本發(fā)明涉及骨組織生物材料，具體涉及一種脫鈣骨基質骨修復材料的制備方法。

背景技術：

隨著我國人口老年化，脊柱退行性變融合手術和關節(jié)翻修手術病例日益增多，此外，由創(chuàng)傷、骨質疏松癥、骨腫瘤或骨病所造成的骨缺損病例較多，這些病患需要大量骨組織修復填充材料。骨修復材料的社會需求量日益增多，自體骨無法滿足用量要求，并且存在增加病患疼痛、同種異體骨免疫排斥反應較嚴重等問題。因此，近年來興起的組織工程骨已經成為解決骨修復材料問題的研究熱點。

脫鈣骨基質(decalcifiedbonematrix，dbm)是通過一系列化學方法對骨進行脫鈣、去脂和去非膠原蛋白成分等處理得到的產物。dbm具有良好骨傳導和骨誘導性能，免疫排斥反應較低，已經被廣泛應用于骨科、神經外科和牙科等領域。dbm分為塊狀和粉末狀，塊狀dbm可塑形性差，而dbm粉也存在聚合性差及術中不宜填充操作缺點，以及植入骨缺損部位的dbm粉容易被流動體液帶離原部位。因此，dbm粉需要合適的支架承載，市面上已有羥基磷灰石、透明質酸鈉、殼聚糖等材料承載的dbm復合骨修復替代產品。良好骨修復材料需在一定時間范圍內完成骨修復過程，達到骨愈合目的，而富含bmp等多種成骨因子的dbm粉既可發(fā)揮生物活性成分作用，又可作為具備骨傳導的支架材料之一。

海藻酸鹽作為一種天然高分子材料，具有生物相容性好、高吸濕性和多空隙結構等特點，是組織工程領域備受關注的特殊生物材料。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種脫鈣骨基質骨修復材料的制備方法。

上述目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種脫鈣骨基質骨修復材料的制備方法，包括以下步驟：

1)將海藻酸鹽加入到ph為6～9的磷酸鹽緩沖液中，攪拌混合均勻，得到重量體積比為0.5～3％的海藻酸鹽溶液；

2)將脫鈣骨基質粉加入到海藻酸鹽溶液中，充分攪拌，制成脫鈣骨基質粉濃度為20～100mg/ml的混懸液，置于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3)用雙蒸水制備重量濃度為0.5～3％的cacl2溶液，將步驟2)中的混懸液置于模具中，向混懸液中滴加cacl2溶液，直到混懸液發(fā)生膠凝，然后靜置1～3小時后從模具中取出條狀凝膠；

4)將條狀凝膠進行冷凍干燥，即得。

優(yōu)選地，步驟1)中，所述磷酸鹽緩沖液的ph為7。

優(yōu)選地，所述海藻酸鹽溶液的重量體積比為1％。

優(yōu)選地，步驟2)中，所述混懸液中脫鈣骨基質粉的濃度為25mg/ml。

優(yōu)選地，步驟3)中，cacl2溶液的重量濃度為2％。

優(yōu)選地，所述冷凍干燥的程序為：先-80℃深低溫冷凍12h，再立即轉入真空冷凍干燥儀，設置溫度為-50℃，抽真空狀態(tài)持續(xù)6h后取出。

與現(xiàn)有骨缺損修復材料技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1)本發(fā)明制備工藝流程簡便，沒有添加其他具有氧化性、毒性和排斥反應等不易于生物相容性的化學成分，隨著海藻酸鹽在體內逐步降解，以及誘導骨組織成分的形成，病灶部位將快速以脫鈣骨基質為支架形成新骨，達到骨修復和填充的目的。

2)本發(fā)明既保留了脫鈣骨基質粉良好的骨誘導和骨傳導性能，用海藻酸鹽天然支架材料承載脫鈣骨基質粉，有效解決了脫鈣骨基質粉不易在骨填充部位保持固定形態(tài)的缺陷問題。

3)本發(fā)明所用海藻酸鹽成分在低溫冷凍干燥過程中能形成大量孔隙結構，具備良好的溶脹膨量和降解性能，利于骨髓間充質干細胞向成骨分化，可作為組織工程骨支架材料。

