本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，具體地說是用物理包裹作用實(shí)現(xiàn)靶向元件修飾在納米膠束藥物中的制備方法及用途。

背景技術(shù)：

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的腦部腫瘤之一，約占腦瘤發(fā)病率的40％，其惡化程度和術(shù)后復(fù)發(fā)率高且侵襲速度快，致使神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人存活期短：臨床上診斷出的ⅰ期或者ⅱ期病人存活時(shí)間為6-8年，ⅲ期病人為3年，而ⅳ期病人一般只有12-18個(gè)月。作為顱內(nèi)腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有許多獨(dú)特的地方，其腫瘤形成和發(fā)展有復(fù)雜的各種壁壘，如酶屏障，血腦屏障(bbb)和腫瘤血腦屏障(bbtb)，阻礙了藥物或藥物輸送系統(tǒng)到達(dá)腫瘤部位。目前治療腦膠質(zhì)瘤的方法主要有手術(shù)、放療和化療。然而因腦膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，且多接近中樞神經(jīng)系統(tǒng)，故難以通過手術(shù)完全切除腫瘤，易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。放射性療法易造成放射性癡呆；常規(guī)化療藥物因?qū)δ[瘤組織無選擇性而往往導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用，使其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療效果不佳，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。

腫瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)是指利用腫瘤組織特殊的生理病理特點(diǎn)，納米載體包載腫瘤診斷或治療藥物構(gòu)建而成的對(duì)腫瘤組織具有靶向定位功能的遞藥系統(tǒng)。由于臨床上常規(guī)化療藥物對(duì)腫瘤組織無靶向性，常導(dǎo)致對(duì)正常組織嚴(yán)重的毒副作用，為避免給病人造成傷害，從而限制了抗癌藥物的給藥用量。成功的腫瘤治療的首要目標(biāo)之一是在盡可能減少對(duì)正常組織傷害的同時(shí)傳遞足夠量的藥物到腫瘤。大部分化療藥物由于對(duì)腫瘤組織用藥量低于最佳劑量會(huì)引起不完整腫瘤反應(yīng)，將會(huì)導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)和抗藥性。但用添加了多肽靶向分子的腫瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)則可以有效的解決這個(gè)問題。

為實(shí)現(xiàn)有效的藥物遞送以及到達(dá)腫瘤部位并蓄積的效果，必須找到一種合適的靶向配體。neuropilin-1(nrp-1)是細(xì)胞表面的一種ⅰ型跨膜糖蛋白，人類許多腫瘤組織上有nrp-1的表達(dá)，包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤，但在相應(yīng)的正常組織上皮細(xì)胞中卻沒有表達(dá)。研究顯示在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理標(biāo)本中檢測(cè)到有nrp-1顯著表達(dá)，且其表達(dá)量隨神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增加。最近有研究者通過多肽篩選技術(shù)篩選出一類具有腫瘤血管穿透性和腫瘤組織穿透性的多肽，這類多肽可以介導(dǎo)與其共價(jià)連接的藥物分子或納米遞藥系統(tǒng)穿透腫瘤血管壁并滲透進(jìn)入腫瘤內(nèi)部，分布到整個(gè)腫瘤組織中，這類多肽被稱為“腫瘤穿透肽”。研究表明rgerppr是nrp-1的特異性配體，表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管的雙重親和性。對(duì)腫瘤血管的親和性可使其靶向腫瘤血管壁，而腫瘤穿透性可使其穿透腫瘤血管壁滲透進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)部，對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和性可使其與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，因此作為靶向分子，這類多肽與一般的腫瘤細(xì)胞靶向分子相比具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。

聚合物膠束是一種核-殼結(jié)構(gòu)體，它具有親水性外殼和疏水性內(nèi)核。疏水內(nèi)核一般由可生物降解的聚合物構(gòu)成，它起著水不溶性藥物儲(chǔ)庫的作用。由于要求聚合物對(duì)細(xì)胞無毒性并能由腎臟代謝。膠束在生物體內(nèi)的分布主要取決于殼的性質(zhì)，同時(shí)，殼的性質(zhì)也對(duì)膠束的穩(wěn)定性及膠束與血漿蛋白、細(xì)胞膜的相互作用起決定性作用，膠束的黏度影響膠束的物理穩(wěn)定性和藥物的釋放行為。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種基于物理包裹作用實(shí)現(xiàn)rgerppr-peg-dspe靶向元件修飾pgg-ptx遞藥系統(tǒng)及制備和應(yīng)用,用于實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向遞藥。本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)可以通過靜脈注射給藥，通過rgerppr介導(dǎo)的靶向作用于腫瘤部位，并可穿透腫瘤血管壁，滲透進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)部。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種物理包裹的腫瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)，特點(diǎn)在于，該系統(tǒng)包括rgerppr多肽修飾的靶向元件，納米膠束及抗腫瘤藥物，所述靶向元件為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-rgerppr(dspe-peg-rgerppr)；所述膠束為聚谷氨酸(pgg)高分子骨架及骨架上的谷氨酸支鏈；所述抗腫瘤藥物為紫杉醇(ptx)。聚谷氨酸高分子骨架和谷氨酸支鏈通過肽鍵連接，在谷氨酸支鏈末端與抗腫瘤藥物ptx通過酯鍵鍵合，形成pgg-ptx，其結(jié)構(gòu)如下：

