本發(fā)明屬于醫(yī)藥和/或保健品技術領域，具體涉及一種女貞花提取物、提取方法及其在制備預防和治療新陳代謝綜合征藥物方面的應用。

背景技術：

女貞（ligustrumlucidumait.）為木犀科女貞屬植物。其果實入藥為女貞子（ligustrilucidifructus），甘、苦，涼。歸肝、腎經(jīng)。具有滋補肝腎，明目烏發(fā)的功效。用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明，內熱消渴，骨蒸潮熱。目前女貞子的研究非常多，化學成分主要有三萜類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和苯乙醇類等。藥理活性主要有抗氧化、抗炎、保肝、抗癌、降血糖和免疫調節(jié)等。另外，有報道女貞樹皮分離鑒定了19個化合物，除女貞中常有的化合物結構類型外，還得到了7-羥基香豆素、苯甲酸、尼克酰胺等化合物。女貞花的研究相對較少。女貞花揮發(fā)油的成分主要是醇、醛、酯等。女貞花化學成分主要有黃酮類和甾醇類。另有研究表明，女貞花總黃酮具有較強的清除dpph自由基和亞硝酸鹽的能力。目前并未見關于女貞花在新城代謝綜合征方面的研究。

肥胖癥是遺傳、環(huán)境等多種因素引起的體內脂肪堆積過多、體重增加的慢性代謝性疾病。與2型糖尿病、血脂異常密切相關。攝入的能量超過消耗的能量會導致脂肪的堆積。脂肪組織的增大是由脂肪細胞數(shù)量的增多和體積增大引起的。脂肪組織的增殖、分化失常會引起脂肪組織的堆積。體內脂肪組織過多堆積會分泌一系列的激素和脂肪細胞因子干擾胰島素在細胞內信號傳導，引發(fā)胰島素抵抗，胰島素抵抗是指體內外周組織（肌肉、脂肪）對胰島素的敏感性降低，使得外周組織對葡萄糖的攝取減少，導致血糖升高，進而誘發(fā)2型糖尿病。并且，胰島素抵抗貫穿2型糖尿病的整個過程。脂肪組織的主要結構是脂滴，脂滴中甘油三酯的含量占95%。甘油三酯在脂肪酶的作用下分解為游離脂肪酸和甘油，脂質分解最主要的作用是供能。脂滴又被稱之為“能量轉換器”，是與肥胖相關的亞細胞結構，胞內脂滴增大可導致脂肪細胞體積增大。肥胖的生物學基礎是：細胞內脂滴增大導致細胞體積增大和新生脂肪細胞數(shù)量增多。因此，研究脂滴的形成及甘油三酯的代謝可能成為解決肥胖問題的手段之一。脂肪細胞起源于中胚層干細胞，其分化發(fā)育經(jīng)歷幾個階段：多功能干細胞、間充質前體細胞、前脂肪細胞、成熟脂肪細胞。3t3-l1前脂肪細胞來源于小鼠胚胎成纖維細胞，經(jīng)克隆擴增而成為前脂肪細胞系，能定向分化為成熟脂肪細胞，充分顯示在體細胞的特點，包括形態(tài)學的改變，多種脂肪代謝酶的表達，廣泛脂質積聚等，是體外研究脂肪細胞的理想模型。肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)病率不斷上升，已成為全球性的健康問題。開發(fā)預防治療肥胖癥和2型糖尿病的天然產物意義尤為深遠。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷，提供女貞花提取物、提取方法及其在制備預防和治療新陳代謝綜合征藥物方面的應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種女貞花提取物，所述女貞花提取物為女貞花總浸膏、40%乙醇部位和60%乙醇部位中的一種或兩種以上的混合物。

上述女貞花提取物的提取方法，具體為：取干燥女貞花，用石油醚加熱回流提取1-3次，每次回流提取1-3h，回流提取結束后固液分離，所得殘渣揮干石油醚，用70±5%乙醇室溫下浸漬提取2-4次，每次浸漬提取2-4天，合并提取液并濃縮，得到女貞花總浸膏；女貞花總浸膏用乙醇溶解后，用d101型大孔樹脂吸附分離，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，洗脫液濃縮后，分別得到水部位、20%乙醇部位、40%乙醇部位、60%乙醇部位、95%乙醇部位。女貞花提取物就是女貞花總浸膏、40%乙醇部位和60%乙醇部位中的任意一種或兩種以上的混合物。

