本發(fā)明涉及一種生物復(fù)合材料，特別涉及一種具有骨修復(fù)的仿骨材料的制備方法。
背景技術(shù)：
骨缺損修復(fù)是國內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)和生物材料領(lǐng)域長期以來的一個(gè)重要的研究課題。迄今為止臨床上對(duì)創(chuàng)傷、感染和腫瘤切除后所造成的大范圍骨缺損的修復(fù)問題仍未得到有效的解決。自體骨由于來源有限，同時(shí)會(huì)給患者帶來痛苦，其他骨修復(fù)材料，如異體骨，或異種骨容易導(dǎo)致免疫問題和疾病傳染。而人工骨修復(fù)材料由于和自然骨高度精密的礦化結(jié)構(gòu)差異較大，也還存在很多問題。作為人工骨修復(fù)材料，從成分和結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行仿生是目前和今后發(fā)展的主要方向。膠原蛋白或稱膠原是由動(dòng)物細(xì)胞合成的一種生物性高分子，廣泛存在于動(dòng)物骨、腿、軟骨和皮膚及其它結(jié)締組織中，膠原具有良好的生物學(xué)特性，可作為組織的支持物，對(duì)細(xì)胞、組織乃至器官行使正常功能并對(duì)外傷修復(fù)有重大影響。大量的研究結(jié)果表明，膠原的性能可以滿足用于作為表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的培養(yǎng)基質(zhì)。在組織修復(fù)中，膠原可參與組織愈合過程并能引導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞生長；具有顯著引導(dǎo)/誘導(dǎo)組織再生的作用，使創(chuàng)面實(shí)現(xiàn)功能性、再生性的愈合，可廣泛應(yīng)用于軟、硬組織損傷的修復(fù)，如口腔科、骨科、整形外科、五官科、神經(jīng)外科及肌腿斷裂和臟器穿孔等的治療。單一的膠原，從強(qiáng)度和降解速度上都難以滿足組織工程細(xì)胞培養(yǎng)的需要，將膠原和其它生物材料復(fù)合，是改善其性能的途徑之一。羥基磷灰石(hydroxyapatite，簡(jiǎn)稱ha)是脊椎動(dòng)物骨骼及牙齒中的主要無機(jī)成分，在骨質(zhì)中，羥基磷灰石大約占60％。人工合成的羥基磷灰石具有與人體骨組織相似的無機(jī)成分，含有人體組織所必需的鈣和磷元素，植入體內(nèi)后，在體液的作用下，鈣和磷會(huì)游離出材料表面，被機(jī)體組織所吸收，并能與人體骨骼組織形成化學(xué)鍵結(jié)合，生長出新的組織。因此，羥基磷灰石陶瓷是目前公認(rèn)的具有良好的生物相容性，并具有骨誘引導(dǎo)性，即生物活性。但人工合成的羥基磷灰石通常以粉末狀存在，在應(yīng)用中由于其缺乏粘連性，操作不便，成型不佳，材料植入后常發(fā)生移位和漏出，使其應(yīng)用受到一定限制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有骨修復(fù)的仿骨材料的制備方法，所制得的仿骨材料具有生物相容性好、綜合性能優(yōu)良和良好的強(qiáng)度和韌性，改善了產(chǎn)品降解較快的缺點(diǎn)，使得材料降解與新骨生長更加匹配，具有引導(dǎo)成骨作用，從而具有骨形成促進(jìn)作用。
本發(fā)明的具有骨修復(fù)的仿骨材料的制備方法，包括以下步驟：
a.分別將純凈干燥的聚-l乳酸顆粒和蜘蛛絲溶解于純度為99％的六氟異丙醇中攪拌溶解后制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的聚-l乳酸溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的蛛絲蛋白溶液，然后將聚-l乳酸溶液和蛛絲蛋白溶液以質(zhì)量比聚-l乳酸溶液：蛛絲蛋白溶液＝7:3-3:7均勻混合后通過靜電紡絲方法制備復(fù)合納米纖維；
b.將一定量的甲基丙烯酸甲酯用10％的氫氧化鈉溶液洗滌至滴入氫氧化鈉時(shí)水相下層不再變色后用蒸餾水洗滌至中性，再加入無水硫酸鈉脫水處理后減壓蒸餾，在真空度為0.05-0.10mpa、水浴溫度為45-52℃蒸出甲基丙烯酸甲酯單體冷藏待用；
