本發(fā)明屬于牙科種植體材料領(lǐng)域，特別涉及一種載gpp-sirna牙科種植體的制備方法。

背景技術(shù)：

鈦種植體在牙科使用廣泛，成功率高。但是，系統(tǒng)性骨疾病(如骨質(zhì)疏松)患者仍存在骨形成能力弱、骨結(jié)合不良等現(xiàn)象，增加了種植失敗的風險，甚至會造成種植體脫落導致種植的失敗，限制了其應用。

表面處理是提高種植體骨結(jié)合的有效途徑。針對種植體表面處理的研究主要包括兩個方面：一方面，表面形貌修飾如表面形貌納米化等能夠影響骨形成。另一方面，表面生物修飾如加載生物因子實現(xiàn)表面功能化。細胞外基質(zhì)蛋白、生長因子、sirna、mirna等都可作為生物因子加載于種植體表面，對體內(nèi)外骨結(jié)合發(fā)揮促進作用。

rna干擾(rnai)技術(shù)能夠特異性的調(diào)控目標基因，具有靶向、特異及高效性。sirna與mirna因其本身有良好的藥代動力學特性，可以作用于全身多個組織器官，同時具有高度特異性、固有生物學效應和良好的基因沉默效率，在疾病治療過程中，針對相應的疾病，引入外源性的特定sirna/mirna，使其轉(zhuǎn)染進入特定組織器官，到達細胞指定部位發(fā)揮作用，結(jié)合并降解相應mrna，使疾病相關(guān)基因沉默，從而達到治療疾病的效果。rnai可應用于多種骨組織類型的治療，主要是骨和軟骨。以往研究中，已發(fā)現(xiàn)多種可以促進成骨的sirna與mirna，如mir-29a、mir-31、sirancl、sicki-1等應用于種植體表面修飾促進骨形成。

sirna/mirna能否發(fā)揮作用，很大程度上依賴于能夠有效地將其傳遞至目標細胞和目標部位的基因傳遞系統(tǒng)，即安全有效的基因載體?；蜉d體主要包括病毒基因載體和非病毒基因載體。非病毒性基因載體有著低成本、低免疫原性、非傳染性、良好的依從性和臨床重復應用等一系列潛在的優(yōu)勢，使基因載體的良好選擇。非病毒載體主要有脂質(zhì)體、殼聚糖、聚乙烯亞胺等。這些非病毒載體應用廣泛，但在應用于種植體表面基因加載則有各自的缺陷。脂質(zhì)體加載不易，殼聚糖轉(zhuǎn)染效率有限，聚乙烯亞胺細胞毒性較高。因此，選擇一種容易加載，轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性小的基因載體十分重要。

近年來、石墨烯及其衍生物在生物傳感器、抗菌、藥物輸送、基因轉(zhuǎn)染及光熱治療等方面取得了突破性進展。在骨形成方面，氧化石墨烯及其衍生物加載于材料表面能夠改變材料表面理化性質(zhì)，在成骨誘導液環(huán)境中，表現(xiàn)出一定的對骨形成的促進作用。應用于基因載體時，氧化石墨烯go表面雙功能化的修飾上兩個不同類型的聚合物---pei(聚乙烯亞胺)和peg(聚乙二醇)，pei用于結(jié)合核酸分子而peg用于增強生理環(huán)境中的穩(wěn)定性。該雙聚合物功能化的氧化石墨烯即gpp(ngo-peg-pei)在進行細胞轉(zhuǎn)染時，展現(xiàn)出免于血清干擾，轉(zhuǎn)染效率提高的良好特性，是良好的基因載體的選擇。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要針對現(xiàn)有技術(shù)中sirna和載體形成復合物后在種植體表面sirna加載量較少、加載量可控性低、載體轉(zhuǎn)染效率不高等缺陷，其目的在于提供一種載gpp-sirna牙科種植體的制備方法，能夠在保證納米管形貌不受影響的情況下，高效的加載sirna，使其在種植體表面發(fā)揮高效的rna干擾作用促進種植體骨結(jié)合。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種載gpp-sirna牙科種植體的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，選用純鈦或者鈦合金加工成種植體基體，再將種植體基體表面拋光后，超聲清洗后吹干，得到純鈦或者鈦合金牙科種植體；

步驟2，采用hf溶液陽極氧化的方法在步驟1得到的種植體表面制備二氧化鈦納米管陣列，超聲清洗后干燥，得到二氧化鈦納米管種植體；

步驟3，將gpp溶液與sirna按合適比例混合形成gpp-sirna混合物溶液；

步驟4，采用陰極電沉積工藝制備載gpp-sirna的二氧化鈦納米管種植體：陰極為步驟2中制備的二氧化鈦納米管種植體，陽極為鉑片，電解液為步驟3中得到的gpp-sirna混合物溶液，用直流電源通電，可將gpp-sirna混合物沉積到二氧化鈦納米管種植體表面，獲得二氧化鈦納米管載gpp-sirna的牙科種植體。