然后ptx和靶向元件中的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺通過疏水的相互作用，將靶向元件疏水端二硬脂酰磷脂酰乙醇胺包裹進(jìn)入pgg-ptx中，從而形成靶向抗腫瘤納米遞藥系統(tǒng)；式中，r＝na或紫杉醇。

一種上述遞藥系統(tǒng)的制備方法，特點(diǎn)在于，該方法包括如下步驟：

步驟1：制備多肽修飾的靶向元件：將多肽rgerppr的巰基與二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺的馬來酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)，連接組成靶向元件。反應(yīng)方程式如下：

步驟2:分別稱取a、pgg-ptx和b、rgerppr-peg-dspe,摩爾比a:b＝98:2。將pgg-ptx

用0.5％的膽酸鈉溶液溶解，rgerppr-peg-dspe用二氯甲烷:丙酮＝3:1的混合溶液溶解。將b溶液加入a溶液中，邊滴加邊渦旋；冰浴中細(xì)胞超聲破碎儀超聲300w，超2s，間隔3s，超聲2min得到乳液；向乳液中加入1％的膽酸鈉溶液8ml，磁力攪拌10min。35℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑；4℃，21000g離心45min，棄上清，將沉淀用生理鹽水重懸得納米粒溶液；樣品通過連接有蛋白純化儀的g-50葡聚糖凝膠柱，在228nm的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下分離提純。得到物理作用包裹有靶向元件的膠束納米抗腫瘤遞藥系統(tǒng)；

步驟3：測(cè)定所述多肽的分子量及純度；

步驟4：測(cè)定所述靶向元件dspe-peg-rgerppr核磁圖譜；

步驟5：測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)的粒徑、形態(tài)；

步驟6：測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)的體外藥物釋放特征；

步驟7：測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)體外對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤u87mg腫瘤細(xì)胞的攝??；

步驟8：測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)體外對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤u87mg腫瘤細(xì)胞的活性評(píng)價(jià)；

步驟9：測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤活性效果。

通過熒光失蹤納米粒，考查腫瘤細(xì)胞分別對(duì)載有熒光染料細(xì)胞膜綠色熒光探針(dio)的靶向膠束納米藥物和無靶向膠束納米藥物的細(xì)胞攝取，結(jié)果證實(shí)本發(fā)明通過物理包裹作用可以實(shí)現(xiàn)靶向元件rgerppr-peg-dspe修飾的膠束納米遞藥系統(tǒng)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)具有以下特征：粒徑在100nm左右，呈球形；在磷酸鹽緩沖液中比較穩(wěn)定；藥物釋放特性也得到了提高；細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中腫瘤細(xì)胞對(duì)該遞藥系統(tǒng)的攝取明顯增多，該遞藥系統(tǒng)對(duì)腫瘤的靶向性較好；體外抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤活性評(píng)價(jià)中該遞藥系統(tǒng)顯著增強(qiáng)了膠束納米藥物對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的體外生長(zhǎng)抑制作用；通過靜脈注射給藥，通過腫瘤epr效應(yīng)和rgerppr介導(dǎo)作用將其靶向至腫瘤部位，此遞藥系統(tǒng)可用作腫瘤治療藥物的靶向遞送，且在治療腦膠質(zhì)瘤上獲得了良好的療效，延長(zhǎng)了balb/c腦膠質(zhì)瘤裸鼠的中位生存期。