c.向過氧化苯甲酰中加入一定量的氯仿溶解后過濾后將濾液加入甲醇中，將白色針狀結(jié)晶過濾，用冰冷的甲醇洗凈抽干反復(fù)結(jié)晶3-5次后收集沉淀，制得提純后的過氧化苯甲酰待用；
d.將硝酸鈣和磷酸三甲酯按硝酸鈣：磷酸三甲酯＝2.7-3.2:1的質(zhì)量比混合后用氨水調(diào)節(jié)其ph值為7，倒入坩堝，再放進(jìn)高溫爐中以12℃/min的速度升溫至600-700℃，恒溫?zé)Y(jié)2-3小時(shí)后將溫度緩慢降至室溫，得到羥基磷灰石并研磨至200-300目的粉體；
e.將步驟d中的1-10質(zhì)量份粉體和0.3-1質(zhì)量份磷酸單酯加入15-30質(zhì)量份丙酮溶液中，超聲分散35-45分鐘形成ha懸濁液備用；
f.將2-10質(zhì)量份的復(fù)合納米纖維和0.2-5質(zhì)量份的聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合在室溫下以30-50khz的頻率超聲分散后加入1-3質(zhì)量份的甲基丙烯酸甲酯單體和提純后的過氧化苯甲酰1-3質(zhì)量份，在水浴溫度為65-90℃下反應(yīng)25-45分鐘，然后加入到ha懸濁液中攪拌溶解后于溫度為60-70℃，壓強(qiáng)為7-15mpa下固化成型。
進(jìn)一步，步驟a中，將聚-l乳酸溶液和蛛絲蛋白溶液以質(zhì)量比聚-l乳酸溶液：蛛絲蛋白溶液＝7:3均勻混合；
進(jìn)一步，步驟b中，在真空度為0.08mpa、水浴溫度為48℃蒸出甲基丙烯酸甲酯單體冷藏待用；
進(jìn)一步，步驟d中，將硝酸鈣和磷酸三甲酯按硝酸鈣：磷酸三甲酯＝3:1的質(zhì)量比混合后用氨水調(diào)節(jié)其ph值為7，倒入坩堝，再放進(jìn)高溫爐中以12℃/min的速度升溫至650℃，恒溫?zé)Y(jié)2.5小時(shí)后將溫度緩慢降至室溫，得到羥基磷灰石并研磨至250目的粉體；
進(jìn)一步，步驟e中，將步驟d中的5質(zhì)量份粉體和0.7質(zhì)量份磷酸單酯加入20質(zhì)量份丙酮溶液中，超聲分散40分鐘形成ha懸濁液。
進(jìn)一步，步驟f中，將6質(zhì)量份的復(fù)合納米纖維和3質(zhì)量份的聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合在室溫下以45khz的頻率超聲分散后加入2質(zhì)量份的甲基丙烯酸甲酯單體和提純后的過氧化苯甲酰2質(zhì)量份，在水浴溫度為80℃下反應(yīng)35分鐘，然后加入到ha懸濁液中攪拌溶解后于溫度為65℃，壓強(qiáng)為12mpa下固化成型。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的具有骨修復(fù)的仿骨材料的制備方法，所制得的仿骨材料具有生物相容性好、綜合性能優(yōu)良和良好的強(qiáng)度和韌性，改善了產(chǎn)品降解較快的缺點(diǎn)，使得材料降解與新骨生長更加匹配，具有引導(dǎo)成骨作用，從而具有骨形成促進(jìn)作用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一
本發(fā)明的具有骨修復(fù)的仿骨材料的制備方法，包括以下步驟：
a.分別將純凈干燥的聚-l乳酸顆粒和蜘蛛絲溶解于純度為99％的六氟異丙醇中攪拌溶解后制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的聚-l乳酸溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的蛛絲蛋白溶液，然后將聚-l乳酸溶液和蛛絲蛋白溶液以質(zhì)量比聚-l乳酸溶液：蛛絲蛋白溶液＝7:3均勻混合后通過靜電紡絲方法制備復(fù)合納米纖維；
b.將一定量的甲基丙烯酸甲酯用10％的氫氧化鈉溶液洗滌至滴入氫氧化鈉時(shí)水相下層不再變色后用蒸餾水洗滌至中性，分區(qū)水層，再加入無水硫酸鈉脫水處理后減壓蒸餾，在真空度為0.08mpa、水浴溫度為48℃蒸出甲基丙烯酸甲酯單體冷藏待用；
c.采用在100ml燒杯中加入5g過氧化苯甲酰和20ml的氯仿溶解后過濾后將濾液加入50ml的甲醇中，將白色針狀結(jié)晶過濾，用冰冷的甲醇洗凈抽干反復(fù)結(jié)晶3次后收集沉淀，制得提純后的過氧化苯甲酰待用；