步驟1所述鈦合金為ti-zr-sn-mo-nb合金，其中ti、zr、sn、mo和nb的原子摩爾比為72:5:3:5:15。

步驟1中的超聲清洗依次用丙酮、無水乙醇和去離子水進行，每次清洗15分鐘。

步驟2陽極氧化過程中，陽極為步驟1中拋光清洗后得到的純鈦或者鈦合金牙科種植體，陰極為石墨，電解液為hf與去離子水的混合溶液，其中hf體積分數(shù)0.5％，用直流電源通電，直流電壓為20v，通電時間為1小時，兩極距離6-8厘米，反應溫度為室溫。

步驟2中，種植體表面納米管制備完成后，用丙酮、無水乙醇和去離子水依次進行超聲清洗，每次清洗3～5分鐘，室溫干燥24h，得到二氧化碳納米管種植體。

步驟3中g(shù)pp濃度為1mg/ml，sirna濃度為20μm，n/p摩爾比為40:1。

步驟4中直流電壓為5-10v，通電時間為3-5分鐘，兩極距離1厘米，反應溫度為室溫，即可在二氧化鈦納米管種植體表面加載gpp-sirna。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用gpp作為基因載體，應用于種植體表面修飾，具有以下優(yōu)點及有益效果：

本發(fā)明中應用gpp作為sirna的基因載體，具有加載量大、轉(zhuǎn)染效率高、毒性小的優(yōu)點，由于該復合物表面大量氨基基團的存在，使復合物表現(xiàn)出強正電性，有利于其與負電性的sirna通過靜電作用結(jié)合，sirna加載量大。相比于現(xiàn)有種植體表面基因轉(zhuǎn)染常采用的商品化lipofectamine2000，gpp基因載體具有更高的轉(zhuǎn)染效率。此外，相比慢病毒、單純的pei基因載體，gpp作為基因載體生物相容性好，細胞毒性低。

本發(fā)明將gpp基因載體應用于二氧化鈦納米管種植體表面，有利于加載和釋放。gpp基因載體粒徑小(約為60nm)，使其不僅能分布于種植體表面，還能夠進入納米管管狀結(jié)構(gòu)(管徑約100nm)內(nèi)部，一方面提高了sirna的加載量，另一方面，能夠?qū)崿F(xiàn)sirna的緩釋?？朔艘酝鶅龈煞ā㈧o電吸附加載法加載量低、sirna短時間內(nèi)釋放迅速的問題。

本發(fā)明中，gpp的修飾，改變了二氧化鈦納米管種植體的表面形貌、粗糙度、親水性等表面理化參數(shù)，進一步影響后續(xù)的體內(nèi)外生物學效應。能夠在一定程度上影響細胞的粘附增殖及體內(nèi)外成骨分化。因此，能夠與促成骨sirna如sickip-1發(fā)揮協(xié)同促進作用，適宜于應用于種植體表面修飾。

本發(fā)明采用陰極電沉積技術(shù)將gpp-sirna混合物加載到二氧化鈦納米管表面，能夠通過調(diào)節(jié)電壓、時間等參數(shù)，實現(xiàn)sirna加載量的調(diào)控。不受種植體形狀的限制，可以在其復雜的表面上實現(xiàn)gpp-sirna混合物的均勻分布結(jié)合。

本發(fā)明采用gpp作為種植體表面的基因載體，基因加載量大、加載量可精細調(diào)控、載體轉(zhuǎn)染效率高。成本低、方法具有明顯的優(yōu)勢，便于大規(guī)模推廣。

附圖說明

圖1為發(fā)明過程示意圖。

圖2為為實施例1制備的牙科種植體二氧化碳納米管形貌的掃描電鏡(sem)照片圖，其中圖2a為未載gpp-sirna的二氧化碳納米管形貌圖；圖2b為載gpp-sirna的二氧化碳納米管形貌圖，nt表示二氧化鈦納米管。

圖3為實施例1制備的牙科種植體二氧化碳納米管形貌載gpp-sirna后的激光共聚焦圖，其中紅色為cy-3標記的sirna。

圖4為實施例1制備的牙科種植體二氧化碳納米管形貌載gpp-sirna后，在pbs溶液中sirna的釋放曲線。

圖5為實施例1制備的牙科種植體二氧化碳納米管形貌載gpp-sirna后接種細胞后的24h激光共聚焦圖，紅色為cy-3標記的sirna，藍色為dapi染色的細胞核。

圖6為實施例1制備的二氧化鈦納米管種植體表面加載gpp-sickip-1復合物后對靶基因沉默的檢測，sickip-1：針對ckip-1的sirna；sinc表示sirna的陰性對照。

