本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一類n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物在制備預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞活性異常導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
破骨細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞中的單核前體細(xì)胞，在細(xì)胞因子如巨噬細(xì)胞集落刺激因子和核因子κb受體活化因子配體的調(diào)節(jié)下分化形成活化的破骨細(xì)胞，行使骨吸收的功能。破骨細(xì)胞活性異常將導(dǎo)致多種疾病如癌癥骨轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙周炎、牙齒脫落、paget’s骨病、佝僂病、骨巨細(xì)胞瘤以及骨髓瘤骨病造成的骨破壞。
絕大部分乳腺癌、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為溶骨性缺損，轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞分泌大量刺激破骨細(xì)胞活化的因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收作用，破壞骨的形成與吸收之間的平衡從而表現(xiàn)為溶骨性骨缺損?？梢酝ㄟ^抑制破骨細(xì)胞活性，阻斷病理性骨溶解而起治療作用。目前臨床上用于治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的藥物主要是雙磷酸鹽及rankl抗體藥物，如帕米膦酸二鈉等，其機(jī)制是因?yàn)榭梢砸种破乒羌?xì)胞分化以及促進(jìn)破骨細(xì)胞及癌細(xì)胞的凋亡，但用藥不便，使用后還會出現(xiàn)額骨壞死現(xiàn)象，并抑制骨形成；抗體藥物rankl抑制劑denosumab2010年已經(jīng)于美國上市，批準(zhǔn)用于骨質(zhì)疏松癥的治療和乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤治療的臨床研究，但抗體藥物因價(jià)格昂貴等因素臨床應(yīng)用受到一定限制。
骨質(zhì)疏松患者骨組織的破骨細(xì)胞形成遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于常人，從而導(dǎo)致骨吸收作用過度活躍，這是骨質(zhì)疏松的重要病理機(jī)制之一臨床上有多種抑制破骨細(xì)胞形成的骨質(zhì)疏松治療藥物，但多數(shù)藥物對骨質(zhì)疏松的作用依然有限，而且部分藥物毒副作用較大，不良反應(yīng)較多。如雙膦酸鹽類生物副作用如前所述；雌激素及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑主要針對絕經(jīng)初期的女性，且具有增加深靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)等；降鈣素類似物可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)。因此尋找更高效特異的破骨細(xì)胞抑制劑用于治療破骨細(xì)胞異常導(dǎo)致的相關(guān)疾病具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一類n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物在制備預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞活性異常導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途；所述n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物具有如下結(jié)構(gòu)：
其中，r1不存在或r1為萘環(huán)上的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選自如下的取代基：鹵素、羥基、c1～c6烷基、c1～c4烷氧基、氰基；r2不存在或r2為苯環(huán)上的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選自如下的取代基：鹵素、羥基、c1～c6烷基、c1～c4烷氧基、氰基；
優(yōu)選地，r1不存在或?yàn)檩镰h(huán)上的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選自如下的取代基：羥基、c1～c6烷基、c1～c4烷氧基、氰基；r2不存在或r2為苯環(huán)上的一個(gè)或多個(gè)選自如下的取代基：鹵素、羥基、c1～c6烷基、c1～c4烷氧基；
更優(yōu)選地，r1不存在或?yàn)檩镰h(huán)上的1～2個(gè)獨(dú)立選自如下的取代基：羥基、甲基、乙基、甲氧基、氰基；r2不存在或r2為苯環(huán)上的1～2個(gè)獨(dú)立選自如下的取代基：鹵素、羥基、甲基、甲氧基；
本發(fā)明中所述鹵素為氟、氯、溴或碘；優(yōu)選為氯；
進(jìn)一步優(yōu)選地，n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物選自如下具體的化合物：
所述n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物可以參考德國專利公開號為de573723的專利進(jìn)行制備。