d.將硝酸鈣和磷酸三甲酯按硝酸鈣：磷酸三甲酯＝3:1的質(zhì)量比混合后用氨水調(diào)節(jié)其ph值為7，倒入坩堝，再放進(jìn)高溫爐中以12℃/min的速度升溫至650℃，恒溫?zé)Y(jié)2.5小時(shí)后將溫度緩慢降至室溫，得到羥基磷灰石并研磨至250目的粉體；
e.將步驟d中的5質(zhì)量份粉體和0.7質(zhì)量份磷酸單酯加入20質(zhì)量份丙酮溶液中，超聲分散40分鐘形成ha懸濁液備用；
f.將6質(zhì)量份的復(fù)合納米纖維和3質(zhì)量份的聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合在室溫下以45khz的頻率超聲分散后加入2質(zhì)量份的甲基丙烯酸甲酯單體和提純后的過氧化苯甲酰2質(zhì)量份，在水浴溫度為80℃下反應(yīng)35分鐘，然后加入到ha懸濁液中攪拌溶解后于溫度為65℃，壓強(qiáng)為12mpa下固化成型。
實(shí)施例二
本發(fā)明的具有骨修復(fù)的仿骨材料的制備方法，包括以下步驟：
a.分別將純凈干燥的聚-l乳酸顆粒和蜘蛛絲溶解于純度為99％的六氟異丙醇中攪拌溶解后制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的聚-l乳酸溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的蛛絲蛋白溶液，然后將聚-l乳酸溶液和蛛絲蛋白溶液以質(zhì)量比聚-l乳酸溶液：蛛絲蛋白溶液＝3:7均勻混合后通過靜電紡絲方法制備復(fù)合納米纖維；
b.將一定量的甲基丙烯酸甲酯用10％的氫氧化鈉溶液洗滌至滴入氫氧化鈉時(shí)水相下層不再變色后用蒸餾水洗滌至中性，再加入無水硫酸鈉脫水處理后減壓蒸餾，在真空度為0.05mpa、水浴溫度為45℃蒸出甲基丙烯酸甲酯單體冷藏待用；
c.向過氧化苯甲酰中加入一定量的氯仿溶解后過濾后將濾液加入甲醇中，將白色針狀結(jié)晶過濾，用冰冷的甲醇洗凈抽干反復(fù)結(jié)晶5次后收集沉淀，制得提純后的過氧化苯甲酰待用；
d.將硝酸鈣和磷酸三甲酯按硝酸鈣：磷酸三甲酯＝2.7:1的質(zhì)量比混合后用氨水調(diào)節(jié)其ph值為7，倒入坩堝，再放進(jìn)高溫爐中以12℃/min的速度升溫至600℃，恒溫?zé)Y(jié)2小時(shí)后將溫度緩慢降至室溫，得到羥基磷灰石并研磨至200目的粉體；
e.將步驟d中的1質(zhì)量份粉體和0.3質(zhì)量份磷酸單酯加入15質(zhì)量份丙酮溶液中，超聲分散35分鐘形成ha懸濁液備用；
f.將2質(zhì)量份的復(fù)合納米纖維和0.2質(zhì)量份的聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合在室溫下以30khz的頻率超聲分散后加入1質(zhì)量份的甲基丙烯酸甲酯單體和提純后的過氧化苯甲酰1質(zhì)量份，在水浴溫度為65℃下反應(yīng)25分鐘，然后加入到ha懸濁液中攪拌溶解后于溫度為60℃，壓強(qiáng)為7mpa下固化成型。
實(shí)施例三
本發(fā)明的具有骨修復(fù)的仿骨材料的制備方法，包括以下步驟：
a.分別將純凈干燥的聚-l乳酸顆粒和蜘蛛絲溶解于純度為99％的六氟異丙醇中攪拌溶解后制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的聚-l乳酸溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的蛛絲蛋白溶液，然后將聚-l乳酸溶液和蛛絲蛋白溶液以質(zhì)量比聚-l乳酸溶液：蛛絲蛋白溶液＝5:5均勻混合后通過靜電紡絲方法制備復(fù)合納米纖維；
b.將一定量的甲基丙烯酸甲酯用10％的氫氧化鈉溶液洗滌至滴入氫氧化鈉時(shí)水相下層不再變色后用蒸餾水洗滌至中性，再加入無水硫酸鈉脫水處理后減壓蒸餾，在真空度為0.10mpa、水浴溫度為52℃蒸出甲基丙烯酸甲酯單體冷藏待用；
c.向過氧化苯甲酰中加入一定量的氯仿溶解后過濾后將濾液加入甲醇中，將白色針狀結(jié)晶過濾，用冰冷的甲醇洗凈抽干反復(fù)結(jié)晶5次后收集沉淀，制得提純后的過氧化苯甲酰待用；