附圖說明

圖1為本發(fā)明遞藥系統(tǒng)制備流程示意圖；

圖2為本發(fā)明多肽c-rgerppr高效液相hplc圖譜；

圖3為本發(fā)明多肽c-rgerppr的質(zhì)量ms圖譜；

圖4為本發(fā)明mal-peg-dspe和rge-peg-dspe核磁nmr圖譜；

圖5為本發(fā)明pgg-ptx和rge/pgg-ptx粒徑圖；

圖6為本發(fā)明pgg-ptx和rge/pgg-ptx透射電鏡圖(a)pgg-ptx，(b)rge/pgg-ptx；

圖7為本發(fā)明納米遞藥系統(tǒng)長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)圖；

圖8為本發(fā)明納米遞藥系統(tǒng)藥物釋放曲線圖；

圖9為本發(fā)明u87mg神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞定性定量攝取圖；

圖10為本發(fā)明u87mg細(xì)胞活性曲線圖；

圖11為本發(fā)明給藥后神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠生存曲線圖。

具體實(shí)施方式

通過下述實(shí)施例將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。

參閱圖1，為本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)制備流程示意圖。

高分子前藥pgg-ptx紫杉醇載藥量為35％。

實(shí)施例1

多肽c-rgerppr的表征

將購買得到的多肽純品用hplc、lc-ms方法進(jìn)行表征。

分析型hplc色譜方法如下，色譜柱：diamonsilc18(5μm，200×4.6mm)；流動(dòng)相a：0.1％tfa水，流動(dòng)相b：0.1％tfa乙腈；洗脫程序：0～2min：5％b，2～32min：5％～65％b，32～33min：65％～90％b，33～36min：90％b；，36～37min：90％～5％b，37～45min：5％b；流速：0.7ml/min；柱溫：40℃；波長(zhǎng)：uv214、280nm。圖2表明其純度大于98％；圖3顯示多肽分子量為970.4，質(zhì)量ms圖譜顯示其分子量與理論相符。

實(shí)施例2

dspe-peg-rgerppr的合成與表征

取c-rgerppr純品25mg溶于ph7.0-7.4的2mlpbs(ph7.0-7.4，1xpbs)溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物dspe-peg-mal(摩爾當(dāng)量為rgerppr的0.8倍)溶于0.5mldmf，加入多肽水溶液中，超聲除去氣泡，攪拌反應(yīng)約1小時(shí)，dspe-peg-mal反應(yīng)完全，透析(截留分子量3500da，透析介質(zhì)為水)去除過量的c-rgerppr和dmf，冷凍干燥，得到rgerppr-peg-dspe，h1-nmr。h1-nmr圖譜顯示，圖4.為rgerppr-peg-dspe和馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物(mal-peg-dspe)的核磁圖譜。rgerppr-peg-dspe核磁圖譜在6.7ppm即馬來酰亞胺特征峰消失，顯示rgerppr-peg-dspe合成成功。

實(shí)施例3

物理包裹作用rgerppr-peg-dspe修飾pgg-ptx的納米遞藥系統(tǒng)的制備和表征

分別稱取a、pgg-ptx和b、rgerppr-peg-dspe,摩爾比a:b＝98:2。將pgg-ptx用0.5％的膽酸鈉溶液溶解，rgerppr-peg-dspe用二氯甲烷:丙酮＝3:1的混合溶液溶解。將b溶液加入a溶液中，邊滴加邊渦旋。冰浴中細(xì)胞超聲破碎儀超聲300w，超2s，間隔3s，超聲2min得到乳液。向乳液中加入1％的膽酸鈉溶液8ml，磁力攪拌10min。35℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑；4℃，21000g離心45min，棄上清，將沉淀用生理鹽水重懸得納米粒溶液。樣品通過連接有蛋白純化儀的g-50葡聚糖凝膠柱，在228nm的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下分離提純。得到物理作用包裹有靶向元件的膠束納米抗腫瘤遞藥系統(tǒng)。

配制高分子載紫杉醇前藥(pgg-ptx)和修飾靶向的膠束納米遞藥系統(tǒng)(rge/pgg-ptx)1mg/ml，過0.22um濾膜，用馬爾文激光粒度儀測(cè)定其粒徑大小和粒徑分布，圖5中顯示納米顆粒粒徑分布情況，pgg-ptx和rge/pgg-ptx兩種納米粒的平均粒徑分別為25nm和109nm左右。

pgg-ptx和rge/pgg-ptx的形態(tài)通過透射電子顯微鏡(tem)來觀察，需用1％的磷鎢酸負(fù)染制備樣品，具體操作如下：(1)滴一滴樣品溶液于銅網(wǎng)上；(2)空氣中干燥約10分鐘，用濾紙吸去多余的液體；(3)再滴一滴1％的磷鎢酸于銅網(wǎng)上，室溫干燥8分鐘后用濾紙吸去多余的染液；(4)待樣品完全干燥后置于透射電鏡下觀察。圖6中a和b分別為pgg-ptx和rge/pgg-ptx兩種納米粒的透射電鏡圖片，兩種納米粒形態(tài)均比較規(guī)則，呈球形。