所述n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物也可以按照如下方法進(jìn)行制備：將化合物a溶解到二氯亞砜中，加熱回流1～2h，將二氯亞砜旋干后，用二氯甲烷溶解，再加入化合物b和三乙胺，室溫?cái)嚢?～6小時(shí)后，過濾得到本發(fā)明所述n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物(即式i所示化合物)，反應(yīng)式如下：
其中，r1和r2的定義如前所述。
附圖說明
圖1為不同濃度(1μm，5μm，10μm)的n-(4-氯苯基)--3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)(簡稱nas-e)干預(yù)骨髓破骨前體細(xì)胞破骨分化后，通過trap對破骨細(xì)胞進(jìn)行染色的結(jié)果；
圖2為不同濃度(1μm，5μm，10μm)的n-(4-氯苯基)--3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)干預(yù)骨髓破骨前體細(xì)胞破骨分化后，通過甲苯胺藍(lán)對骨片進(jìn)行染色，并統(tǒng)計(jì)骨吸收的面積。
圖3為不同濃度(5μm，10μm)的n-(4-氯苯基)--3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)對破骨分化及破骨行使功能時(shí)關(guān)鍵基因nfatc1，trap，v-atpase2，cathepsink的mrna表達(dá)水平的影響。
m-csf和rankl是破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵因子，分別為：巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor，m-csf)和核因子κb受體活化因子配體(receptoractivatorfornuclearfactor-κbligand，rankl)。
***代表顯著性差異。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但該實(shí)施例并非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
制備實(shí)施例
實(shí)施例1化合物1～8
化合物1～8均為現(xiàn)有技術(shù)中已知的化合物，可通過購買或參照現(xiàn)有文獻(xiàn)制備得到。其中：化合物1，cas號為：92-78-4，購買自tci；化合物2參照中國專利公開cn105461583a制備；化合物3參照德國專利公開de573723制備；化合物4參照專利公開wo2010/48302a1制備；化合物5參照論文indiajournalofchemistry-sectionborganicandmedicinalchemistry,2008,vol.47,1587-1590制備；化合物6參照德國專利公開de573723制備；化合物7和化合物8參照論文analyticalchemistry,1994,vol.66,1347-1353制備。
實(shí)施例2n-(4-氯苯基)-4-氰基-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物9)
將4-氰基-3-羥基-2-萘甲酸(213mg，1mmol)溶解到二氯亞砜(2ml)中，加熱回流1小時(shí)，將二氯亞砜旋干后，用二氯甲烷溶解，再加入4-氯苯胺(140mg，1.1mmol)和三乙胺(1ml)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，過濾得產(chǎn)物321mg(產(chǎn)率99％)。
熔點(diǎn)：256-257℃.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.29(s,1h),8.91(s,1h),8.07(d,j＝8.0hz,1h),7.92(d,j＝8.0hz,1h),7.82(t,j＝7.2hz,1h),7.79(d,j＝8.8hz,2h),7.57(t,j＝7.2hz,1h),7.50(d,j＝8.8hz,2h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ166.5,136.7,135.2,134.7,131.3,130.1,128.8,128.4,125.3,124.8,122.8,122.4,119.6,116.0,93.0.
實(shí)施例3n-(4-氯苯基)-4-羥基-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物10)
合成方法參照實(shí)施例2，將“4-氰基-3-羥基-2-萘甲酸(1mmol)”替換為“3,4-二羥基-2-萘甲酸(1mmol)”，收率17％。
熔點(diǎn)：165-166℃.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.96(s,1h),10.78(s,1h),9.42(s,1h),8.09(s,1h),8.05(d,j＝8.4hz,1h),7.86(d,j＝8.4hz,1h),7.80(d,j＝8.8hz,2h),7.50(t,j＝8.0hz,1h),7.47(d,j＝8.8hz,2h),7.37(t,j＝8.0hz,1h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ167.8,140.7,138.7,137.1,128.7,128.6,128.0,126.9,126.8,126.6,124.0,122.6,120.9,119.8,119.2.
