本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，提供了一種主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體。

技術(shù)背景

現(xiàn)階段，針對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥，根據(jù)其耐藥的發(fā)生機(jī)制，抑制通路中關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，是改善和提高現(xiàn)有抗腫瘤藥物敏感性的有效方法。腫瘤耐藥包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥兩大類。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)與腫瘤細(xì)胞耐藥有密切的關(guān)系，一般發(fā)生emt的腫瘤細(xì)胞可獲得凋亡抵抗，而凋亡抵抗通常導(dǎo)致腫瘤放、化療耐受。研究資料證明，emt在多種腫瘤的化療耐藥中發(fā)揮重要作用，涉及的化療藥物包括紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等。因此，可通過靶向emt來逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生emt時(shí)，細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化：e-鈣黏蛋白(e-cadherin)表達(dá)下降、n-鈣黏蛋白(n-cadherin)表達(dá)增加、β-連環(huán)素(β-catenin)由細(xì)胞膜上向細(xì)胞質(zhì)中分布等等。因此，阻斷或反轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生emt時(shí)產(chǎn)生的變化，能抑制腫瘤細(xì)胞emt的發(fā)生，例如可通過針對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生emt時(shí)特異表達(dá)的分子標(biāo)志物，阻斷其功能或者信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。n-cadherin是腫瘤細(xì)胞發(fā)生emt時(shí)細(xì)胞膜上顯著高表達(dá)的分子標(biāo)志物，是腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性的關(guān)鍵分子，因此n-cadherin是一個(gè)很有潛力的治療靶標(biāo)來阻斷emt。環(huán)五肽adh-1，能夠選擇性地結(jié)合并阻斷n-cadherin，可作為n-cadherin的靶向分子用于腫瘤emt細(xì)胞的靶向遞送和治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體，采用環(huán)五肽adh-1作為主動(dòng)靶向的靶頭，利用受體與配體之間的相互作用，靶向作用于腫瘤emt細(xì)胞表面的n-cadherin，進(jìn)而阻斷emt過程，有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。采用脂質(zhì)體作為載體，脂質(zhì)體由中性磷脂制備，其理化性質(zhì)與細(xì)胞接近，具有良好的生物相容性，同時(shí)載體的表面電荷為中性，降低了載體對(duì)細(xì)胞的毒性。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體，采用環(huán)五肽-聚乙二醇-磷脂adh-1-peg2000-dspe對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，該新型抗耐藥脂質(zhì)體對(duì)腫瘤emt細(xì)胞具有主動(dòng)靶向性，能夠提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。

上述主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的制備方法為：

第一步，合成靶向材料環(huán)五肽-聚乙二醇-磷脂adh-1-peg2000-dspe

將二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-n-羥基丁二酰亞胺-聚乙二醇nhs-peg2000-dspe和環(huán)五肽adh-1按1.1～2:1的摩爾比溶于無水無氨的二甲基甲酰胺dmf后，置于茄型瓶中，加入適量三乙胺調(diào)節(jié)ph至8左右；室溫、避光攪拌48h后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為3500的透析袋中，兩端夾緊，用去離子水透析24h，以除去dmf及反應(yīng)液中其他雜質(zhì)；將透析袋中的溶液冷凍干燥后，得到產(chǎn)物adh-1-peg2000-dspe，產(chǎn)物可用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。其中nhs-peg2000-dspe中聚乙二醇嵌段的分子量為2000。

第二步，合成主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體

將卵磷脂、膽固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂、adh-1-peg2000-dspe室溫下溶于氯仿后，置于茄型瓶中，37℃條件下減壓旋蒸，除去有機(jī)溶劑，形成均勻透明的脂膜；再加入預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液，渦旋震蕩水化至脂膜完全脫落后，采用細(xì)胞破碎儀將脂膜破碎，破碎至溶液中出現(xiàn)藍(lán)色乳光為止；最后將上述溶液用葡聚糖凝膠柱進(jìn)行純化，即得到該主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體。所述的卵磷脂、膽固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂、adh-1-peg2000-dspe的摩爾比為65:20:4.35:0.5～1。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明方法制備方法簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟、具有廣闊的應(yīng)用前景，也為相應(yīng)給藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和發(fā)展打下基礎(chǔ)。制備得到的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體能夠顯著增加對(duì)腫瘤emt細(xì)胞的靶向性，提高腫瘤emt細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。制備載體采用中性磷脂，使其生物毒性明顯降低。

附圖說明

圖1為adh-1-peg2000-dspe的質(zhì)譜結(jié)果圖；

圖2(a)為透射電鏡觀察到的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)果圖；

圖2(b)為采用動(dòng)態(tài)光散射儀分析得到的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的粒徑分布圖；

圖3(a)為未經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤mcf7細(xì)胞形態(tài)圖；

圖3(b)為紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞形態(tài)圖；

圖4(a)為采用激光共聚焦顯微鏡觀察到的紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的mcf7細(xì)胞表面n-cadherin的表達(dá)情況；