上述女貞花提取物在制備預防和治療新陳代謝綜合征藥物方面的應用。

上述的應用，具體的可以是：女貞花提取物在制備預防和治療糖尿病藥物方面的應用，尤其是在促進脂肪細胞糖吸收的藥物和/或保健品方面的應用，進一步的可以是制備促進胰島素抵抗狀態(tài)下脂肪細胞糖吸收的藥物和/或保健品方面的應用。

上述的應用，具體的還可以是：女貞花提取物在制備預防和改善肥胖癥藥物方面的應用，即具有潛在的減肥功效，尤其是在制備抑制前脂肪細胞分化的藥物和/或保健品方面的應用、或者是在制備促進脂肪細胞脂代謝的藥物和/或保健品方面的應用。

上述的女貞花提取物還可以與本領域常規(guī)輔料復配制成復方制劑。所述復方制劑的劑型可以為片劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑或注射劑等。

和現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)了女貞花提取物通過抑制前脂肪細胞分化、促進脂肪細胞脂代謝，以及促進脂肪細胞糖吸收和改善胰島素抵抗，可能成為治療2型糖尿病、肥胖的一種新型化合物，即其具有潛在的降血糖、改善胰島素抵抗的作用。因此，可被用作制備制備預防和治療新陳代謝綜合征藥物和/或保健品，尤其是預防和改善糖尿病藥物、肥胖癥藥物。

附圖說明

圖1為對照組的油紅分化染色結果；

圖2為女貞花總浸膏的油紅分化染色結果；

圖3為女貞花40%乙醇部位的油紅分化染色結果；

圖4為女貞花60%乙醇部位的油紅分化染色結果；

圖5為女貞花提取物對3t3-l1脂肪細胞脂代謝作用的影響；

圖6為女貞花提取物對3t3-l1脂肪細胞糖吸收作用；

圖7為地塞米松誘導3t3-l1成熟脂肪細胞胰島素抵抗的形成；

圖8為女貞花提取物對胰島素抵抗狀態(tài)下3t3-l1脂肪細胞糖吸收的作用。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步地詳細介紹，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。

下述實施例中，如無特殊說明，乙醇的百分比均指體積百分比。

實施例1

一種女貞花提取物，所述女貞花提取物為女貞花總浸膏、40%乙醇部位浸膏和60%乙醇部位浸膏中的一種或兩種以上的混合物。

上述女貞花提取物的提取方法，具體包括如下步驟：

1）取475g干燥女貞花，添加石油醚至浸沒女貞花，然后加熱回流提取2次，每次回流提取2h，回流提取結束后，過濾，所得殘渣揮干石油醚，用70%乙醇室溫下浸漬提取3次（70%乙醇添加量以浸沒殘渣為宜），每次浸漬提取3天，合并提取液并濃縮，得到女貞花總浸膏；

2）女貞花總浸膏用50%乙醇溶解后，用d101型大孔樹脂吸附分離，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，每個梯度洗脫五個柱體積，每個柱體積2000ml，洗脫液濃縮后，分別得到水部位、20%乙醇部位7g、40%乙醇部位60g、60%乙醇部位24g、95%乙醇部位16g。

