本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及一種蠶絲蛋白，具體為一種蠶絲蛋白生物支架及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蠶絲蛋白(含絲素蛋白和絲膠蛋白)是由家蠶分泌的一種天然動(dòng)物蛋白，含有18種氨基酸，不僅具有可降解、抗菌、抗癌、抗氧化、抗凝血、親水、保濕、低免疫原性以及促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖等生物活性，而且富有氨基、羥基、羧基等利于修飾或改造的活性基團(tuán)，如今蠶絲蛋白作為一種重要的組織工程材料在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的用途。

近年來，人們基于蠶絲蛋白開發(fā)了不同類型的組織工程材料，如絲蛋白水凝膠，蠶絲蛋白膜，蠶絲蛋白海綿樣材料，絲蛋白納米纖維，納米粒和絲蛋白與其他材料制備的各種復(fù)合材料等。然而到目前為止，基于蠶絲蛋白醫(yī)用材料的研發(fā)，主要基于單獨(dú)的絲素或絲膠，這是由于相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，人們懷疑絲膠蛋白是導(dǎo)致絲膠蛋白產(chǎn)生免疫原性的元兇。近年來研究表明，單獨(dú)的絲素或絲膠并不會(huì)產(chǎn)生免疫原性。盡管有個(gè)別報(bào)道絲膠與絲素在一起會(huì)產(chǎn)生免疫原性，但是，他們采用的絲素與絲膠蛋白均是經(jīng)過后續(xù)處理，絲蛋白的天然結(jié)構(gòu)和生物活性已遭受嚴(yán)重破壞，這也很可能是有關(guān)蠶絲蛋白具有免疫原性的原因所在。另外，目前有關(guān)蠶絲蛋白生物支架的制備工藝也較為復(fù)雜，成本較高且機(jī)械性能不佳。天然的絲蛋白(含絲素和絲膠)具有良好的機(jī)械性能，優(yōu)異的穩(wěn)定性和“原生態(tài)”的生物活性。因此，如何開發(fā)具有天然結(jié)構(gòu)和活性的蠶絲蛋白新型材料具有十分重要的意義。另一方面，蠶蛹已成為人們餐桌上的美食，我們知道蠶是在蠶繭中化蛹的，即蠶蛹是包裹于蠶繭中的，當(dāng)前蠶蛹生產(chǎn)主要采用人工刀削的方式從蠶繭中取出蠶蛹，費(fèi)力費(fèi)時(shí)，生產(chǎn)成本高，另外切割蠶繭取蛹過程中也破壞了絲蛋白，不能再用于繅絲，絲蛋白的經(jīng)濟(jì)價(jià)值顯著下降。因此，通過改變家蠶的生理特性，讓家蠶吐出的絲形成一個(gè)平面而非形成繭狀蠶絲蛋白支架，讓蠶蛹與蠶繭自然分離，不僅獲得了高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蠶絲蛋白生物支架，同時(shí)也為蠶蛹生產(chǎn)提供了便捷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明通過調(diào)控家蠶的吐絲平臺(tái)，改變家蠶吐絲習(xí)性，從而選育適用于生產(chǎn)天然蠶絲蛋白生物支架的家蠶品種同時(shí)直接生產(chǎn)可用于創(chuàng)傷修復(fù)的蠶絲蛋白生物支架；此外，本發(fā)明提供了由上述方法制得的蠶絲蛋白生物支架，以及該敷料在生物醫(yī)用材料等領(lǐng)域中的應(yīng)用。再則，本發(fā)明為獲得無創(chuàng)蠶蛹提供了便利，蠶蛹與絲蛋白是分離開的，省時(shí)省力，可以顯著提高蠶業(yè)生產(chǎn)的價(jià)值。

技術(shù)方案：一種蠶絲蛋白生物支架，所述生物支架的成分為絲膠蛋白和絲素蛋白。

優(yōu)選的，所述絲膠蛋白和絲素蛋白來源于非絲素缺失型家蠶品種。

進(jìn)一步的，所述家蠶品種為菁松a或白玉。以上品種均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存。

一種蠶絲蛋白生物支架的制備方法，包含以下步驟：

(1)構(gòu)建家蠶吐絲平臺(tái)，選用平整的臺(tái)基，首先在臺(tái)基上覆蓋吸水紙或吸水布，再覆蓋一層2～30目的尼龍網(wǎng)或棉布網(wǎng)；

