本發(fā)明涉及干細(xì)胞分泌物，尤其是一種用于小型寵物的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液及其制備方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，msc)是干細(xì)胞的一種，因能分化為間質(zhì)組織而得名。msc來(lái)源于中胚層間充質(zhì)，主要存在于生物體全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于胎兒和成體的骨髓、脂肪、臍帶、臍帶血中，其中臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量高，純凈，數(shù)量多。間充質(zhì)干細(xì)胞具有干細(xì)胞的共性，即自我更新、多向分化、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)和歸巢的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞具有亞全能分化潛能，在特定的體內(nèi)、外環(huán)境下能夠誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)、心臟、肝臟、骨、軟骨、肌腱、脂肪、上皮等多種組織細(xì)胞。

間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中可分泌內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vegf)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(scf)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(egf)、粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、巨噬細(xì)胞擊落刺激因子(m-csf)、白細(xì)胞介素(il)等多種細(xì)胞因子，發(fā)揮重要的旁分泌作用，并可產(chǎn)生一系列細(xì)胞外基質(zhì)分子如粘連蛋白、層粘連蛋白、ⅰ-ⅳ型膠原、蛋白聚糖等。這些旁分泌因子參與機(jī)體組織損傷修復(fù)，抑制受損組織細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損組織細(xì)胞增殖，抗炎癥反應(yīng)以及抑制損傷部位引發(fā)炎癥的相關(guān)細(xì)胞增殖和遷移等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種用于小型寵物的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液及其制備方法，利用高濃度的人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，為間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用提供高效、快捷、方便的途徑。利用間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子為治療免疫力低下，骨關(guān)節(jié)炎，骨營(yíng)養(yǎng)不良性關(guān)節(jié)病，肌腱損傷，脊髓損傷，腎臟、肝臟等器官的衰竭與損傷，提供了安全、有效、使用方便的治療藥物。對(duì)于小型寵物延緩衰老，提高生活質(zhì)量與身體機(jī)能都有顯著的功效。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于小型寵物的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液的制備方法，包括以下步驟：

(1)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)中選取p2-p6的人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；

(2)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％時(shí)，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(5)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(7)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(8)按體積份數(shù)5％-10％向步驟(7)中得到的上清中加入的量百分比濃度為20％的人血白蛋白，混勻后灌注至無(wú)菌轉(zhuǎn)移袋，得到含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液。

所述人間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、月經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞或牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

上述的制備方法得到的用于小型寵物的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液。

本發(fā)明的有益效果是：將人間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，使得細(xì)胞分泌的各種活性成分的濃度都得到了提高，并且在短時(shí)間內(nèi)使用饑餓上清重復(fù)饑餓間充質(zhì)干細(xì)胞，使細(xì)胞提取物濃度進(jìn)一步增加，高濃度的人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物可以抑制骨、心肌、視網(wǎng)膜等受損組織細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損組織細(xì)胞增殖，降低炎癥反應(yīng)，抑制組織細(xì)胞的纖維化，提高骨愈合后機(jī)械強(qiáng)度和新生骨礦物質(zhì)含量，促進(jìn)肺損傷修復(fù)并增加肺血管數(shù)量。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的方法培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞圖；

圖2為實(shí)施例1不同饑餓次數(shù)人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物中有效因子分泌量比較圖；

圖3為實(shí)施例1各組小鼠建模后第3、7、14天scr含量變化；

圖4為實(shí)施例1各組小鼠建模后第3、7、14天bun含量變化；

圖5為實(shí)施例2的方法培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞圖；

圖6為實(shí)施例2不同饑餓次數(shù)人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物中有效因子分泌量比較圖；

圖7為實(shí)施例2各組小鼠建模后第3、7、14天后alt含量變化；

圖8為實(shí)施例2各組小鼠建模后第3、7、14天后ast含量變化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

本發(fā)明的用于小型寵物的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液的制備方法，包括以下步驟：