應用試驗1、女貞花提取物對3t3-l1前脂肪細胞活性的影響

以3t3-l1前脂肪細胞為細胞模型，在誘導分化過程中加入上述實施例1制備的女貞花提取物，油紅o染色鑒定3t3-l1前脂肪細胞分化程度。

儀器材料：儀器：制備型高效液相色譜儀（waters2535q）；旋轉蒸發(fā)儀（eyela，東京理化器械株式會社）；lc-3000高效液相制備柱色譜（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；am-400超導核磁共振儀（bruker）；電子天平（美國mettler-toledo公司）；tgl-16gr高速臺式冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；雙人單面凈化工作臺（型號：sw-cj-2fd型廠家：蘇州凈化設備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號：3111型，廠家：thermoscientific）；倒置顯微鏡（ckx31型，olympus）；全溫振蕩培養(yǎng)箱（hzp型上海精宏實驗設備有限公司）；離心沉淀器（800型上海手術器械廠）；各種規(guī)格移液槍（transferpette）；數(shù)碼相機（canoneos450d）倒置顯微鏡（nikoneclipsets100）；gf254硅膠薄層板（煙臺匯友硅膠開發(fā)有限公司）；40~80目硅膠、200~300目硅膠和硅膠h（煙臺匯友硅膠開發(fā)有限公司）；sephadexlh-20（瑞典pharmacia公司）；d101型大孔樹脂（天津海光化工有限公司）；c-18（德國merk公司）；其余試劑均為分析純；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，20161105147）；葡萄糖標準品（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號：20161001）；小鼠游離脂肪酸測定試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號：201609）；胎牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司，批號：20160923）；dmem高糖培養(yǎng)液（北京索萊寶科技公司，批號：f08hv090）；青霉素鏈霉素混合液（solarbio，批號：20161029）；胰酶細胞消化液（碧云天，編號：c0210）；二甲基亞砜（sigmashbc3313v）；insulin（sigma）；噻唑藍（上海華藍科技有限公司）；油紅o（sigmaslbp5248v）；ibmx（sigma，bcbh1214v）；dex（sigmabcbm4557v）。羅格列酮片（成都恒瑞制藥有限公司）；洛伐他汀膠囊（揚子江藥業(yè)集團有限公司，20160109）；細胞株：3t3-l1小鼠胚胎成纖維細胞購于中科院細胞庫。女貞花于2015年6月采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)濕地公園，由貴州大學張前軍教授鑒定為女貞（ligustrumlucidumait.）的花。標本現(xiàn)存于河南大學中藥研究所。

實驗方法：

細胞培養(yǎng)與凍存：

3t3-l1前脂肪細胞，用含15%胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)液（含青霉素：10u/ml、鏈霉素10μg/ml）在37℃、5%co2飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液一次，當細胞融合至80%后，棄培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶液1ml，作用1min左右，加入2倍體積培養(yǎng)液終止消化，用吹打管將貼壁細胞吹打入培養(yǎng)液。將細胞懸液移入無菌離心管，1000rpm離心5min，棄上清。細胞傳代：1個培養(yǎng)瓶收集的細胞沉淀用1ml新培養(yǎng)液吹散，按1：2比例傳代。細胞凍存：2個培養(yǎng)瓶收集的細胞沉淀用1.2ml凍存液（含10%dmso的胎牛血清）吹散轉入凍存管放入程序降溫盒，然后放入-80℃冰箱過夜，取出凍存管放入液氮罐中保存。

細胞毒活性檢測：

收集對數(shù)生長期的3t3-l1前脂肪細胞，調整細胞懸液濃度，以每孔2×10⁵的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl細胞懸液。將細胞置于37℃、5%co2及飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞融合至60%-70%，加入濃度梯度的藥物，每個板設正常對照組、溶媒對照組（0.1%dmso）、提取物給藥組，設6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μlmtt溶液（5g/l），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入100μldmso置震蕩培養(yǎng)箱（100r/min）中震蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶標儀570nm波長處測量各孔的吸光度值（od值）。

表1：女貞花總浸膏、60%乙醇部位對3t3-l1前脂肪細胞細胞活性影響（n=6）

由表1可知，正常對照組與溶媒對照組吸光度值相比，差異沒有統(tǒng)計學意義，說明溶劑對細胞活力不產生影響。女貞花總浸膏、60%乙醇部位劑量組與正常對照組吸光度值相比，差異沒有統(tǒng)計學意義，說明女貞花總浸膏、60%乙醇部位劑量組均沒有細胞毒活性，即女貞花總浸膏、60%乙醇部位在300μg/ml劑量范圍以下均可設為給藥劑量。