(2)將野生型家蠶飼養(yǎng)至5齡熟蠶期，待家蠶體內(nèi)排泄干凈后，將其轉(zhuǎn)移至步驟(1)構(gòu)建的平臺(tái)上，每批次家蠶的投放密度為250頭/平方米以下；

(3)家蠶完成吐絲并化蛹后，選取健康的家蠶蛹用于化蛾、制種傳代；

(4)將步驟(3)留種的家蠶按步驟(2)的方式飼養(yǎng)，并重復(fù)步驟(3)；

(5)重復(fù)傳代10～15代后，按照步驟(2)的方式飼養(yǎng)，待家蠶吐絲完成，將網(wǎng)與下層紙或布分開，再?gòu)木W(wǎng)上分離蠶絲蛋白，即可獲得蠶絲蛋白生物支架。蠶絲蛋白生物支架的厚度可以通過控制單位面積吐絲家蠶的數(shù)量和上蠶的批次來實(shí)現(xiàn)。

所述蠶絲蛋白生物支架在生物醫(yī)用材料中的應(yīng)用。

所述蠶絲蛋白生物支架在細(xì)胞載體中的應(yīng)用。

有益效果：(1)本發(fā)明首次采用野生型家蠶品種結(jié)合家蠶育種技術(shù)通過改變家蠶的吐絲生理習(xí)性獲得可用于創(chuàng)傷修復(fù)的蠶絲蛋白生物支架，該生物支架具有絲膠蛋白的天然結(jié)構(gòu)和活性，保持了蠶絲蛋白的“原生態(tài)”特性；同時(shí)本方案獲得的絲蛋白生物支架生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，具有可推廣性；(2)通過本發(fā)明所述方法制得的蠶絲蛋白生物支架具有多孔結(jié)構(gòu)，透氣性好，可降解性和優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度；(3)本發(fā)明所述家蠶絲蛋白生物支架具有良好的生物相容性和細(xì)胞粘附性，可長(zhǎng)期支持細(xì)胞的存活、增殖與遷移；(4)該生物支架可用于細(xì)胞外基質(zhì)支持細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換，可作為一種醫(yī)用填充材料，可應(yīng)用于多種組織損傷的修復(fù)和疾病的治療。

附圖說明

圖1是家蠶吐絲平臺(tái)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是蠶絲蛋白生物支架結(jié)構(gòu)圖；

其中a為宏觀結(jié)構(gòu)圖，b為微觀結(jié)構(gòu)圖；

圖3是蠶絲蛋白生物支架孔隙率統(tǒng)計(jì)圖；

圖4是蠶絲蛋白生物支架水平衡圖；

圖5是蠶絲蛋白生物支架在不同ph環(huán)境中的降解曲線圖；

圖6是蠶絲蛋白生物支架的機(jī)械性能測(cè)試圖；

圖7是蠶絲蛋白生物支架的熱穩(wěn)定性圖；

圖8是蠶絲蛋白生物支架的x衍射圖；

圖9是小鼠成皮膚成纖維細(xì)胞nih3t3細(xì)胞活力檢測(cè)圖；

圖10是蠶絲蛋白生物支架中細(xì)胞遷移圖；

圖11是蠶絲蛋白生物支架3d細(xì)胞培養(yǎng)圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1制備家蠶蠶絲蛋白生物支架

(一)選擇家蠶品種

選用野生型家蠶品種(由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存并向外商業(yè)化提供)，該類家蠶品種所吐的絲蛋白中包含絲膠蛋白和絲素蛋白。

(二)制備家蠶吐絲平臺(tái)

選用厚度為2cm的干燥木材或紙板制作一個(gè)直徑和高度均為50cm的圓柱體(基座)。將基座放在一個(gè)平整的臺(tái)面上，在其向上的一面覆蓋4層厚度為0.5mm的經(jīng)高溫滅菌的新聞紙。然后再在紙上覆蓋一層棉紗網(wǎng)(10目)，并將棉紗網(wǎng)的邊緣固定。

