdtvcdscedstytqlwnwvpeclscgsrcssdqvetqactreqnrictcrpgwycalskqegcrlcaplrkcrpgfgvarpgtetsdvvckpcapgtfsnttsstdicrphqicnvvaipgnasmdavctstsptrsmapgavhlpqpvstrsqhtqptpepstapstsfllpmgpsppaegstgdepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpqvkfnwyvdgvqvhnaktkpreqqynstyrvvsvltvlhqnwldgkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkastgsedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk(seqidno:27)

這些實(shí)例性的aat-tnfα靶向分子融合蛋白使用以下技術(shù)制備。

編碼抗-tnfα抗體d2e7的可變重鏈(vh)和可變?chǔ)?vk)區(qū)的基因通過(guò)基因合成產(chǎn)生。d2e7-vh基因與編碼人igg1抗體重鏈恒定區(qū)(由ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域組成)的基因符合讀框地克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，所述載體包含vh結(jié)構(gòu)域插入位點(diǎn)(d2e7-hc)上游的哺乳動(dòng)物分泌信號(hào)序列。d2e7-vk基因與人抗體κ輕鏈恒定(cl)結(jié)構(gòu)域符合讀框地克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，所述載體包含vk結(jié)構(gòu)域插入位點(diǎn)(d2e7-lc)上游的哺乳動(dòng)物分泌信號(hào)序列。在上述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，aat編碼基因和鄰接的5’接頭序列符合讀框地克隆至d2e7重鏈基因的ch3結(jié)構(gòu)域(d2e7-hc-aat)或d2e7輕鏈基因的cl結(jié)構(gòu)域(d2e7-lc-aat)編碼序列的3’端。tnfα受體2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(tnfr2-ecd)通過(guò)基因合成產(chǎn)生和與編碼鉸鏈區(qū)，接著人igg1(hfc1)的ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的基因符合讀框地克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，所述載體包含tnfr2-ecd插入位點(diǎn)上游的哺乳動(dòng)物分泌信號(hào)序列。aat編碼基因和鄰近的5’接頭序列符合讀框地克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中編碼tnfr2-ecd-hfc1的基因的3’端(tnfr2-ecd-hfc1-aat)。

d2e7-hc-aat表達(dá)載體與d2e7-lc或d2e7-lc-aat表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞(特別是hek293或cho細(xì)胞)以產(chǎn)生具有分別融合至重鏈的c-末端或重鏈和輕鏈二者的c-末端的aat的d2e7抗體。d2e7-lc-aat與d2e7-hc表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞以產(chǎn)生具有融合至輕鏈的c-末端的aat的d2e7抗體。將tnfr2-hfc1-aat表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在8%co237℃生長(zhǎng)數(shù)天。

重組aat-tnfα靶向融合蛋白自表達(dá)細(xì)胞上清液通過(guò)蛋白a色譜純化。使用接近中性的ph緩沖液(gentleag/abelutionbuffer,thermoscientific)以自蛋白a樹脂洗脫aat-tnfα靶向融合蛋白。

圖2b顯示單獨(dú)d2e7抗體(泳道1)和其中aat融合至d2e7的重鏈的變體(泳道2)的sds-page凝膠。蛋白通過(guò)考馬斯藍(lán)染色可視化。

通過(guò)測(cè)定其抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的能力，測(cè)試純化的aat-tnfα靶向分子融合蛋白的活性。在這些測(cè)定中，人血清來(lái)源的aat(sdaat)用作陽(yáng)性對(duì)照。ne抑制測(cè)定法按上所述進(jìn)行。圖2c證實(shí)了相對(duì)于sdaat，aat-tnfα靶向分子融合蛋白顯示類似的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制，表明通過(guò)其與抗體融合，aat的抑制能力并未受損。

實(shí)施例3aat-fc-slpi和aat-fc-彈性蛋白酶抑制劑

本文提供的研究描述了包含融合至包含wap結(jié)構(gòu)域的蛋白的人aat的重組aat衍生物的數(shù)個(gè)非限制性實(shí)例。這些實(shí)例在下文提供，以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的不同特征。實(shí)例還說(shuō)明了實(shí)施本發(fā)明的有用方法。融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示，fc部分用斜體表示，和包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽用黑體表示。盡管這些實(shí)例包括鉸鏈序列和/或接頭序列，但本發(fā)明的融合蛋白可使用長(zhǎng)度和/或柔韌性合適的任何鉸鏈序列和/或接頭序列制備。或者，融合蛋白可不使用鉸鏈和/或接頭序列制備。例如，多肽組分可直接連接。

實(shí)例性的aat-fc-slpi融合蛋白是本文所述的aat-hfc1-slpi(人igg1fc)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，fc部分用斜體表示(seqidno:3)，和包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽用粗體表示(seqidno:9)。

aat-hfc1-slpi(人igg1fc)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkastgssgksfkagvcppkksaqclrykkpecqsdwqcpgkkrccpdtcgikcldpvdtpnptrrkpgkcpvtygqclmlnppnfcemdgqckrdlkccmgmcgkscvspvka(seqidno:28)