圖7實施例1制備的牙科種植體二氧化碳納米管種植體加載gpp-sickip-1復合物前后的表面粗糙度測量結(jié)果，sa為平均粗糙度，sz表示表面最大高度。

圖8為實施例1制備的二氧化鈦納米管種植體表面加載gp-sickip-1復合物后種植體表面的成骨相關(guān)基因表達情況，alp為堿性磷酸酶、col-1為i型膠原、ocn表示骨鈣素，runx2為轉(zhuǎn)錄因子2。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1，如圖1所示，一種載gpp-sirna牙科種植體的制備方法，gpp指的是peg(聚乙二醇)和pei(聚乙烯亞胺)共同修飾的go(氧化石墨烯)，本發(fā)明包括以下步驟：

1)選用西北有色金屬院提供的純鈦加工成牙科種植體；

2)牙科種植體表面拋光后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗，每個階段均清洗15分鐘，吹干待用；

3)配制陽極氧化電解液：去離子水為溶劑，hf(氫氟酸溶液)所占體積比為0.5％；

4)陽極氧化法制備二氧化鈦納米管：拋光清洗后的牙科種植體作為陽極，鉑片或者石墨作為陰極，放入前一步驟配制的陽極氧化電解液內(nèi)，具體陽極氧化參數(shù)為：直流電壓為20v，通電時間為1小時，兩極距離3-8厘米，反應溫度為室溫(25°)；

5)種植體表面納米管制備完成后，用丙酮、無水乙醇和去離子水依次清洗，各清洗3～5分鐘，室溫干燥24h，得到二氧化碳納米管種植體；

6)將1mg/ml的gpp溶液和具有成骨作用的ckip-1sirna(20μm)溶液按n/p摩爾比為40:1混合，混合后室溫攪拌20min使其充分混勻后，置于電沉積容器中；

7)陰極電沉積法加載gpp-sirna：陽極為鉑片，陰極為二氧化鈦納米管種植體，電解液為gpp-sirna混合物溶液，用直流電源通電，電壓為10v，通電時間為3～5分鐘，兩極距離1厘米，反應溫度為室溫(25°)，即可在二氧化鈦納米管種植體表面加載gpp-sirna。

圖2為制備的二氧化鈦納米管種植體nt(圖2a)及其表面加載gpp-sirna后(圖2b)的掃描電鏡圖。由2a可見，二氧化鈦納米管種植體表面均勻分部管徑約為100nm的納米管狀結(jié)構(gòu)。電沉積反應加載gpp-sirna后，圖2b顯示，在二氧化鈦納米管種植體表面均勻覆蓋了gpp-sirna復合物。

圖3為種植體二氧化鈦納米管表面加載sirna后形貌的激光共聚焦照片，其中紅色為cy-3標記的sirna，從圖中可以看出經(jīng)陰極電沉積加載后，二氧化鈦種植體表面的確為sirna的沉積。

對nt/gpp-sirna種植體表面sirna的釋放進行測定，即可得到圖4結(jié)果，sirna在最初兩天釋放較快，在隨后的時間里，釋放速率減慢，直到15天左右全部釋放。說明nt/gpp-sirna種植體在pbs溶液中較為穩(wěn)定，能夠?qū)崿F(xiàn)sirna的緩慢釋放。

在制備的nt/gpp-sirna種植體表面進行mc-3t3細胞培養(yǎng)，兩天后激光共聚焦觀察sirna轉(zhuǎn)染入胞情況，得到圖5所示結(jié)果，cy-3紅色熒光顯示sirna高效轉(zhuǎn)染入胞，圍繞在dapi藍染的細胞核周圍，說明nt/gpp-sirna有良好的基因轉(zhuǎn)染能力。

對所制備的材料nt/gpp-sickip-1進行靶基因(ckip-1)表達的實時定量pcr試驗，得到圖6所示結(jié)果。在轉(zhuǎn)染3天后，相對于對照組nt/gpp-sinc，nt/gpp-sickip-1組ckip-1mrna水平顯著下調(diào)(約72％)，說明電沉積形成的nt/gpp-sirna種植體能夠?qū)Π谢驅(qū)崿F(xiàn)有效地沉默。

分析二氧化碳納米管種植體加載gpp-sirna復合物前后的表面粗糙度，得到圖7顯示結(jié)果，與二氧化鈦納米管種植體nt相比，加載gpp-sickip-1后，提高了二氧化鈦納米管種植體表面粗糙度(ra)和材料表面高度(rz)，改變了材料表面性質(zhì)。

圖8為nt/gpp-sickip-1種植體表面的成骨相關(guān)基因alp、col-1、ocn及runx2表達情況的pcr檢測結(jié)果，半定量結(jié)果顯示，相比于對照組nt/gpp-sinc，nt/gpp-sickip-1種植體能夠有效地提高材料表面成骨相關(guān)基因alp、col-1、ocn及runx2的表達，表現(xiàn)出良好的促進種植體表面成骨分化的效果。