4)本發(fā)明所述方法可通過體外模具成型或裁剪等方式解決修復不規(guī)則骨缺損問題。

附圖說明

圖1是脫鈣骨基質骨修復材料促進骨髓間充質干細胞成骨分化的試驗結果。

圖2是脫鈣骨基質骨修復材料促進骨髓間充質干細胞成骨分化相關基因alp和ocn的表達的蛋白印跡實驗檢測結果。

圖3是脫鈣骨基質骨修復材料的肌肉包埋異位成骨x線檢測結果。

圖4是脫鈣骨基質骨修復材料的顱骨缺損模型修復實驗結果。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。

各實施例中所使用的脫鈣骨基質均由湖北聯(lián)結生物材料有限公司提供，其制備方法如下：取sd大鼠四肢長骨骨干，去掉干骺端及骨膜，取皮質骨，在冰上研磨粉碎，分別經1000μm和100μm不銹鋼篩篩除＞1000μm和＜100μm的骨粉，得到直徑為100μm-1000μm鼠骨粉，對骨粉進行一系列脫脂、脫鈣、去免疫非膠原蛋白處理，即得。

實施例1

1)將海藻酸鈉1g加入到ph為7的磷酸鹽緩沖液100ml中，攪拌混合均勻，得到重量體積比為1％的海藻酸鈉溶液；

2)將脫鈣骨基質粉加入到海藻酸鈉溶液中，充分攪拌，制成脫鈣骨基質粉濃度為25mg/ml的混懸液，置于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3)用雙蒸水制備重量濃度為2％的cacl2溶液，將步驟2)中的混懸液置于圓筒形的模具中，向混懸液中緩慢滴加cacl2溶液，直到混懸液發(fā)生膠凝(cacl2溶液的加入量為混懸液體積的3.5％)，然后靜置1小時后從模具中取出條狀凝膠；

4)將條狀凝膠進行冷凍干燥，所述冷凍干燥的程序為：先-80℃深低溫冷凍12h，再立即轉入真空冷凍干燥儀，設置溫度為-50℃，抽真空狀態(tài)持續(xù)6h后取出，即得條狀骨修復材料。

本步驟所得材料可根據(jù)實際應用進一步裁剪后使用，填充不規(guī)則骨缺損。

實施例2

1)將海藻酸鈉0.5g加入到ph為6.5的磷酸鹽緩沖液100ml中，攪拌混合均勻，得到重量體積比為0.5％的海藻酸鈉溶液；

2)將脫鈣骨基質粉加入到海藻酸鈉溶液中，充分攪拌，制成脫鈣骨基質粉濃度為20mg/ml的混懸液，置于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3)用雙蒸水制備重量濃度為1％的cacl2溶液，將步驟2)中的混懸液置于模具中，向混懸液中滴加cacl2溶液(cacl2溶液的加入量為混懸液體積的5％)，直到混懸液發(fā)生膠凝，然后靜置2小時后從模具中取出條狀凝膠；

4)將條狀凝膠進行冷凍干燥，即得。

實施例3

1)將海藻酸鈉2g加入到ph為8的磷酸鹽緩沖液100ml中，攪拌混合均勻，得到重量體積比為2％的海藻酸鈉溶液；

2)將脫鈣骨基質粉加入到海藻酸鈉溶液中，充分攪拌，制成脫鈣骨基質粉濃度為50mg/ml的混懸液，置于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3)用雙蒸水制備重量濃度為3％的cacl2溶液，將步驟2)中的混懸液置于模具中，向混懸液中滴加cacl2溶液，直到混懸液發(fā)生膠凝，然后靜置1小時后從模具中取出條狀凝膠；

