專利名稱：用于改善造血功能的茯苓提取物,含它們的藥物組合物及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于改善造血功能的茯苓提取物，含它們的藥物組合物及制備方法。
茯苓作為藥物使用已有很長的歷史，藥用茯苓是多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos[Schw]Wolf)的干燥菌核中的白茯苓部分。中國醫(yī)藥著作中記載茯苓具有滲濕利水、安心寧神、易脾和胃等功效。
現(xiàn)已從白茯苓中分離出的一組羊毛甾烷三萜烯類化合物，它們有共同的母核和不同的取代基團。從茯苓提取物中已分出茯苓酸、豬苓酸-C、3-β-羥基羊毛甾烷-7，9(11)，24-三烯-21-羧酸、3-酮-6-乙氧基-7，11-去氫茯苓酸、乙酰茯苓酸、去氫-茯苓酸、以及3-酮-6，16-α-二羥基羊毛甾烷-7，9(11)，24(31)-三烯-21-羧酸等多種成分，見李靜，黎紅，許津中國藥學雜志1997，32(7)401；許先棟，許津，張致平中國藥物化學雜志1994，4(1)23；Takaaki，Tai et al.Phytochemistry1992，31(7)2548；兼松明子，名取信策Yakugaku Zasshi 1970，90(4)475；Valisollalao，J.et al Bull Soc Chim Fr。1980，II 473；Cort LA，et al J Chem Soc 1954，3713；Takaaki Tai et alPhytochemistry 1993，32(5)1239；Takaaki Tai et al Phytochemistry1991，30(8)2796。
本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)茯苓提取物可以誘生多種集落刺激因子(CSFs)，CSFs是一組細胞調(diào)節(jié)因子，其功能是調(diào)控骨髓干細胞的增殖與分化，因此，茯苓提取物具有促進和調(diào)節(jié)干細胞增生和分化的能力，從而改善機體的造血功能。
本發(fā)明目的是尋找并開發(fā)茯苓的新的醫(yī)藥用途。
本發(fā)明第一方面涉及用于改善造血功能的茯苓提取物。
本發(fā)明再一方面涉及用于改善造血功能的藥物組合物，其包括茯苓提取物及藥用載體或賦形劑。
本發(fā)明還涉及茯苓提取物在制備用于改善造血功能的藥物中用途。
本發(fā)明進一步涉及制備茯苓提取物的方法，其包括i)將茯苓粉碎，然后用選自醇、酮、酯或鹵代烷的有機溶劑或有機溶劑與水的混合物提取，ii)將i)提取物減壓除去溶劑，所得殘余物用酸酸化到pH2-3，得茯苓提取物，iii)如需要，得ii)中茯苓提取物溶于醇，過濾除去不溶物，減壓除去醇，得純化的茯苓的提取物，如需要或必要，將所得純化的茯苓提取物懸浮于水中，用堿調(diào)節(jié)茯苓提取物的水懸浮液pH至10-11，過濾除去不溶物，濾液用酸調(diào)節(jié)至3以下，得進一步純化的茯苓提取物；或將ii)中茯苓提取物懸浮于水中，用堿調(diào)節(jié)該水懸浮液pH至10以上，過濾，往濾液中加入選自酯，鹵化烷，芳香烴或醚的有機溶劑，用酸酸化有機相pH至3以下，減壓蒸干有機相，得進一步純化的茯苓提取物。
本發(fā)明還涉及改善造血功能的方法，其包括將有效量的本發(fā)明茯苓提取物給予需改善造血功能的患者。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用的茯苓是白茯苓。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“醇”舉例講可是甲醇，乙醇或丙酮等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“酮”舉例講可是丙酮或丁酮等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“酯”舉例講可以是乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯或乙酯戊酯等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“鹵代烷”舉例講可以是二氯甲烷或三氯甲烷等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“芳香烴”舉例講可以是苯或甲苯等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“醚”舉例講可以是乙醚等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“堿”舉例講可以是堿金屬或堿土金屬氫氧化物或碳酸鹽或的碳酸氫鹽如NaOH，KOH，K2CO3或Na2CO3等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“酸”舉例講可以是無機酸或有機酸如鹽酸，硫酸，磷酸，乙酸等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用術語“患者”舉例講可以是哺乳動物，尤其是人。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明茯苓提取物易溶于95％乙醇。本發(fā)明茯苓提取物的乙醇溶液(100μg/ml)在200-700mm進行紫外全波長掃描，于241-243nm和235-236處顯示出特異吸收峰(見