實(shí)施例4n-(4-氯苯基)-4-羥基-3-乙基-2-萘甲酰胺(化合物11)
合成方法參照實(shí)施例2，將“4-氰基-3-羥基-2-萘甲酸(1mmol)”替換為“3-羥基-4乙基-2-萘甲酸(1mmol)”，收率59％。
熔點(diǎn)：156-157℃，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.39(s,1h),8.16(s,1h),7.98(s,1h),7.95(d,j＝8.8hz,1h),7.80(d,j＝8.4hz,1h),7.60(d,j＝8.8hz,2h),7.56(td,j＝8.4,1.2hz,1h),7.40(d,j＝8.8hz,2h),7.35(t,j＝8.0hz,1h),3.14(q,j＝7.6hz,2h),1.28(t,j＝7.6hz,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ168.2,152.9,135.0,134.8,130.1,129.0,128.8,128.2,126.4,125.2,124.4,123.2,122.5,121.9,116.2,17.6,13.5.
測試實(shí)施例抑制破骨細(xì)胞形成方面的作用
1、材料：
1)細(xì)胞株：骨髓破骨前體細(xì)胞取自c57bl/6小鼠股骨與脛骨髓腔；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞mmsc、成骨細(xì)胞細(xì)胞株mc3t3購自上海中科院細(xì)胞庫。
2)液體培養(yǎng)基：α-mem培養(yǎng)基(gibco，usa)；胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；、dmso、甲苯胺藍(lán)(sigma公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；rnaisoreagent、反轉(zhuǎn)錄和pcr試劑盒(大連takara公司)。主要儀器：co2培養(yǎng)箱(heraeus，德國)；鋸式切片機(jī)(leicasp1600德國)；倒置熒光顯微鏡(olympus，日本)；超聲波清洗機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所)。
2、實(shí)驗(yàn)方法：
1)受試細(xì)胞株的制備：
c57bl/6小鼠斷頸處死，75％酒精浸泡消毒，無菌條件下剝離四肢長骨(股骨、脛骨)，去除附著的軟組織，縱向切開長骨，輕刮骨髓腔，用培養(yǎng)液(α-mem培養(yǎng)基+10％胎牛血清)反復(fù)沖洗骨髓腔內(nèi)表面，使細(xì)胞徹底脫落，細(xì)胞懸液用200目細(xì)胞篩過濾，細(xì)胞定量后接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)(1ml/孔)，于5％co2和飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜，次日換含1×10-8mol·l-新鮮培養(yǎng)液(α-mem培養(yǎng)基+10％胎牛血清)。
2)n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物破骨細(xì)胞trap活性測試：
破骨細(xì)胞前體細(xì)胞以每孔5000個(gè)的濃度接種到96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)過夜。將n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物(化合物1～11)分別以培養(yǎng)基(含30ng/mlm-csf和50ng/mlrankl)配制成濃度10μmol/l，每孔加入100μl，陰性對照組每孔加入等量培養(yǎng)基(含30ng/mlm-csf和50ng/mlrankl)。骨髓破骨前體細(xì)胞培養(yǎng)5天后棄培養(yǎng)液，pbs輕洗3次，然后按照trap酶活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，在530nm處測定吸光度值，最后換算出酶活力。以96孔培養(yǎng)板的1孔細(xì)胞在37℃與底物作用，1min產(chǎn)生1nmol的游離酚表示1個(gè)酶活力單位。
選取n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物中的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)進(jìn)一步活性測試：
3)mtt法檢測n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)對骨髓破骨前體細(xì)胞存活率的影響：
破骨細(xì)胞前體細(xì)胞以每孔5000個(gè)的濃度接種到96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)過夜。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組；其中，實(shí)驗(yàn)組：將n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)以培養(yǎng)基(含30ng/mlm-csf和50ng/mlrankl)配分別制成濃度1、5和10μmol/l，每孔加入100μl；陰性對照組：每孔加入等量培養(yǎng)基(含30ng/mlm-csf和50ng/mlrankl)。培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt(5g·l－1)20μl，反應(yīng)2h后，小心甩去培養(yǎng)液，每孔加入100μldmso，震蕩10分鐘充分溶解，酶標(biāo)儀在492nm波長檢測吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率(pr％)＝a實(shí)驗(yàn)組/a陰性對照組×100％。