4)將條狀凝膠進行冷凍干燥，即得。

實施例4

1)將海藻酸鈉1.5g加入到ph為7.5的磷酸鹽緩沖液100ml中，攪拌混合均勻，得到重量體積比為1.5％的海藻酸鹽溶液；

2)將脫鈣骨基質粉加入到海藻酸鹽溶液中，充分攪拌，制成脫鈣骨基質粉濃度為30mg/ml的混懸液，置于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3)用雙蒸水制備重量濃度為0.5％的cacl2溶液，將步驟2)中的混懸液置于模具中，向混懸液中滴加cacl2溶液，直到混懸液發(fā)生膠凝，然后靜置2小時后從模具中取出條狀凝膠；

4)將條狀凝膠進行冷凍干燥，即得。

試驗例

1.脫鈣骨基質骨修復材料的表征

1.1電鏡觀察：電鏡觀察結果表明，本發(fā)明制備的脫鈣骨基質骨修復材料呈疏松孔隙結構，脫鈣骨基質粉均勻分布在海藻酸表面積內部。

1.2溶脹膨量試驗：將本發(fā)明制備的骨修復材料置于pbs中，在4、8、12、16小時時間點取出，電子秤稱量，計算溶脹率(％)，溶脹率可代表復合材料吸水性的強弱和材料空隙結構大小，溶脹率越高，則材料吸水性越強。計算公式如下：

溶脹率＝(w2-w1)/(w1)％

w1＝復合物質量(溶脹前)

w2＝復合物質量(溶脹后)

溶脹膨量試驗結果表明，本發(fā)明制備的骨修復材料在pbs中16小時的溶脹率可達到20％。

1.3體外降解速率：體外降解速率測定是組織工程材料的重要表征手段之一，可模擬體復合材料內生理環(huán)境或組織酶降解環(huán)境中的降解情況。將復合材料置于磷酸鹽緩沖液(pbs)和膠原蛋白酶中，在1、3、6、9、12、15天時取出復合材料，干燥后稱量，計算每個時間節(jié)點的剩余質量，即代表降解率。

剩余質量(％)＝(w1-w2)/(w1)％

w1＝復合物質量(降解前)

w2＝復合物質量(溶脹后)

體外降解實驗表明，本發(fā)明制備的骨修復材料在磷酸鹽緩沖液中15天內的降解速率均小于15％。在膠原蛋白酶中的降解速率快于pbs中降解速率，其中實施例1在15天內可完全被膠原蛋白酶降解，實施例2在15天時可被膠原蛋白酶降解30％左右，實施例3在15天內可被膠原蛋白酶降解40％左右，實施例4在15天內可被膠原蛋白酶降解40％左右。

2復合材料與細胞培養(yǎng)實驗結果

2.1細胞毒性實驗:細胞毒性實驗是檢測復合材料是否有細胞毒性的重要指標，本試驗例中采用mtt比色法，提取培養(yǎng)sd大鼠骨髓間充質干細胞，將骨修復材料與細胞共培養(yǎng)12、24、36、48小時，加入mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，將二甲基亞砜處理后的細胞上清液轉移至96孔板。在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光度值。同時設置調零孔(培養(yǎng)基、mtt、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、mtt、二甲基亞砜)。吸光度值越大，表明細胞活性越強，吸光度值越小，表明復合材料對細胞的毒性越大。mtt實驗結果表明，本發(fā)明制備的脫鈣骨基質骨修復材料沒有細胞毒性作用。

2.2復合材料可促進骨髓間充質干細胞成骨分化：alp染色、茜素紅染色和vonkossa染色是檢測干細胞成骨分化能力的重要指標，alp染色越深，茜素紅及vonkossa染色顯示的鈣結節(jié)越多，表明細胞成骨分化現(xiàn)象越明顯。本試驗例中，將本發(fā)明制備的脫鈣骨基質骨修復材料(adbm組)、市售脫鈣骨基質粉(dbm組)與骨髓間充質干細胞培養(yǎng)9天，經alp染色、茜素紅染色及vonkossa染色結果顯示，alp染色深度adbm組＞dbm組＞對照組，茜素紅染色及vonkossa染色顯示鈣結節(jié)數(shù)目adbm組＞dbm組＞對照組，差異有統(tǒng)計學意義，因此，本發(fā)明制備的脫鈣骨基質骨修復材料和市售脫鈣骨基質粉均能促進骨髓間充質干細胞的成骨分化，高于空白對照組，并且本發(fā)明制備的骨修復材料促進骨髓間充質干細胞的作用強于市售脫鈣骨基質粉。(圖1)

