本發(fā)明屬于涉及異甘草素的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種異甘草素作為制備改善或治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用及藥物組合物。
背景技術(shù)：
運(yùn)動(dòng)性疲勞是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究的永恒主題。關(guān)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的形成機(jī)制，人們提出了各種假說(shuō)，如能源物質(zhì)耗竭學(xué)說(shuō)、自由基傷害學(xué)說(shuō)、神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說(shuō)、乳酸堆積學(xué)說(shuō)及ca2+穩(wěn)態(tài)異常學(xué)說(shuō)等。
能源物質(zhì)耗竭學(xué)說(shuō)提出，能源物質(zhì)包括各種糖原、atp、磷酸肌酸等，機(jī)體在短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，會(huì)大量的動(dòng)用糖原等能源物質(zhì)分解，以提供能量，如果其中的一些含量下降，又得不到及時(shí)的補(bǔ)充，從而會(huì)引發(fā)運(yùn)動(dòng)性疲勞。
異甘草素，分子式:(e)-1-(2,4-二羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-2-丙烯-1-酮；4,2',4'-三羥基查耳酮。異甘草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為：
甘草中的黃酮類(lèi)成分可分為水溶性黃酮和脂溶性黃酮，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗?jié)儭⒖鼓[瘤、保護(hù)胃黏膜作用。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)甘草黃酮能夠抑制癌細(xì)胞的增殖。
異甘草素具有消除自由基，抗氧化的藥理活性，而異甘草素用于抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提出了異甘草素作為制備改善或治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提出一種基于該用途的藥物組合物。
一種異甘草素作為制備改善或治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述異甘草素的單次應(yīng)用量5～20mg/kg。
優(yōu)選的，所述異甘草素的單次應(yīng)用量10mg/kg。
一種改善或治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的藥物組合物，所述藥物組合物是以異甘草素為主要活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑，所述輔料為藥劑上任意可以接受的賦形劑，所述異甘草素和輔料的重量比為10:90～90:10。
例如，賦形劑可以為蔗糖、乳糖、葡萄糖的一種或幾種任意組合而成的穩(wěn)定劑。在具體實(shí)施例中，所述異甘草素和輔料的重量比可以為10:90、20:80、25:85、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、60:60、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10。
上述異甘草素作為制備改善或治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用及藥物組合物是發(fā)明人在研究異甘草素的過(guò)程中，經(jīng)過(guò)建立動(dòng)物模型，檢測(cè)試驗(yàn)小鼠樣本中的肝糖原、血乳酸、尿素氮的變化水平，證實(shí)了異甘草素具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用，并制備出了抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物組合物。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明中，發(fā)明人經(jīng)過(guò)建立動(dòng)物模型，檢測(cè)試驗(yàn)小鼠樣本中的肝糖原、血乳酸、尿素氮的變化水平，證實(shí)了異甘草素具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用，并制備出了抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物組合物。
實(shí)施例1：異甘草素對(duì)游泳訓(xùn)練小鼠抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的研究