(三)選育家蠶品種

選取家蠶野生型品種(菁松a或白玉)，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下(1-2齡28℃，3-5齡25℃)，選用新鮮桑葉飼喂，采用一日三回育。待家蠶5齡不再食桑時(shí)，將蠶放置在一個(gè)鋪有吸水紙的蠶匾中，等家蠶體糞便排泄干凈后，再將家蠶轉(zhuǎn)移到步驟(二)制作的家蠶吐絲平臺(tái)上。讓家蠶在平臺(tái)上吐絲，人員在旁邊觀察，如發(fā)現(xiàn)有家蠶在平臺(tái)上掉下，立即將其放回平臺(tái)。待家蠶吐完絲后即在平臺(tái)上化蛹。待化蛹結(jié)束，挑選化蛹正常的個(gè)體化蛾后交配留種，其余淘汰。按此種方法選育20代以上，即可獲得適應(yīng)于在平臺(tái)上吐絲的絲素缺失型家蠶新品種。

(四)制備蠶絲蛋白生物支架

選取由步驟(三)選育后的家蠶品種進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)方法同步驟(三)所述。待家蠶5齡止桑后，將家蠶轉(zhuǎn)移到鋪有吸水紙的蠶匾中，當(dāng)它們體內(nèi)糞便排泄干凈后，再將蠶放在步驟(二)制作的吐絲平臺(tái)上，每平方米放置50頭蠶。24小時(shí)后，此時(shí)，家蠶已吐絲完畢，將該批家蠶轉(zhuǎn)移走。然后再重新放置50頭即將吐絲的家蠶，同樣24小時(shí)后，待家蠶吐絲完畢，然后轉(zhuǎn)移，再重新放50頭即將吐絲的家蠶。24小時(shí)后，將家蠶移去。將附有蠶絲蛋白的網(wǎng)輕輕取下，然后將網(wǎng)慢慢揭除，則即可獲得一定厚度的蠶絲蛋白生物支架。

如圖1所示，家蠶吐絲平臺(tái)由三部分構(gòu)成，下層基座為一個(gè)平整的平臺(tái)。中間一層為吸水層(具有吸水和透氣性強(qiáng)的紙或布)，最上層為網(wǎng)(尼龍網(wǎng)或棉紗網(wǎng))。

對(duì)上述方法制備獲得的蠶絲蛋白生物支架進(jìn)行性能測(cè)試，結(jié)果如下：

如圖2所示，其中a為家蠶蠶絲蛋白生物支架的宏觀圖，由普通數(shù)碼相機(jī)拍攝；b為家蠶蠶絲蛋白生物支架的微觀結(jié)構(gòu)圖，為電子掃描電鏡照片。從b圖可見，蠶絲蛋白生物支架為纖維狀的絲膠蛋白交織構(gòu)成的多孔的結(jié)構(gòu)。具有良好的透氣性。

蠶絲蛋白生物支架的孔隙率的測(cè)定采用超純水作為替代溶液。將干重質(zhì)量為w1的樣品置于超純水中，1小時(shí)后取出并去除樣品表面多余的水后稱得樣品的重量為w2，則樣品的孔隙率即為(w2-w1)/w2×100％。結(jié)果如圖3所示。

將干燥的蠶絲蛋白生物支架(質(zhì)量為wd)置于超純水中，24h后去除表面多余的水，取出其質(zhì)量為ws。則創(chuàng)傷敷料的水平衡為：結(jié)果如圖4所示。

對(duì)于測(cè)試蠶絲蛋白生物支架在不同ph環(huán)境中的降解，將蠶絲蛋白生物支架浸泡于不同ph值(ph3.0、ph7.4、ph11.0)的pbs溶液中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每日更換一次pbs溶液，在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)，取出、干燥、稱重。結(jié)果如圖5所示：蠶絲蛋白生物支架降解具有ph響應(yīng)性，其中在ph11.0的堿性條件下降解速率最快，8周的降解率為22％，而在中性(ph7.4)和酸性(ph3.0)環(huán)境中的降解率分別僅為11％和13％。另外，無論在堿性(ph11.0)，中性(ph7.4)和酸性(ph3.0)環(huán)境中條件下，蠶絲蛋白生物支架在不同ph環(huán)境下在第一天內(nèi)降解速度都較快，達(dá)6％左右，此后降解速度變慢。

蠶絲蛋白生物支架的拉伸強(qiáng)度由萬能材料測(cè)試機(jī)(instron5848microtester,usa)測(cè)得，結(jié)果如圖6所示，其拉伸強(qiáng)度高達(dá)9.6mpa。表明該創(chuàng)傷敷料具有良好的拉伸強(qiáng)度，能夠滿足手術(shù)縫合的需要且不易破損。