2.3復合材料可促進骨髓間充質干細胞成骨分化相關基因表達：alp和ocn基因是參與干細胞成骨過程的重要基因，本發(fā)明制備的脫鈣骨基質骨修復材料、市售脫鈣骨基質粉(作為陽性對照)處理骨髓間充質干細胞9天后，采用蛋白印跡實驗檢測alp和ocn基因的蛋白表達水平，灰度值比越高，表明蛋白表達水平越高，結果表明adbm、dbm處理組細胞的alp和ocn基因蛋白表達水平均高于對照組，并且adbm組的alp和ocn基因蛋白表達水平高于dbm組，表明本發(fā)明制備的脫鈣骨基質骨修復材料能促進骨髓間充質干細胞成骨基因表達，且其成骨能力優(yōu)于單純脫鈣骨基質粉。(圖2)

3動物實驗結果

3.1肌肉包埋實驗結果：將同等質量的adbm與dbm分別植入sd大鼠背部肌肉袋中，3個月后取標本行x線檢查，結果表明，adbm組異位成骨量高于dbm異位成骨量，表明adbm成骨性能更好，以及adbm在成骨方面比單純植入dbm粉可能更加節(jié)約所需要的脫鈣骨基質的量。(圖3)

3.2sd大鼠顱骨缺損修復實驗：在sd大鼠顱骨左側造4mm直徑的圓形骨缺損模型，剝離周圍骨膜，實驗分為三組:空白對照組(不植入任何材料)、dbm組和adbm組，3個月后取sd大鼠顱骨，行x線檢測及microct檢測，結果顯示adbm組大鼠顱骨缺損部位出現(xiàn)新生骨，顱骨缺損被部分修復，adbm組(14.1±6.9mm²)顱骨剩余缺損面積小于dbm組(36.3±4.7)和空白造模組(45.6±5.8mm²)，這表明本試驗的復合材料在動物體內具備骨修復能力，并且修復顱骨缺損作用強于dbm組。(圖4)

4.結果分析

首先，對本發(fā)明制備的脫鈣骨基質骨修復材料(adbm)進行了一系列材料表征測試，電鏡檢測表明，該復合材料具備疏松空隙結構，溶脹試驗表明該材料對磷酸鹽緩沖液可產生超過20％吸濕性，體外模擬降解實驗表明，復合材料的支架成分(海藻酸鹽)可被膠原蛋白酶降解，而脫鈣骨基質成分不易被完全降解。因此，體外表征實驗表明該復合物作為骨填充修復材料可被體內生理環(huán)境液體滲透，利于體內成骨分化相關細胞的長入。

其次，將本發(fā)明制備的復合物材料與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)，mtt結果表明該材料無細胞毒性，能促進骨髓間充質干細胞成骨分化及相關基因表達。人體骨髓及其周圍組織中存在大量骨髓間充質干細胞，干細胞首先向成骨細胞分化，并產生大量的鈣鹽沉積，部分成骨細胞繼而分化為骨細胞，從而參與人體骨缺損部位修復過程。因此，該復合物材料可能通過促進肝細胞成骨分化而產生骨修復作用。

最后，將本發(fā)明制備的復合物材料植入大鼠背部肌肉，發(fā)現(xiàn)該材料具備異位成骨能力，并且成骨能力優(yōu)于單純脫鈣骨基質粉，這可能是因為，第一，該復合物材料具備空隙結構，利于體液及細胞與復合物材料中的脫鈣骨基質粉接觸；第二，該復合物材料能保持固定形態(tài)，而脫鈣骨基質粉呈粉末狀，一方面復合物材料在植入過程中比粉末狀脫鈣骨基質粉容易操作，另一方面復合物材料一旦植入體內，則不易被體液循環(huán)分散，而粉末狀脫鈣骨基質則不能耐受體液及肌肉運動對其產生的分散作用。