一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雄性、四周齡、體重(22±2g)、spf級(jí)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):syxk(寧)。喂養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)飼料，自來(lái)水，室溫保持在(24士2)℃，濕度50-60％，每日光照與黑暗時(shí)間各12h。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3天。
二、實(shí)驗(yàn)藥品及儀器
藥品：異甘草素(純度98％，購(gòu)自阿拉丁試劑公司)，三氯醋酸(ar，麥克林試劑公司)，葡萄糖(ar，阿拉丁試劑公司)，羧甲基纖維素鈉(ar，麥克林試劑公司)，蒽酮(ar，阿拉丁試劑公司)；硫脲(ar，阿拉丁試劑公司)，氟化鈉(ar，阿拉丁試劑公司)，鎢酸鈉(ar，麥克林試劑公司)，三氯醋酸(ar，麥克林試劑公司)，硫酸銅(ar，阿拉丁試劑公司)，對(duì)羥基聯(lián)苯(ar，阿拉丁試劑公司)，乳酸鈣(ar，阿拉丁試劑公司)，濃硫酸(寧夏美信生物試劑公司)，乙醇(寧夏美信生物試劑公司)，naoh(寧夏美信生物試劑公司)。
儀器：sps202f型分析天平(中州電子衡器有限公司)，model1510型超聲波清洗器(沃瓏儀器設(shè)備)，l-530型低溫離心機(jī)(塞維亞科技發(fā)展公司)，uv-2901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(hitachi公司)，bs-220型邁瑞全自動(dòng)生化分析儀(武漢盛世達(dá)設(shè)備)。
三、試驗(yàn)方法
1.試驗(yàn)用藥配制
每隔三天按照試驗(yàn)小鼠的實(shí)際重量配制異甘草素溶液儲(chǔ)存于4℃的冰箱中備用，所述異甘草素溶液配制的操作為：每1ml羧甲基纖維素鈉中加入1mg異甘草素，用于c組實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃使用。
2.實(shí)驗(yàn)分組
取實(shí)驗(yàn)小鼠60只、雄性、四周齡、體重(22±2g)、spf級(jí)、正常飼養(yǎng)以及每天適應(yīng)性游泳20分鐘，三天后，按體重隨機(jī)分為三組：a(安靜對(duì)照組)、b(耐力訓(xùn)練組，即耐力訓(xùn)練+0.5％羧甲基纖維素鈉)、c(用藥組，即耐力訓(xùn)練+異甘草素溶液組)，每組20只。
由于每日小鼠體重的變化，每組實(shí)驗(yàn)小鼠每日下午1：00給藥，即對(duì)c組小鼠灌異甘草素溶液，灌藥用量按照小鼠體重每千克灌10mg·kg-1,10mg·kg-1為小鼠每千克體重灌的異甘草素溶液中異甘草素的量為10mg；對(duì)a組和b組小鼠分別用等體積的0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃，連續(xù)6周，室溫為25±2℃。每日更換清潔墊料，每日更換清潔飲水瓶.每天稱(chēng)小鼠體重一次并記錄。
3.小鼠耐力訓(xùn)練
a組只灌胃不進(jìn)行游泳訓(xùn)練；b組、c組小鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳池中分別進(jìn)行每日遞進(jìn)式耐力訓(xùn)練，即游泳鍛煉，水深為40～50cm，水溫為25士2℃。每周進(jìn)行5天訓(xùn)練，每天上午和下午各1次，上午9:00am開(kāi)始訓(xùn)練，下午3：00pm開(kāi)始訓(xùn)練，訓(xùn)練量如下表1：
表1耐力訓(xùn)練時(shí)間表
4.小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)
按上述時(shí)刻表每天對(duì)各b,c組小鼠進(jìn)行兩次游泳訓(xùn)練，在訓(xùn)練第六周后進(jìn)行力竭游泳運(yùn)動(dòng)并記錄小鼠力竭游泳的時(shí)間，如下表2：
表2為試驗(yàn)小鼠力竭游泳時(shí)間
注：b組與a組比較p＜0.01；c與b組比較p＜0.01。
由表2中可得出，c組試驗(yàn)小鼠的力竭游泳時(shí)間比b組和a組都長(zhǎng)，b組試驗(yàn)小鼠的力竭游泳時(shí)間比a組的長(zhǎng)，可見(jiàn)，異甘草素溶液能夠明顯延長(zhǎng)小鼠力竭游泳的時(shí)間，而游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以直接反映小鼠疲勞的程度，因此，說(shuō)明異甘草素能夠改善耐力訓(xùn)練小鼠的疲勞癥狀，提高小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生，具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的效果。
5.小鼠取樣取材
宰殺小鼠前對(duì)使用器械進(jìn)行消毒滅菌。
在力竭游泳訓(xùn)練之后的第二天，對(duì)a、b、c組試驗(yàn)小鼠進(jìn)行分組，各分為不游泳的10只和游泳的10只；