表2:女貞花40%乙醇部位對3t3-l1前脂肪細胞活性的影響（n=6）

由表2可知，正常對照組與溶媒對照組吸光度值相比，差異沒有統(tǒng)計學意義，說明溶劑對細胞活力不產生影響。40%乙醇部位劑量組與正常對照組吸光度值相比，差異沒有統(tǒng)計學意義，說明40%乙醇部位所有劑量組均沒有細胞毒活性。即40%乙醇部位在300μg/ml劑量范圍以下均可設為給藥劑量。

應用試驗2、女貞花提取物對3t3-l1前脂肪細胞分化的影響

取對數(shù)生長期的3t3-l1前脂肪細胞傳代培養(yǎng)，按1.5×10⁵的密度接種到96孔板中，細胞完全融合后，接觸抑制48h，然后更換含分化誘導劑a（0.5mmibmx、1μmdex、10μg/mlinsulin）的dmem高糖培養(yǎng)液（含15%胎牛血清），同時加藥（分為空白組、模型組、洛伐他汀組（50μm）、給藥組）。3d后換成含誘導分化劑b（含有10μg/mlinsulin）的dmem高糖培養(yǎng)液（含15%胎牛血清），2d后換常規(guī)培養(yǎng)液，此后隔天換液，培養(yǎng)至12d，小心吸除培養(yǎng)液，冰冷pbs洗2次，晾干，每孔加入50μl4%多聚甲醛固定40min，pbs再洗2遍，晾干，加入油紅o染色30min，pbs洗2次，超純水洗2次，倒置顯微鏡下數(shù)碼相機拍照（100×）。每孔加入100μl異丙醇，40min后使用酶標儀在495nm波長下測定吸光度。結果如下。

數(shù)據(jù)處理：結果采用均值±sd值表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用spss19.0軟件單因素方差分析法（one-wayanova）比較其顯著性差異。

表3：女貞花總浸膏對3t3-l1前脂肪細胞分化的影響（n=6）

由表3、圖1、2可知，與模型組相比，洛伐他汀組、女貞花總浸膏300、100μg/ml時，油紅染色水平顯著降低（p＜0.05），女貞花33、11μg/ml時，油紅染色水平顯著降低（p＜0.01）。洛伐他汀分化抑制率為：35.27%，女貞花總浸膏分化抑制率分別為：18.39%、21.80%、32.68%、31.62%。說明洛伐他汀和女貞花總浸膏均能夠抑制前脂肪細胞的分化，說明其具有用于預防和改善肥胖癥的潛質。

表4:女貞花40%乙醇部位對3t3-l1前細胞分化的影響（n=6）

由表4、圖1、3可知，女貞花40%乙醇部位所有劑量組油紅染色水平?jīng)]有變化，說明女貞花40%乙醇部位不能抑制3t3-l1前脂肪細胞的分化。

表5：女貞花60%乙醇部位對3t3-l1前脂肪細胞分化的影響（n=6）

由表5、圖1、4可知，女貞花60%乙醇部位300μg/ml劑量組油紅染色水平顯著降低（p<0.001），說明女貞花60%乙醇部位300μg/ml劑量組能夠抑制3t3-l1前脂肪細胞分化，其中，女貞花60%乙醇部位300μg/ml劑量組分化抑制率為24.24%。女貞花60%乙醇部位100、33和11μg/ml劑量組油紅染色水平?jīng)]有變化，說明女貞花60%乙醇部位100、33和11μg/ml劑量組不能抑制3t3-l1前脂肪細胞的分化。

應用試驗3女貞花提取物對3t3-l1脂肪細胞脂代謝作用影響

取對數(shù)生長期的3t3-l1前脂肪細胞傳代培養(yǎng)，按1.5×10⁵的密度接種到96孔板中，細胞完全融合后，接觸抑制48h，然后更換含分化誘導劑a（0.5mmibmx、1μmdex、10μg/mlinsulin）的dmem高糖培養(yǎng)液（含15%胎牛血清），3d后換成誘導分化劑b（10μg/mlinsulin）的dmem高糖培養(yǎng)液（含15%胎牛血清），2d后換含15%胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)液，此后隔天換液，培養(yǎng)至12d，誘導分化為成熟脂肪細胞。成熟脂肪細胞分組、加藥（分為空白組，羅格列酮組（9.52μm），給藥組），繼續(xù)培養(yǎng)48h，無菌管收集細胞培養(yǎng)上清，2600g離心20min，仔細收集上清。使用小鼠游離脂肪酸測定試劑盒測定游離脂肪酸的含量。結果如下。