圖1)，在252mm處有肩。在1％茯苓提取物的乙醇溶液，茯苓提取物的消光值[A](λ242nm)＝149。
更具體講，本發(fā)明的茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯類化合物，優(yōu)選至少85重量％，更優(yōu)選至少95重量％。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的有效劑量的茯苓提取物以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-90重量％的茯苓提取物。藥物組合物可根據(jù)本領域已知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將茯苓提取物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，制成可作為人用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明的茯苓提取物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等。可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分茯苓提取物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分茯苓提取物制成微囊劑，混懸于水性介質中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發(fā)明茯苓提取物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。
下面的實施例及生物活性實驗用來進一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。
實施例1茯苓提取物的制備1kg茯苓粉，用10L 80％乙醇分三次提取，每次均在室溫下攪拌兩小時，抽濾，合并三次濾液，減壓蒸去乙醇，水溶液酸化到pH3以下，茯苓提取品即沉淀出來，過濾，收集沉淀。得5g茯苓粗提品，其中羊毛甾烷三萜烯類化合物含量80％。
將上面所得茯苓粗提品溶于95％乙醇中，過濾，除去不溶物，減壓蒸去乙醇，得到第一步純化的茯苓提取物。將第一次純化的茯苓提取物按100mg/ml的量溶于1M的NaOH中，用水稀釋10倍，過濾，除去不溶物，用6N HCl調(diào)節(jié)pH到3以下，茯苓提取物沉淀出來，抽濾，濾餅用水洗至中性。在真空干燥箱中抽干，研成粉末，得4g茯苓提取品，其中羊毛甾烷三萜烯類化合物含量＞85％。
生物活性本發(fā)明茯苓提取物對小鼠受γ射線照射所導致的損傷的恢復昆明小鼠，雌性，體重22-26克。茯苓提取物(以下簡稱F)以125mg/kg劑量給予小鼠，用蒸餾水配制。
實驗動物隨機分成三組正常對照組，單純照射組，上述茯苓提取物劑量組。每組10只動物，實驗重復一次。
實驗動物Co[60]γ線全身一次性照射，劑量率為1.86-1.84倫/分，總劑量7.5Gy。照射后立即灌胃給藥，每天一次，連續(xù)六天。對照組給生理鹽水。各組動物于照射后第七天稱體重，測外周血細胞數(shù)，稱脾重，計算脾臟表面宏觀脾結節(jié)數(shù)，取股骨測定骨髓DNA含量。結果見表1。表1茯苓提取物對小鼠受γ射線照射所導致的損傷的恢復組別 白細胞 血小板 脾臟系數(shù) CFU-S 骨髓DNA單純照射組1 1 11 1F 125mg/kg1.8 1.4 1.5 12.4 1.6注上表給藥組的數(shù)值均為單純照射組的倍數(shù)。CFU-S脾結節(jié)數(shù)茯苓提取物對狗注射環(huán)磷酰胺(CY)所導致的損傷的保護作用實驗使用北京地區(qū)家狗，雄性，年齡1-2歲，體重12-16公斤。茯苓提取物按小鼠的最好有效劑量，用體表面積換算成狗的給藥劑量，劑量為19.86mg/kg。實驗分組單純環(huán)磷酰胺組(簡稱CY)，上述茯苓提取物劑量組。8只狗，適應性飼養(yǎng)2周左右，按體重隨機分組，每組四只。給藥前稱體重，測外周血紅、白細胞，血小板，網(wǎng)織紅細胞兩次。狗靜脈注射環(huán)磷酰胺(5mg/kg)，每日一次，連續(xù)5天。茯苓提取物在第一次注射環(huán)磷酰胺的同時口服給藥，連續(xù)7天，每天一次。實驗動物觀察期為21天。實驗結果臨床癥狀及動物存活情況給藥后單純環(huán)磷酰胺組4只動物于7-13天均出現(xiàn)一次性食欲變差，而給茯苓提取物劑量組4只動物沒有出現(xiàn)食欲變差現(xiàn)象。單純環(huán)磷酰胺組給藥后有2只動物于5-11天體溫升高，給予茯苓提取物的動物均未出現(xiàn)體溫升高現(xiàn)象。因此臨床癥狀表明茯苓提取物能減輕動物化療引起的臨床反應。