對(duì)每組的不游泳的5只小鼠分別直接取眼球血，將眼球血預(yù)留80μl的全血，剩下的全血必須立即在3000rpm/min條件下，用低溫離心機(jī)(4℃)，離心15min，小心吸取血清保存于-80℃的冰箱，之后將每組的不游泳的10只小鼠處死，即刻用75％酒精為小鼠皮膚消毒，取肝臟，用4℃的生理鹽水清洗血液，用濾紙吸干生理鹽水，再稱(chēng)重，將其迅速放于液氮中速凍；
對(duì)每組的游泳的10只小鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練100min，然后分別取眼球血，將眼球血預(yù)留80μl的全血，剩下的全血必須立即在3000rpm/min條件下，用低溫離心機(jī)(4℃)，離心15min，小心吸取血清保存于-80℃的冰箱，之后將每組的游泳的10只小鼠處死，即刻用75％酒精為小鼠皮膚消毒，取肝臟，用4℃的生理鹽水清洗血液，用濾紙吸干生理鹽水，再稱(chēng)重，將其迅速放于液氮中速凍；
6.檢測(cè)指標(biāo)
本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)異甘草素對(duì)耐力訓(xùn)練小鼠的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的有關(guān)指標(biāo)。其中檢測(cè)指標(biāo)主要包括：肝糖原、血乳酸(bla)和尿素氮(bun)。
(1)酮一硫酸法測(cè)定小鼠肝糖原
試劑配制：
配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取0.01g的葡萄糖，溶解于10ml蒸餾水中。
配制5％三氯醋酸(tca)：準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0g三氯醋酸，溶解于100ml蒸餾水中。
配制蒽酮試劑：先配制72％的濃硫酸溶液，72％的濃硫酸溶液配制時(shí)，先在燒杯中加入140ml蒸餾水，邊攪邊緩緩加入比重為1.84的濃硫酸360ml，等到h2so4的溫度降到80-90℃時(shí)加入0.25g的蒽酮和5g的硫脲，搖勻，待冷卻后儲(chǔ)存于冰箱。
檢測(cè)步驟：
對(duì)c組試驗(yàn)小鼠的肝糖原的提取計(jì)算：精確稱(chēng)取c組的不游泳的10只小鼠的肝臟組織各100mg，分別加入8mltca，然后勻漿1min，以3000轉(zhuǎn)/min的速度離心15min，轉(zhuǎn)移上清液至另一支試管內(nèi)；取上清液1ml于10ml的離心管中，每管加入4ml95％乙醇，充分混勻，蓋緊離心管，保持豎立，常溫下過(guò)夜，以3000轉(zhuǎn)/min的速度離心15min；小心棄去上清液，倒立離心管10min至管內(nèi)無(wú)液滴存在；加入2ml蒸餾水，確保洗下管壁糖原，振蕩離心管使糖原完全溶解；向各管加入10ml蒽酮試劑，充分混合，待溫度降至涼水溫度后，再浸于沸水中加熱15min，轉(zhuǎn)移到冷水浴冷卻，在620nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度，得到第一組吸光度值。
為了數(shù)據(jù)更加精確，做三組平行實(shí)驗(yàn)，即，第二組平行試驗(yàn)為：繼續(xù)精確稱(chēng)取c組的不游泳的10只小鼠的剩余肝臟組織各100mg，重復(fù)上述步驟，測(cè)定吸光度，得到第二組吸光度值；第三組平行試驗(yàn)為：再次精確稱(chēng)取c組的不游泳的10只小鼠的剩余肝臟組織各100mg，重復(fù)上述步驟，測(cè)定吸光度，得到第三組吸光度值；
將上述三組平行試驗(yàn)的三組吸光度值代入肝糖原公式計(jì)算，再將c組的三組肝糖原數(shù)求均值得到肝糖原數(shù)。
作為對(duì)比試驗(yàn)方案，也可以分別配制空白管、標(biāo)準(zhǔn)管：
空白管：取2ml蒸餾水于干凈的試管中。
標(biāo)準(zhǔn)管：取葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5ml和蒸餾水1.5ml于標(biāo)準(zhǔn)管中，混勻。
然后在空白管和標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入10ml蒽酮試劑，充分混合，待溫度降至涼水溫度后，再浸于沸水中加熱15min，轉(zhuǎn)移到冷水浴冷卻，在620nm波長(zhǎng)下，分別測(cè)定空白管吸光度和標(biāo)準(zhǔn)管吸光度。
同理，對(duì)a組、b組的試驗(yàn)小鼠的肝糖原的提取計(jì)算方法同于c組的方法，也對(duì)不游泳的10只小鼠的肝臟組織采用同于c組的方法提取計(jì)算肝糖原。如下表3。
肝糖原公式為：
每100克肝(肌)組織中糖原的毫克數(shù)＝du/ds×0.5×提取液體積/肝組織克數(shù)×100×0.9，式中，
ds：標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；
du：樣品管吸光度；
提取液體積為8ml；
肝組織克數(shù)為0.1g；
0.9為將葡萄糖換算成糖原的系數(shù)；
0.5為0.5ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液中葡萄糖的含量。
(2)用自配試劑方法測(cè)定小鼠血乳酸含量