實(shí)例性的aat-fc-slpi融合蛋白是本文所述的aat-hfc1-slpi(人igg1fc)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，fc部分用斜體表示(seqidno:3)，和包含wap結(jié)構(gòu)域的多肽用粗體表示(seqidno:12)。

aat-hfc1-彈性蛋白酶抑制劑(人igg1fc)

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkastgsavtgvpvkgqdtvkgrvpfngqdpvkgqvsvkgqdkvkaqepvkgpvstkpgscpiilircamlnppnrclkdtdcpgikkccegscgmacfvpq(seqidno:29)

編碼slpi和彈性蛋白酶抑制劑的基因自人脾cdna(zyagen)經(jīng)pcr擴(kuò)增。這些基因克隆至實(shí)施例1的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其中slpi或彈性蛋白酶抑制劑基因與aat-fc基因符合讀框地插入。將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞(特別是hek293或cho細(xì)胞)和在8%co237℃生長(zhǎng)數(shù)天。重組aat-fc-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白自表達(dá)細(xì)胞上清液通過(guò)蛋白a色譜純化。使用接近中性的ph緩沖液(gentleag/abelutionbuffer,thermoscientific)以自蛋白a樹脂洗脫aat-fc-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白。

圖3b顯示aat-fc-wap融合蛋白的sds-page凝膠(泳道1aat-fc-彈性蛋白酶抑制劑,泳道2aat-fc-slpi)。蛋白通過(guò)考馬斯藍(lán)染色可視化。通過(guò)測(cè)定其抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的能力，測(cè)試純化的aat-fc-wap結(jié)構(gòu)域融合蛋白的活性。ne抑制測(cè)定法按上所述進(jìn)行。在這些測(cè)定法中人血清來(lái)源的aat(sdaat)和aat-fc融合蛋白用作陽(yáng)性對(duì)照。相對(duì)于sdaat，aat-fc-wap靶向分子融合蛋白顯示提高的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的ne抑制效力(圖3c)。

實(shí)施例4aat-白蛋白

本文提供的研究描述了包含融合至白蛋白多肽的人aat的重組aat衍生物的數(shù)個(gè)非限制性實(shí)例。這些實(shí)例在下文提供，以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的不同特征。實(shí)例還說(shuō)明了實(shí)施本發(fā)明的有用方法。這些實(shí)例不限制，也不意欲限制本發(fā)明。aat部分用下劃線表示和白蛋白部分用斜體表示。例如，多肽組分可直接連接。

實(shí)例性的aat-白蛋白融合蛋白是本文所述的aat-hsa。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，和白蛋白多肽用斜體表示(seqidno:14)。

aat-hsa

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkastgsdahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl(seqidno:30)

實(shí)例性的aat-白蛋白融合蛋白是本文所述的aat-hsa結(jié)構(gòu)域3。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下劃線表示(seqidno:2)，和白蛋白多肽用斜體表示(seqidno:15)。

aat-hsa結(jié)構(gòu)域3

edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqkastgseepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklva(seqidno:31)

編碼人血清白蛋白(hsa)的基因自人肝cdna(zyagen)經(jīng)pcr擴(kuò)增。產(chǎn)生哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其中編碼hsa或hsa的結(jié)構(gòu)域3的基因符合讀框地克隆至aat編碼基因的3’端，在aat上游包含哺乳動(dòng)物分泌信號(hào)序列。

將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞(特別是hek293或cho細(xì)胞)和在8%co237℃生長(zhǎng)數(shù)天。重組aat-hsa融合蛋白自表達(dá)細(xì)胞上清液使用captureselect?α-1抗胰蛋白酶親和基質(zhì)(bacbv)純化，其中結(jié)合緩沖液由20mmtris,150mmnacl,ph7.4組成，和洗脫緩沖液由20mmtris,2mmgcl2ph7.4組成。

圖4b顯示aat-hsa融合蛋白的sds-page凝膠。蛋白通過(guò)考馬斯藍(lán)染色可視化。通過(guò)測(cè)定其抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的能力，測(cè)試純化的aat-hsa融合蛋白的活性。ne抑制測(cè)定法按上所述進(jìn)行。在這些測(cè)定法中人血清來(lái)源的aat(sdaat)用作陽(yáng)性對(duì)照。相對(duì)于sdaat，aat-hsa融合蛋白顯示類似的ne抑制效力，證實(shí)了融合至白蛋白不抑制aat抑制ne的能力(圖4c)。

其它實(shí)施方案

盡管本發(fā)明已結(jié)合其詳細(xì)描述進(jìn)行了說(shuō)明，但前文的描述意欲說(shuō)明，而非限制由隨附權(quán)利要求書的范圍定義的本發(fā)明的范圍。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修飾在隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。