圖4(b)為采用激光共聚焦顯微鏡觀察到未經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤mcf7細(xì)胞表面n-cadherin的表達(dá)情況；

圖5為免疫印跡分析未經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤mcf7細(xì)胞和紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)情況圖；

圖6為紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞對(duì)香豆素標(biāo)記的未經(jīng)adh-1修飾的脂質(zhì)體的攝取圖，其中細(xì)胞核用dapi進(jìn)行染色。

圖7為紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞對(duì)香豆素標(biāo)記的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的攝取圖，其中細(xì)胞核用dapi進(jìn)行染色。

圖8為提前用adh-1孵育細(xì)胞后，紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞對(duì)香豆素標(biāo)記的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的攝取圖，其中細(xì)胞核用dapi進(jìn)行染色。，

圖9為用cck-8法測(cè)定的包載紫杉醇的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體a-lp、包載紫杉醇的未經(jīng)adh-1修飾的脂質(zhì)體lp和游離紫杉醇ptx對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

第一步，合成靶向材料—環(huán)五肽-聚乙二醇-磷脂(adh-1-peg2000-dspe)

精密稱取5mgadh-1肽和10mgnhs-peg2000-dspe，加入新鮮蒸餾的無水無氨二甲基甲酰胺(dmf)將其溶解。在室溫，磁力攪拌下，將nhs-peg2000-dspe溶液逐滴加入到adh-1溶液的茄型瓶中，同時(shí)加入適量三乙胺調(diào)節(jié)ph至8左右，室溫、避光攪拌48h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為3500的透析袋中，兩端夾緊，用去離子水透析24h，以除去dmf及反應(yīng)液中其他雜質(zhì)。隨后將透析袋中的溶液冷凍干燥，即得到所需產(chǎn)物adh-1-peg2000-dspe。

將所得樣品，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof-ms)進(jìn)行表征，圖1為adh-1-peg2000-dspe的maldi-tof-ms結(jié)果圖：可以看到圖中有兩個(gè)峰，其中前峰是未反應(yīng)完全的dspe-peg2000-nhs，為了使adh-1充分反應(yīng)它在反應(yīng)中的加入是過量的。adh-1的分子量是528，dspe-peg-nhs的分子量是2986，因此，材料的理論分子量為3514，質(zhì)譜圖后峰的分子量主要分布在3500，證明靶向材料的成功合成。

第二步，合成主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體

將15.8mg卵磷脂、2.4mg膽固醇、4.0mg甲氧基-聚乙二醇-磷脂、0.6mgadh-1-peg2000-dspe溶解于氯仿后，37℃條件下減壓旋蒸，除去有機(jī)溶劑，使其在茄型瓶底形成均勻透明的脂膜；然后加入預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液渦旋、震蕩、水化至脂膜完全脫落，用細(xì)胞破碎儀，破碎至出現(xiàn)藍(lán)色乳光；最后將該溶液加到葡聚糖凝膠柱中，用ph為7.4的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集脂質(zhì)體部分，即得到主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體。

將主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體滴加于透射電子顯微鏡(tem)載樣銅網(wǎng)上，待自然晾干后在tem下觀察，圖2(a)中可見主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體為類圓形納米粒。

將主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體用動(dòng)態(tài)光散射儀進(jìn)行粒徑分析，圖2(b)為其粒徑分布，可以看出主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的粒徑約為90nm，分布較為均一。

腫瘤emt細(xì)胞模型的建立及表征

細(xì)胞模型的建立方法：先用初濃度為2nm的紫杉醇誘導(dǎo)mcf7細(xì)胞一周，再逐級(jí)增大紫杉醇濃度，進(jìn)行誘導(dǎo)，至腫瘤mcf7細(xì)胞發(fā)生emt(紫杉醇的終濃度為24nm，共誘導(dǎo)六個(gè)月)。圖3(a)、(b)是用顯微鏡觀察到的腫瘤mcf7發(fā)生emt前后的形態(tài)圖。

將未經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤mcf-7細(xì)胞和紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞接種于放置蓋破片的24孔板中，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞爬片。移除培養(yǎng)基，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(500μl/孔)洗兩次，每次5min；室溫條件下，用4％多聚甲醛(500μl/孔)固定15min，再用磷酸鹽緩沖液洗三次；用5％牛血清白蛋白封閉1h；然后用n-cadherin的抗體孵育2h，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(不加抗體，其他處理?xiàng)l件相同)，孵育后用磷酸鹽緩沖液沖洗三次；再用fitc標(biāo)記的二抗孵育1h，用磷酸鹽緩沖液沖洗三次；再用5μg/ml的dapi(400μl/孔)，避光條件下染核15min，最后用磷酸鹽緩沖液沖洗三次；將蓋玻片取出，置于載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。如圖4所示，可以看出紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞表面的n-cadherin的表達(dá)量顯著高于未經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤mcf7的表達(dá)量，說明紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞確實(shí)發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)也表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體通過n-cadherin這一靶標(biāo)來實(shí)現(xiàn)靶向抑制腫瘤emt細(xì)胞，提高對(duì)化療藥物敏感性的可行性。