4)n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)破骨細(xì)胞trap活性測試：
骨髓破骨前體細(xì)胞培養(yǎng)5天后棄培養(yǎng)液，pbs輕洗3次，然后按照trap酶活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，在530nm處測定吸光度值，最后換算出酶活力。以96孔培養(yǎng)板的1孔細(xì)胞在37℃與底物作用，1min產(chǎn)生1nmol的游離酚表示1個(gè)酶活力單位。
5)n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)破骨細(xì)胞trap染色：
將骨髓單核細(xì)胞以每孔5000個(gè)的濃度接種到96孔板，每孔100μl，加入n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)使其終濃度分別為1、5、10μmol·l-1，置于5％co2，37℃孵育箱中預(yù)孵育4天，每隔2天換液(吸掉舊培養(yǎng)基，補(bǔ)充100μl含相同濃度藥物新培養(yǎng)基)。4天后破骨細(xì)胞出泡，pbs洗2次，10％多聚甲醛固定5分鐘，然后用pbs洗1次，晾干。在含有0.8moll-1ph5.0醋酸鈉緩沖液，0.1gl-1萘酚as-bi磷酸鹽，0.6gl-1堅(jiān)牢石榴紅gbc鹽，0.2moll-1酒石酸溶液中反應(yīng)15分鐘，經(jīng)乙醇梯度脫水，以≥3個(gè)細(xì)胞核為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞計(jì)數(shù)。
6)mtt法檢測n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)對成骨細(xì)胞存活率的影響：
成骨細(xì)胞mc3t3以每孔5000個(gè)的濃度接種到96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)過夜。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組；實(shí)驗(yàn)組：化合物以培養(yǎng)基(含30ng/mlm-csf和50ng/mlrankl)配制成濃度1、5和10μmol/l，每孔加入100μl；陰性對照組：每孔加入等量培養(yǎng)基(含30ng/mlm-csf和50ng/mlrankl)。培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt(5g·l－1)20μl，反應(yīng)2h后，小心甩去培養(yǎng)液，每孔加入100μldmso，震蕩10分鐘充分溶解，酶標(biāo)儀在492nm波長檢測吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率(pr％)＝a實(shí)驗(yàn)組/a陰性對照組×100％。
7)n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)破骨細(xì)胞real-timert-pcr分析：
將骨髓單核細(xì)胞以每孔8×104個(gè)的濃度接種到6孔板，每孔2ml，實(shí)驗(yàn)組加入n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)使其終濃度分別為1、5、10μmol·l-1，陰性對照組每孔加入等量培養(yǎng)基(含30ng/mlm-csf和50ng/mlrankl)，空白組每孔加入等量培養(yǎng)基(含30ng/mlm-csf，不含rankl)，置于5％co2，37℃孵育箱中預(yù)孵育4天，每隔2天換液。于藥物培養(yǎng)3天后提取總rna，real-timert-pcr法檢測trap、nfatc1、c-fos、mmp-9和ctsk的表達(dá)水平。引物由takara公司合成?？俽na的提取采用trizol一步法進(jìn)行，紫外分光光度計(jì)檢測純度并調(diào)整濃度至50ng·μl-1，反轉(zhuǎn)錄體系、pcr擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件均參照試劑盒說明書設(shè)定，經(jīng)內(nèi)參校正，求得目的基因的相對表達(dá)量。
8)n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1)破骨細(xì)胞骨陷窩分析：
骨片的制備與預(yù)處理：取新鮮牛股骨，剝離附著的軟組織，用鋸式切片機(jī)將皮質(zhì)部切成20μm厚的骨片，修剪成0.5cm×0.5cm大小，超聲波清洗，75％酒精浸泡，紫外燈照射備用。