試劑配制：
10％鎢酸鈉：稱(chēng)取10g鎢酸鈉溶解于100ml蒸餾水中。
1/3mol/l硫酸：量取濃硫酸0.8ml于50ml容量瓶，用蒸餾水定容。
1％naf溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.125gnaf溶解于100ml蒸餾水中。
10％的三氯醋酸：準(zhǔn)確量取三氯醋酸9.9ml，溶解于100ml蒸餾水中。
cuso4溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.42gcuso4，溶于10ml蒸餾水中。
蛋白沉淀劑：將1/3mol/l的硫酸、10％的鎢酸鈉、蒸餾水按照體積比為1:1:1的比例混合。
蛋白沉淀劑-naf混合液：按體積分別取10ml1％naf和30ml蛋白沉淀劑混合。
1.5％對(duì)羥基聯(lián)苯溶液：稱(chēng)取對(duì)羥基聯(lián)苯1.5g溶解于100ml熱的0.5％的naoh中。
乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1g/l)：稱(chēng)取0.171g乳酸鈣，加入10％三氯醋酸中定容至100ml。
乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(0.01g/l)：吸取1.0ml乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，溶解于100ml容量瓶，用蒸餾水定容。
對(duì)c組試驗(yàn)小鼠的血乳酸的檢測(cè)步驟：
吸取0.48ml1％naf溶液于5ml離心管中，加入c組游泳的小鼠的全血20μl?；靹蚝?，加入1.5ml蛋白沉淀劑，用力振蕩混勻，在3000轉(zhuǎn)/min條件下，離心10min，取上清液，30℃水浴中加熱30min，再置于沸水浴中90s，待冷卻后，在560nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度值，即c組的吸光度值a樣品管，然后依據(jù)血乳酸含量計(jì)算公式計(jì)算得到c組血乳酸含量。
作為對(duì)比試驗(yàn)方案，也可以分別配制空白管、標(biāo)準(zhǔn)管，如下表4
表4血乳酸測(cè)定試驗(yàn)方案配制
將標(biāo)準(zhǔn)管至于30℃水浴中加熱30min，再置于沸水浴中90s，待冷卻后，在560nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度值，即c組的吸光度值a標(biāo)準(zhǔn)管，用于計(jì)算每一組的血乳酸含量。
同理，對(duì)a、b組試驗(yàn)小鼠的血乳酸的檢測(cè)步驟同于c組的檢測(cè)步驟，測(cè)定a、b組吸光度值，即a組的a樣品管、b組的a樣品管，計(jì)算得到a、b組血乳酸含量。如下表3。
血乳酸含量計(jì)算公式為：
血乳酸(mg/l)＝a樣品管/a標(biāo)準(zhǔn)管×100×10
(3)生化指標(biāo)測(cè)定
本實(shí)驗(yàn)中，用全自動(dòng)生化分析儀分別對(duì)a、b、c組中游泳的試驗(yàn)小鼠的血清進(jìn)行分析測(cè)定，進(jìn)而對(duì)各組試驗(yàn)小鼠的尿素氮(bun)的含量進(jìn)行測(cè)定。如表3。
7.試驗(yàn)結(jié)果
表3肝糖原、尿素氮和血乳酸
注：c組與b組肝糖原比較p＜0.01；c組與b組尿素氮比較p＜0.05；c組與b組血乳酸比較p＜0.01。
由表3可知，c組的肝糖原含量高于b組的肝糖原含量，b組的肝糖原含量高于a組的肝糖原含量，可見(jiàn)，從能量代謝的角度表明異甘草素能提高運(yùn)動(dòng)耐力，有良好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞效果。
c組的血乳酸含量低于b組的血乳酸含量，可見(jiàn)，從乳酸堆積學(xué)說(shuō)角度來(lái)推斷，異甘草素能抑制或降低血乳酸的產(chǎn)生，或能夠分解血乳酸，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力，有良好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞效果。
c組的尿素氮含量低于b組的尿素氮含量，可見(jiàn)，從數(shù)據(jù)可推斷，異甘草素能抑制或降低尿素氮的產(chǎn)生，或能夠分解尿素氮，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力，有良好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞效果。
以上所揭露的僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，當(dāng)然不能以此來(lái)限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解實(shí)現(xiàn)上述實(shí)施例的全部或部分流程，并依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于發(fā)明所涵蓋的范圍。