(1)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)中選取p2-p6的人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；

(2)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％時(shí)，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(5)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(7)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(8)按體積份數(shù)5％-10％向步驟(7)中得到的上清中加入的量百分比濃度為20％的人血白蛋白，混勻后灌注至無(wú)菌轉(zhuǎn)移袋，得到含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液，放于4℃冰箱中保存待用。

上述的制備方法得到的用于小型寵物的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液。

制備的高濃度含人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液可用于修復(fù)家庭小型寵物心臟、腎臟、肝臟等器官的衰老與損傷。

人間充質(zhì)干細(xì)胞在饑餓培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)分泌大量的趨化因子、生長(zhǎng)因子和激素等，這些因子可以抑制受損組織細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損組織細(xì)胞增殖，降低炎癥反應(yīng)，抑制組織細(xì)胞的纖維化，從而提升家庭小型寵物的免疫力及生活質(zhì)量，提高身體機(jī)能，延緩衰老。在家庭小型寵物的常見(jiàn)癥狀中，如骨關(guān)節(jié)炎，骨營(yíng)養(yǎng)不良性關(guān)節(jié)病，肌腱損傷，脊髓損傷，腎臟、肝臟等器官的衰竭與損傷，都有修復(fù)與愈合的作用。

實(shí)施例1

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)中選取p4的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞總數(shù)4.2*10⁷。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的60％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：9*10⁶，接種細(xì)胞三瓶)、40％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：6*10⁶，接種細(xì)胞兩瓶)、20％(接種細(xì)胞數(shù)：3*10⁶，接種細(xì)胞一瓶)，培養(yǎng)體系均為40ml。培養(yǎng)細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基為無(wú)酚紅dmem/df12和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細(xì)胞瓶為t-175培養(yǎng)瓶。細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳濃度5％；

(2)培養(yǎng)30小時(shí)，此時(shí)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到75％時(shí)，見(jiàn)圖1，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，每瓶用40ml復(fù)方電解質(zhì)注射液(中國(guó)大冢制藥有限公司生產(chǎn)的復(fù)方電解質(zhì)葡萄糖mg3注射液)進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)18小時(shí)后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(5)饑餓培養(yǎng)18小時(shí)后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(7)饑餓培養(yǎng)24小時(shí)后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(8)檢測(cè)步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)的備用上清細(xì)胞因子含量，見(jiàn)圖2。

(9)向步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)的備用上清中分別加入體積分?jǐn)?shù)5％的人血白蛋白(質(zhì)量百分比濃度為20％)，混勻后灌注至無(wú)菌轉(zhuǎn)移袋，放于4℃冰箱中保存待用,即分別得到饑餓一次、饑餓兩次和饑餓三次的高濃度含人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液。

(10)用戊巴比妥鈉溶液建立急性腎損傷(aki)小鼠模型，取90只小鼠隨機(jī)分為6組，每組15只，分別為正常對(duì)照組、aki組、aki+復(fù)方電解質(zhì)注射液組、aki+修復(fù)注射液-1組、aki+修復(fù)注射液-2組，aki+修復(fù)注射液-3組。