培養(yǎng)7天后棄培養(yǎng)液，2.5％戊二醛固定骨片7min，在0.25mol·l-1氫氧化氨中超聲清洗5分鐘，共3次，酒精脫水，自然晾干，1％甲苯胺藍(lán)染液室溫染色3分鐘，蒸餾水清洗，鏡下觀察。用imageproplus6.0軟件(usamediacybernetics公司)分析整張骨片上骨陷窩的數(shù)量及面積。
3、結(jié)果：
1)本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物對破骨細(xì)胞分化的trap活性的抑制作用研究
通過m-csf和mrankl對骨髓破骨前體細(xì)胞進(jìn)行破骨分化的誘導(dǎo)，檢測n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物在10μm對分化過程中trap活性的影響。如表1所示，結(jié)果表明：本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物在10μm對骨髓破骨細(xì)胞分化過程中的trap活性有著非常好的抑制作用。
表1.n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物對骨髓破骨前體細(xì)胞分化trap活性的抑制作用
2)本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1，nas-e)對骨髓破骨前體細(xì)胞的毒性作用研究
本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(nas-e)對骨髓破骨前體細(xì)胞的毒性結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明的nas-e在10μm濃度及以下對骨髓破骨前體細(xì)胞無明顯毒性。
表2nas-e對破骨細(xì)胞存活的影響
3)本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1，nas-e)對破骨細(xì)胞分化的trap活性的抑制作用研究
上述毒性試驗(yàn)結(jié)果表明nas-e對骨髓破骨前體細(xì)胞無明顯毒性。通過m-csf和mrankl對骨髓破骨前體細(xì)胞進(jìn)行破骨分化的誘導(dǎo)，檢測nas-e對分化過程中trap活性的影響。如表3所示，結(jié)果表明：本發(fā)明的nas-e對骨髓破骨細(xì)胞分化過程中的trap活性有著非常好的抑制作用，其中在10μm抑制率達(dá)到97.5％。
表3.nas-e對骨髓破骨前體細(xì)胞分化trap活性的抑制作用
4)本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1，nas-e)對破骨細(xì)胞形成的影響
選取不同濃度的nas-e干預(yù)骨髓破骨前體細(xì)胞破骨分化，分化結(jié)束后通過trap對破骨細(xì)胞進(jìn)行染色，并以≧3個(gè)細(xì)胞核為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞計(jì)數(shù)，如圖1和表4所示，試驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺類化合物nas-e能有效濃度依賴性地抑制破骨細(xì)胞的形成。
表4.nas-e對破骨細(xì)胞形成數(shù)量的影響
5)本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1，nas-e)對成骨細(xì)胞的毒性作用研究
為了研究nas-e是否對成骨細(xì)胞的存活有影響，我們選取不同濃度的nas-e與mc3t3-e1成骨細(xì)胞進(jìn)行共孵育，并通過mtt對存活細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果如表5所示。試驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明的nas-e在10μm濃度及以下對成骨細(xì)胞無明顯毒性。
表5nas-e對成骨細(xì)胞存活的影響
6)本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1，nas-e)對破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響結(jié)果
選取不同濃度的nas-e，干預(yù)骨髓破骨前體細(xì)胞破骨分化時(shí)對牛骨骨片的骨吸收作用。分化結(jié)束后通過甲苯胺藍(lán)對骨片進(jìn)行染色，并統(tǒng)計(jì)骨吸收的面積。如圖2所示，試驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明的nas-e能濃度依賴性地抑制破骨細(xì)胞骨吸收的功能。
7)本發(fā)明的n-(4-氯苯基)-3-羥基-2-萘甲酰胺(化合物1，nas-e)對破骨細(xì)胞特異性mrna表達(dá)的影響結(jié)果。
選取不同濃度的nas-e，干預(yù)骨髓破骨前體細(xì)胞破骨分化，研究nas-e對破骨分化及破骨行使功能時(shí)關(guān)鍵基因mrna表達(dá)水平的影響。如圖3所示，試驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明的nas-e能濃度依賴性地抑制破骨細(xì)胞分化及骨吸收關(guān)鍵基因如nfatc1，trap，v-atpase2，cathepsink的表達(dá)。