采用同步熱分析儀(netzschsta449f3,germany)檢測(cè)蠶絲蛋白生物支架熱重變化和在相變時(shí)熔點(diǎn)的變化。程序升溫范圍為40～800℃，每分鐘升溫10℃。如圖7所示：蠶絲蛋白生物支架的分解溫度為215.7℃、321.7℃和414.2℃。

蠶絲蛋白生物支架的x衍射分析，將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料剪成圓形片狀，采用轉(zhuǎn)靶x射線衍射儀(型號(hào)：d/max-rb,日本rigaku公司)測(cè)試。結(jié)果如圖8所示，蠶絲蛋白生物支架的2θ角為21.58°。

實(shí)施例2家蠶蠶絲蛋白生物支架用作細(xì)胞載體

(一)小鼠成皮膚成纖維細(xì)胞(nih3t3)蠶絲蛋白生物支架細(xì)胞活力檢測(cè)

(1)首先將蠶絲蛋白生物支架剪片狀，然后用滅菌pbs洗3次，再用75％乙醇浸泡1小時(shí)，最后用已滅菌pbs洗1次，置于室溫備用。

(2)將從細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞經(jīng)懸浮，吹散，種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后將步驟(1)中預(yù)處理的蠶絲蛋白生物支架轉(zhuǎn)入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔放置一片蠶絲蛋白生物支架。未放置蠶絲蛋白生物支架的細(xì)胞培養(yǎng)孔作為對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為dmem高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，co2濃度為5％，濕度為100％)中培養(yǎng)。

如圖9所示，采用cck8方法檢測(cè)細(xì)胞在種植后2天和3天后細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示：蛋白創(chuàng)傷敷料對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞(nih3t3)蠶絲蛋白生物支架和對(duì)照組在細(xì)胞活力方面沒有顯著性差異，結(jié)果表明，蠶絲蛋白生物支架具有良好的細(xì)胞相容性。

(二)蠶絲蛋白生物支架的細(xì)胞遷移檢測(cè)

所用細(xì)胞系為小鼠皮膚成纖維細(xì)胞(nih3t3)。

(1)首先將蠶絲蛋白生物支架剪圓形片狀，然后用滅菌pbs洗3次，再用75％乙醇浸泡1小時(shí)，最后用已滅菌pbs清洗1次，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

(2)將從細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞經(jīng)懸浮、吹散、種植于步驟(1)含有蠶絲蛋白生物支架的細(xì)胞培養(yǎng)板中，初始種植細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。待細(xì)胞貼壁后，將蠶絲蛋白生物支架轉(zhuǎn)移到新的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。再統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)板中各孔剩余的細(xì)胞數(shù)量，則得知蠶絲蛋白生物支架上初始種植細(xì)胞數(shù)量。

此后，每隔一天將蠶絲蛋白生物支架轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)板中一次，同時(shí)統(tǒng)計(jì)原培養(yǎng)板中相對(duì)應(yīng)的孔中剩余的細(xì)胞數(shù)并作好記錄。最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為dmem高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞放于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，co2濃度為5％，濕度為100％)中培養(yǎng)。

結(jié)果如圖10所示，在統(tǒng)計(jì)的24天內(nèi)細(xì)胞從蠶絲蛋白生物支架中遷移出的細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的現(xiàn)象。表明蠶絲蛋白生物支架具有良好的細(xì)胞相容性，能夠長(zhǎng)期支持細(xì)胞的存活、增殖與遷移。

(三)蠶絲蛋白生物支架的3d細(xì)胞培養(yǎng)

所用細(xì)胞系為gfp穩(wěn)轉(zhuǎn)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系shsy5y。

首先將蠶絲蛋白生物支架剪圓形片狀，然后用滅菌pbs洗3次，再用75％乙醇浸泡1小時(shí)，最后用已滅菌pbs洗1次，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。接下來將從細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞經(jīng)懸浮，吹散，種植于含有蠶絲蛋白生物支架的細(xì)胞培養(yǎng)板中。2天后將含有蠶絲蛋白生物支架的樣品取出用激光共聚焦進(jìn)行觀察和拍照。如圖11所示，蠶絲蛋白生物支架中的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。結(jié)果表明蠶絲蛋白生物支架具有良好的細(xì)胞相容性，可以作為細(xì)胞的載體。