(11)正常對(duì)照組不作任何處理，正常飼養(yǎng)；aki組于夾閉雙側(cè)腎蒂后再開放的同時(shí)腹腔注射0.2ml生理鹽水；aki+復(fù)方電解質(zhì)注射液組于夾閉雙側(cè)腎蒂后再開放的同時(shí)腹腔注射0.2ml復(fù)方電解質(zhì)注射液；aki+修復(fù)注射液-1組、aki+修復(fù)注射液-2組，aki+修復(fù)注射液-3組于夾閉雙側(cè)腎蒂后再開放的同時(shí)分別腹腔內(nèi)注射0.2ml步驟(9)中饑餓一次、饑餓二次和饑餓三次的含高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液。各組小鼠在通風(fēng)、溫度18-25℃、濕度60％-70％環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。各組于建模后0d、3d、7d、14d分別隨機(jī)處死5只，取血后分離血清，檢測(cè)各組血清肌酐(scr)和血尿素氮(bun)水平，見(jiàn)圖3和圖4。圖2表明，人間充質(zhì)干細(xì)胞饑餓三次培養(yǎng)，與饑餓一次、饑餓兩次相比，各種細(xì)胞因子分泌量顯著提高；圖3和圖4表明，急性腎損傷小鼠在分別注射步驟(9)中饑餓一次、饑餓二次和饑餓三次的含高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液后，血清肌酐(scr)和血尿素氮(bun)水平呈明顯下降趨勢(shì)，急性腎損傷程度明顯改善，并且注射饑餓三次的含高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液的小鼠，血清肌酐(scr)和血尿素氮(bun)數(shù)值已接近正常水平，急性腎損傷改善程度最為顯著。

實(shí)施例2

(1)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)中選取p5的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞總數(shù)3.84*10⁷。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：8*10⁶，接種細(xì)胞三瓶)、35％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：5.6*10⁶，接種細(xì)胞兩瓶)、20％(接種細(xì)胞數(shù)：3.2*10⁶，接種細(xì)胞一瓶)，培養(yǎng)體系均為40ml。培養(yǎng)細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基為無(wú)酚紅amem和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細(xì)胞瓶為t-175培養(yǎng)瓶。細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳濃度5％；

(2)培養(yǎng)35小時(shí)，此時(shí)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％時(shí)，見(jiàn)圖5，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，每瓶用40ml復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)18小時(shí)后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，每瓶用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(5)饑餓培養(yǎng)18小時(shí)后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到75％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(7)饑餓培養(yǎng)24小時(shí)后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(8)檢測(cè)步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)的細(xì)胞因子含量，見(jiàn)圖6。

(9)向步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)的備用上清中分別加入體積分?jǐn)?shù)5％的人血白蛋白(質(zhì)量百分比濃度為20％)，混勻后灌注至無(wú)菌轉(zhuǎn)移袋，放于4℃冰箱中保存待用,即分別得到饑餓一次、饑餓兩次和饑餓三次的含高濃度人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液。

(10)用ccl4橄欖油溶液建立急性肝衰竭(alf)小鼠模型，取90只小鼠隨機(jī)分為6組，每組15只，分別為正常對(duì)照組、alf組、alf+復(fù)方電解質(zhì)注射液組、alf+修復(fù)注射液-1組、alf+修復(fù)注射液-2組，alf+修復(fù)注射液-3組。

(11)正常對(duì)照組不作任何處理，正常飼養(yǎng)；alf組腹腔內(nèi)注射0.2ml生理鹽水；alf+復(fù)方電解質(zhì)注射液組注射0.2ml復(fù)方電解質(zhì)注射液；alf+修復(fù)注射液-1組、alf+修復(fù)注射液-2組，alf+修復(fù)注射液-3組分別注射0.2ml步驟(9)中饑餓一次、饑餓二次和饑餓三次的高濃度含人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液。各組小鼠在通風(fēng)、溫度18-25℃、濕度60％-70％環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。各組于建模后0d、3d、7d、10d分別隨機(jī)處死5只，取血后分離血清，檢測(cè)各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)水平，見(jiàn)圖7和圖8。圖6表明，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞饑餓三次培養(yǎng)，與饑餓一次、饑餓兩次相比，各種細(xì)胞因子分泌量顯著提高；圖7和圖8表明，急性肝衰竭小鼠在分別注射步驟(9)中饑餓一次、饑餓二次和饑餓三次的含高濃度人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液后，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)水平呈明顯下降趨勢(shì)，急性肝衰竭程度明顯改善，并且注射饑餓三次的含高濃度人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的修復(fù)注射液的小鼠，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)數(shù)值已接近正常水平，急性肝衰竭改善程度最為顯著。

綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。