圖5為女貞花提取物對3t3-l1脂肪細胞脂代謝作用影響。由圖5可知，100μg/ml女貞花總浸膏（te）、33μg/ml40%乙醇部位（40%ef）劑量組游離脂肪酸含量高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），11μg/ml女貞花40%乙醇部位劑量組游離脂肪酸含量高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.001），11μg/ml60%乙醇部位（60%ef）劑量組游離脂肪酸含量高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），說明100μg/ml女貞花總浸膏、33、11μg/ml40%乙醇部位、11μg/ml60%乙醇部位均能促進脂肪細胞內甘油三酯分解代謝為游離脂肪酸，具有降低脂肪細胞內甘油三酯含量的作用，說明其可以用于促進脂肪細胞脂代謝，具有用于預防和改善肥胖癥的潛質。

應用試驗4女貞花提取物對3t3-l1成熟脂肪細胞糖吸收的影響

前脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞，實驗過程同應用試驗3。分組加藥（分為空白組、羅格列酮組（9.52μm）、給藥組），繼續(xù)培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液上清按葡萄糖測定試劑盒檢測培養(yǎng)液中葡萄糖含量。

圖6為女貞花總浸膏、40%乙醇部位、60%乙醇部位對3t3-l1脂肪細胞糖吸收作用。由圖6可知，羅格列酮、300、11μg/ml女貞花總浸膏、33、11μg/ml40%乙醇部位、100μg/ml60%乙醇部位葡萄糖含量低于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。33μg/ml總浸膏、33、11μg/ml60%乙醇部位葡萄糖含量低于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01），說明羅格列酮、300、33和11μg/ml總浸膏、33和11μg/ml40%乙醇部位、100、33、11μg/ml60%乙醇部位均能促進脂肪細胞對外周葡萄糖的攝取，導致培養(yǎng)基中葡萄糖含量降低程度大于空白組葡萄糖含量降低程度，說明其具有預防和治療糖尿病的潛質。

應用試驗5、在胰島素抵抗狀態(tài)下女貞花提取物對3t3-l1成熟脂肪細胞糖吸收的影響

前脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞，實驗過程同應用試驗3。成熟脂肪細胞分為空白組和誘導抵抗組。誘導抵抗組給予1μm地塞米松作用3d，取上清測定葡萄糖含量，鑒定胰島素抵抗模型造模成功。胰島素抵抗組分組加藥（分為空白組，羅格列酮組（20μm），給藥組，取上清測定糖值。

圖7為地塞米松誘導3t3-l1成熟脂肪細胞胰島素抵抗的形成。由圖7可知，抵抗組葡萄糖含量高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。說明抵抗組脂肪細胞對外周葡萄糖的攝取作用降低，胰島素抵抗模型造模成功。

圖8為女貞花總浸膏、40%乙醇部位、60%乙醇部位對胰島素抵抗狀態(tài)下3t3-l1脂肪細胞糖吸收的作用。由圖8可知，羅格列酮、33、11μg/ml女貞花總浸膏、33、11μg/ml60%乙醇部位葡萄糖含量低于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。300、100μg/ml總浸膏葡萄糖含量低于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01）。40%乙醇部位與空白組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。說明，33、11μg/ml女貞花總浸膏、60%乙醇部位所有劑量組均能促進胰島素抵抗狀態(tài)下脂肪細胞對外周葡萄糖的攝取，說明可以用于預防和治療糖尿病。

結論：女貞花提取物可以抑制前脂肪細胞分化、促進脂肪細胞脂代謝，以及促進脂肪細胞糖吸收和改善胰島素抵抗，因此可能成為治療2型糖尿病、肥胖癥的一種新型化合物，即其具有潛在的降血糖、改善胰島素抵抗的作用。因此，可被用作制備制備預防和治療新陳代謝綜合征藥物和/或保健品，尤其是預防和改善糖尿病藥物、肥胖癥藥物。