血液成分的變化單純環(huán)磷酰胺組給藥后外周血白細胞總數(shù)呈進行性減少，第11天降至最低值。此后緩慢上升，至藥后21天接近正常的70％。以19.86mg/kg劑量給予的茯苓提取物對粒細胞有非常顯著的保護作用，同時對于淋巴細胞和血小板，茯苓提取物也有保護作用。對于網(wǎng)織細胞，給藥組明顯高于對照組，茯苓提取物在藥后第5、7天都呈上升趨勢。結果見表2。表2茯苓提取物對狗注射環(huán)磷酰胺所導致血細胞的損傷的保護作用組別 粒細胞 淋巴細胞 血小板 網(wǎng)織細胞單純給CY組-61.6 -77.8-50.3 -96.2F(19.86mg/kg)-5.5 -30.0-30.0+25.0注表中數(shù)字為細胞受抑制后各種細胞下降或上升的百分數(shù)茯苓提取物對注射環(huán)磷酰胺的狗的骨髓細胞的影響實驗第9天取髂骨骨髓培養(yǎng)，涂片，第21天活殺動物取胸骨骨髓進行CFU-GM，CFU-E，BFU-E，CFU-MEG細胞培養(yǎng)，茯苓提取物對于粒單細胞結節(jié)數(shù)和巨核細胞結節(jié)數(shù)有明顯的保護作用，能提高CFU-GM和CFU-MEG的產(chǎn)率。結果見表3。表3茯苓提取物對注射環(huán)磷酰胺的狗的骨髓細胞的影響組別 CFU-GMCFU-MEGCFU-EBFU-E9天 21天21天 21天 21天單純給CY組1 1 1 11F(19.86mg/kg) 7.40 1.111.94 1.22 1.02(注表中數(shù)字是給茯苓提取物的動物的骨髓細胞中各種祖細胞為單純給CY動物的祖細胞的倍數(shù)。)CFU-GM粒單細胞結節(jié)數(shù)，CFU-MEG巨核細胞結節(jié)數(shù)，CFU-E紅細胞結節(jié)數(shù)，BFU-E網(wǎng)織紅細胞結節(jié)數(shù)。給藥后21天各組活殺狗未見體表及各臟器有明顯異常，病理檢查結果表明茯苓提取物能明顯促進血液細胞的增殖，引起造血細胞再生是多譜系的。
茯苓提取物對LPS激活的巨噬細胞產(chǎn)生的CSFs的影響。
CSFs的誘生實驗使用巨噬細胞作為CSFs的產(chǎn)生細胞，首先制備巨噬細胞單層，在細胞培養(yǎng)液中加入脂多糖(10μg/ml)，培養(yǎng)2小時，再加入不同劑量的茯苓提取物，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集巨噬細胞的培養(yǎng)液，其中含巨噬細胞產(chǎn)生的CSFs。
另取小鼠骨髓細胞制成懸液，加入上述的巨噬細胞的各組培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后每管加入D-[3H]-半乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)20小時，離心分出骨髓細胞，測定細胞中3H-半乳糖的摻入量。在骨髓細胞增殖時，半乳糖參加細胞膜的合成，因此半乳糖的摻入率可以代表細胞的增殖的多少，而細胞的增殖又決定于CSFs的量，因此，半乳糖的參入量與CSFs的量成正比。結果見圖2。
權利要求
1.用于改善造血功能的茯苓提取物。
2.用于改善造血的藥物組合物，其包括茯苓提取物的及藥用載體或賦形劑。
3.權利要求1的茯苓提取物，其中茯苓是白茯苓。
4.權利要求1的茯苓提取物，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯類化合物。
5.權利要求1的茯苓提取物，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷三烯萜類化合物。
6.權利要求2的藥物組合物，其中茯苓是白茯苓。
7.權利要求2的藥物組合物，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷烯類化合物。
8.權利要求2的藥物組合物，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷烯類化合物。
9.茯苓提取物用于制備用于改善造血功能的藥物的用途。
10.權利要求9的用途，其中茯苓是白茯苓。
11.權利要求9的用途，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯類化合物。
12.權利要求9的用途，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷三萜烯類化合物。
13.茯苓提取物的制備方法，其包括i)將茯苓粉碎，然后用選自醇、酮、酯或鹵代烷的有機溶劑或有機溶劑與水的混合物提取，ii)將i)提取物減壓除去溶劑，所得殘余物用酸酸化到pH2-3，得茯苓提取物，iii)如需要，得ii)中茯苓提取物溶于醇，過濾除去不溶物，減壓除去醇，得純化的茯苓的提取物，如需要或必要，將所得純化的茯苓提取物懸浮于水中，用堿調(diào)節(jié)茯苓提取物的水懸浮液pH至10-11，過濾除去不溶物，濾液用酸調(diào)節(jié)至3以下，得進一步純化的茯苓提取物；或將ii)中茯苓提取物懸浮于水中，用堿調(diào)節(jié)該水懸浮液pH至10以上，過濾，往濾液中加入選自酯，鹵化烷，芳香烴或醚的有機溶劑，用酸酸化有機相pH至3以下，減壓蒸干有機相，得進一步純化的茯苓提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于改善造血功能的茯苓提取物,含它們的藥物組合物及制備方法。
文檔編號A61P7/00GK1329900SQ0011930
公開日2002年1月9日 申請日期2000年6月27日 優(yōu)先權日2000年6月27日
發(fā)明者許津, 張秀敏, 王穎立 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所