d.將硝酸鈣和磷酸三甲酯按硝酸鈣：磷酸三甲酯＝3.2:1的質(zhì)量比混合后用氨水調(diào)節(jié)其ph值為7，倒入坩堝，再放進(jìn)高溫爐中以12℃/min的速度升溫至700℃，恒溫?zé)Y(jié)3小時(shí)后將溫度緩慢降至室溫，得到羥基磷灰石并研磨至300目的粉體；
e.將步驟d中的10質(zhì)量份粉體和1質(zhì)量份磷酸單酯加入30質(zhì)量份丙酮溶液中，超聲分散45分鐘形成ha懸濁液備用；
f.將10質(zhì)量份的復(fù)合納米纖維和5質(zhì)量份的聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合在室溫下以50khz的頻率超聲分散后加入3質(zhì)量份的甲基丙烯酸甲酯單體和提純后的過氧化苯甲酰3質(zhì)量份，在水浴溫度為90℃下反應(yīng)45分鐘，然后加入到ha懸濁液中攪拌溶解后于溫度為70℃，壓強(qiáng)為15mpa下固化成型。
實(shí)施例四
本發(fā)明的具有骨修復(fù)的仿骨材料的制備方法，包括以下步驟：
a.分別將純凈干燥的聚-l乳酸顆粒和蜘蛛絲溶解于純度為99％的六氟異丙醇中攪拌溶解后制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的聚-l乳酸溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的蛛絲蛋白溶液，然后將聚-l乳酸溶液和蛛絲蛋白溶液以質(zhì)量比聚-l乳酸溶液：蛛絲蛋白溶液＝4:6均勻混合后通過靜電紡絲方法制備復(fù)合納米纖維；
b.將一定量的甲基丙烯酸甲酯用10％的氫氧化鈉溶液洗滌至滴入氫氧化鈉時(shí)水相下層不再變色后用蒸餾水洗滌至中性，再加入無水硫酸鈉脫水處理后減壓蒸餾，在真空度為0.8mpa、水浴溫度為50℃蒸出甲基丙烯酸甲酯單體冷藏待用；
c.向過氧化苯甲酰中加入一定量的氯仿溶解后過濾后將濾液加入甲醇中，將白色針狀結(jié)晶過濾，用冰冷的甲醇洗凈抽干反復(fù)結(jié)晶3次后收集沉淀，制得提純后的過氧化苯甲酰待用；
d.將硝酸鈣和磷酸三甲酯按硝酸鈣：磷酸三甲酯＝2.8:1的質(zhì)量比混合后用氨水調(diào)節(jié)其ph值為7，倒入坩堝，再放進(jìn)高溫爐中以12℃/min的速度升溫至680℃，恒溫?zé)Y(jié)2.8小時(shí)后將溫度緩慢降至室溫，得到羥基磷灰石并研磨至220目的粉體；
e.將步驟d中的7質(zhì)量份粉體和1質(zhì)量份磷酸單酯加入28質(zhì)量份丙酮溶液中，超聲分散35分鐘形成ha懸濁液備用；
f.將4質(zhì)量份的復(fù)合納米纖維和4質(zhì)量份的聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合在室溫下以50khz的頻率超聲分散后加入2質(zhì)量份的甲基丙烯酸甲酯單體和提純后的過氧化苯甲酰1.5質(zhì)量份，在水浴溫度為90℃下反應(yīng)45分鐘，然后加入到ha懸濁液中攪拌溶解后于溫度為65℃，壓強(qiáng)為15mpa下固化成型。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
骨組織標(biāo)記物
(1)放射性同位素45cacl2,中國原子能科學(xué)院提供,比放射性為1mci/ml,放化純度>5％生理鹽水溶液；(2)鹽酸四環(huán)素?zé)晒馐聚檮?天津藥業(yè)公司提供,含量9919％。
(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法
15％噻胺酮麻醉下在4只健康大耳白家兔(體重3～3.5kg)的頜骨與頂骨制作直徑為12mm的穿通性骨缺損,頜骨設(shè)左右對(duì)照,頂骨設(shè)前后對(duì)照。熒光示蹤組2只家兔(0、2號(hào)動(dòng)物)
手術(shù)后每2周肌注鹽酸四環(huán)素(50mgkg),術(shù)后10～12周處死,取出相關(guān)組織,標(biāo)本至乙醇中浸泡1周后制作不脫鈣切片,經(jīng)gimsa、vonkossa等染色方法,分別在普通顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察創(chuàng)區(qū)骨生情況,細(xì)胞活躍程度,礦化帶分布及材料植入后的組織反應(yīng)。