接著，進(jìn)行了免疫印跡分析，如圖5所示，與未經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤mcf7細(xì)胞相比，紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞的e-cadherin的表達(dá)量下降，vimentin的表達(dá)量增加，符合發(fā)生emt的腫瘤細(xì)胞的變化，進(jìn)一步證明了腫瘤emt細(xì)胞模型的成功建立。

紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞對(duì)主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的攝取

將紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞接種于放置蓋破片的24孔板中，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞爬片。移除培養(yǎng)基，分別用包載香豆素的未經(jīng)adh-1修飾的脂質(zhì)體和主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體處理細(xì)胞2h，同時(shí)設(shè)置受體提前封閉對(duì)照組：先用游離的adh-1處理細(xì)胞1h，然后再用包載香豆素的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體處理2h。用激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組脂質(zhì)體在紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞內(nèi)的攝取情況。從圖6和圖7顯示的結(jié)果可以看出：本發(fā)明設(shè)計(jì)的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體在紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞內(nèi)的攝取量明顯高于未經(jīng)adh-1修飾的脂質(zhì)體的攝取量，說明該主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體能主動(dòng)靶向紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞。同時(shí)，從圖8也可以看出提前用游離adh-1處理的對(duì)照組，紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞對(duì)主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的攝取量與實(shí)驗(yàn)組相比有所下降，說明該主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體是通過與紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞表面的n-cadherin的特異性結(jié)合，主動(dòng)靶向進(jìn)入細(xì)胞的。圖6，圖7，圖8的比例尺為50.0μm。

主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性測(cè)定

首先，用cck-8法測(cè)定了游離紫杉醇對(duì)未經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤mcf7細(xì)胞和紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞的半抑制濃度(ic50)，結(jié)果分別為77.7nm和320.7nm，進(jìn)一步證明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤耐藥確實(shí)有密切的聯(lián)系，而且可以初步得出這樣的結(jié)論：腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后，會(huì)產(chǎn)生耐藥，降低對(duì)化療藥物的敏感性。也再次證明，我們發(fā)明的主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體通過靶向腫瘤emt細(xì)胞來抗耐藥的可行性。

接著，用cck-8法測(cè)定了主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性：將紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞(5×10³/孔)接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。分別加入100μl/孔的一系列紫杉醇濃度梯度的游離紫杉醇，包載紫杉醇的未經(jīng)adh-1修飾的脂質(zhì)體和主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體，同時(shí)以加入100μl/孔的完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，然后加入10μl/孔的cck-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1h，最后在酶標(biāo)儀上，于450nm測(cè)定od值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生存率：

細(xì)胞生存率(％)＝(od樣品/od空白)×100％

從圖9顯示的結(jié)果表明：紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞確實(shí)對(duì)紫杉醇產(chǎn)生了耐藥，即使當(dāng)游離紫杉醇的濃度達(dá)到96nm時(shí)，對(duì)腫瘤emt細(xì)胞的生存影響也很小(生存率為90％)；而用包載紫杉醇的主動(dòng)靶向腫瘤emt的新型抗耐藥脂質(zhì)體處理紫杉醇誘導(dǎo)產(chǎn)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞，在紫杉醇的濃度為16nm時(shí)就與游離紫杉醇的生存率產(chǎn)生了顯著性的差異，而且當(dāng)紫杉醇的濃度為96nm時(shí)其生存率僅為50％，經(jīng)計(jì)算，包載紫杉醇的主動(dòng)靶向腫瘤emt的新型抗耐藥脂質(zhì)體處理的細(xì)胞半抑制濃度為96nm，這與游離紫杉醇對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生emt的腫瘤mcf7細(xì)胞的半抑制濃度320.7nm相比有大幅度的下降，這說明：本發(fā)明的主動(dòng)靶向腫瘤emt的新型抗耐藥脂質(zhì)體顯著提高了腫瘤emt細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，起到了逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的效果。

實(shí)施例2

將第一步的adh-1肽和nhs-peg2000-dspe的質(zhì)量5mg和10mg改為5mg和5.5mg；將第二步的adh-1-peg2000-dspe的質(zhì)量0.6mg改為0.9mg；其它制備條件不變，制備主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體。

實(shí)施例3

將第一步的adh-1肽和nhs-peg2000-dspe的質(zhì)量5mg和10mg改為5mg和7.5mg，將第二步的adh-1-peg2000-dspe的質(zhì)量0.6mg改為1.1mg，其它制備條件不變，制備主動(dòng)靶向腫瘤emt細(xì)胞的新型抗耐藥脂質(zhì)體。