放射性同位素測(cè)定組2只家兔(3、4號(hào)動(dòng)物)手術(shù)后87天于耳緣靜脈注射45cacl2生理鹽水溶液300uci/0.3mm(注射時(shí)確保完全注入防止泄露),3天后取相關(guān)組織制成樣品測(cè)其放射性強(qiáng)度:①液體閃爍測(cè)定:用beckmanls25801液體閃爍譜儀按6#程序測(cè)得cpm,將各數(shù)據(jù)換算成100g組織重量的放射性強(qiáng)度。②放射自顯影,取相關(guān)組織清洗吸干水分置于氚片上曝光、顯影、定影后得自顯影像。結(jié)果與討論
211經(jīng)仿生制備的納米羥晶膠原復(fù)合骨材料(以下簡(jiǎn)稱na2hapc0)中,膠原蛋白占總重量的35％,與天然骨成份接近,結(jié)構(gòu)與形貌圖譜分析亦與天然骨類似。從透射電鏡得到的暗場(chǎng)像可測(cè)得hap的晶體尺寸為2～10nm。212動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)本肉眼、組織學(xué)及熒光示蹤觀察。
1號(hào)動(dòng)物左頜及前頂骨損植人實(shí)施例一的仿骨材料),術(shù)后10周處死,取材時(shí)發(fā)現(xiàn)骨創(chuàng)區(qū)已形成一薄層骨片,僅中心區(qū)1.5mm處為非骨性連合,但已形成硬纖維膜,而右頜及后頂部植入對(duì)照hapc0材料的骨創(chuàng)區(qū)則見呈包囊狀的材料塊,可動(dòng),未與創(chuàng)周正常骨結(jié)合。2、3、4號(hào)動(dòng)物術(shù)后12周處死時(shí),左頜及前頂植人實(shí)施例二的骨創(chuàng)已形成骨性橋接,骨創(chuàng)關(guān)閉；右頜及后頂作為空白對(duì)照的骨創(chuàng)則僅見略微縮小的骨缺損,中心區(qū)9～11mm為纖維結(jié)締組織充填。組織切片在普通光鏡與熒光顯微鏡下所見:植入?yún)^(qū)成骨細(xì)胞,成軟骨細(xì)胞生長活躍,類骨質(zhì)豐富,成骨細(xì)胞呈立方狀成排或成環(huán)狀排列于骨小梁表面及內(nèi)面,缺損區(qū)有生骨性填充,有骨島出現(xiàn)甚至形成骨性橋接,四環(huán)素礦化標(biāo)記線明顯而密集。仿骨材料與空白對(duì)照組,骨細(xì)胞小而少,呈扁平狀,成骨不活躍,類骨質(zhì)量少,骨創(chuàng)為薄層纖維組織填充,無骨島出現(xiàn)。四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記線少而模糊,骨端為纖維結(jié)締組織甚至肌肉組織所封閉,偶見骨吸收陷窩。兩組材料組織反應(yīng)均<2級(jí)。2.3放射性同位素強(qiáng)度測(cè)定及放射自顯影3、4號(hào)動(dòng)物前后頂骨取材情況如下:1號(hào)樣品:實(shí)施例1植入之骨創(chuàng)中心部位；2號(hào)樣品:實(shí)施例2植入之骨創(chuàng)邊緣部位；3號(hào)樣品:空白對(duì)照之中心部位；4號(hào)樣品:正常頂骨組織。液體閃爍測(cè)量結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示:樣品1與樣品3、4的放射性強(qiáng)度對(duì)比存在顯著性差異(p<0.01)樣品2與樣品1、3、4的放射性強(qiáng)度間亦存在顯著性差異(p<0.01)。這一結(jié)果表明：仿骨材料植入后明顯促進(jìn)家兔頂骨的代謝吸收,新骨生成活躍,尤其是在材料與骨組織界面處最為顯著；而空白對(duì)照區(qū)及非手術(shù)區(qū)的正常骨組織對(duì)45cacl2吸收代謝較慢。新骨生成不活躍。放射自顯影像的曝光度與液閃測(cè)量的結(jié)果一致,仿骨材料與骨連接部影像較為明顯,正常骨組織處最不明顯,這從另一側(cè)面反映了不同取材部位骨生成的活躍程度的差異,亦即仿骨材料與骨結(jié)合界面的骨生成最為顯著。
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。