實(shí)施例4

pgg-ptx和rge/pgg-ptx兩種納米粒穩(wěn)定性驗(yàn)證

將pgg-ptx和rge/pgg-ptx用1xpbs液配制成1.0mg/ml,用動(dòng)態(tài)光散射儀(dls)測(cè)定粒徑大小和分散性指數(shù)(pdi)，每?jī)商鞙y(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定3周，考察納米粒子的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果如圖7，兩種納米粒的穩(wěn)定性良好，放置3周后粒徑無明顯變化(p>0.05)。

實(shí)施例5

pgg-ptx和rge/pgg-ptx兩種納米粒藥物釋放性能驗(yàn)證

pgg-ptx和rge/pgg-ptx的釋藥性能：用ph為7.4緩沖鹽溶液分別配制一定濃度的pgg-ptx和rge/pgg-ptx，每組三個(gè)重復(fù)，將所有樣品放置于37℃恒溫振蕩器中。分別在不同時(shí)間點(diǎn)取每種樣品緩沖鹽溶液各一組，用乙酸乙酯萃取溶液中釋放出來的紫杉醇，用高效液相色譜儀測(cè)定紫杉醇的含量(標(biāo)準(zhǔn)曲線法)。如圖8所示，rge/pgg-ptx的藥物釋放在一定程度上有所提高，改善了pgg-ptx紫杉醇釋放慢釋放量少的缺點(diǎn)。

實(shí)施例6

納米遞藥系統(tǒng)體外神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向性驗(yàn)證

以u(píng)87mg細(xì)胞為模型，每孔3×10⁴cells/ml密度接種于6孔板中培養(yǎng)24，每孔體積2ml，將培養(yǎng)板移入二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃，5％二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至80％。用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液配制一系列不同濃度的rge/pgg-ptx和pgg-ptx溶液。將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸出，加入rge/pgg-ptx和pgg-ptx的系列溶液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，37℃孵育2h。吸取上清液遺棄，用pbs溶液輕輕洗滌兩次，分別用激光共聚焦定性和流式細(xì)胞儀定量評(píng)價(jià)細(xì)胞攝取情況。細(xì)胞核用hochest染成藍(lán)色。流式細(xì)胞儀分析的細(xì)胞先用pbs洗滌2次；然后消化、離心、重懸，重復(fù)三次；重懸后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。參閱圖9，圖中a為游離熒光素dio細(xì)胞攝取圖、b為pgg-ptx包裹dio細(xì)胞攝取圖、c為rge/pgg-ptx包裹dio細(xì)胞攝取圖，于37℃分別與腫瘤細(xì)胞作用2小時(shí)后的熒光顯微照片，結(jié)果顯示rge/pgg-ptx攝取量明顯高于細(xì)胞對(duì)pgg-ptx的攝取，說明rge/pgg-ptx膠束納米遞藥系統(tǒng)制備成功，并對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的體外靶向性。

實(shí)施例7

測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)體外對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤u87mg腫瘤細(xì)胞的活性評(píng)價(jià)

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)以u(píng)87mg細(xì)胞為模型，采用cck-8試劑盒分析ic50值來考查pgg-ptx和rge/pgg-ptx和游離ptx對(duì)細(xì)胞的抑制率，具體方法：將密度為2×10³cells/ml的u87mg懸浮液接種于96孔板中，放置在5％co2條件下的37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)；向96孔板中加入不同濃度的taxol、pgg-ptx和rge/pgg-ptx三種藥物溶液，并設(shè)置空白對(duì)照，和陰性對(duì)照(不加藥)，每組至少設(shè)三個(gè)復(fù)孔；加藥后將96孔板放置在5％co2條件下的37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48小時(shí)；移去孔中的液體，每孔再次加入100μl新鮮培養(yǎng)基和10μlcck-8試劑；將96孔板放在37℃恒溫震蕩箱中輕微震蕩培養(yǎng)4小時(shí)；用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的od值。

細(xì)胞的存活率計(jì)算公式：

細(xì)胞活力(％)＝[a(加藥)-a(空白)]/[a(不加藥)-a(空白)]×100％。

公式中：

a(空白)：具有培養(yǎng)基和cck-8溶液而沒有u87mg細(xì)胞的孔的od值；

a(加藥)：具有u87mg細(xì)胞、cck-8溶液和藥物溶液的孔的od值；

a(不加藥)：具有u87mg細(xì)胞、cck-8溶液而沒有藥物溶液的孔的od值。

如圖10所示，taxol，pgg-ptx和rge/pgg-ptx處理u87mg細(xì)胞48h后，ic50值分別為0.14μm，2.39μm和1.44μm,。很顯然，rge/pgg-ptx的抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性比無靶向的pgg-ptx要高，而pgg-ptx的ic50值高于ptx說明高分子通過鍵合形式連接紫杉醇形成的納米藥物，細(xì)胞毒性明顯降低。

實(shí)施例8

測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)體外內(nèi)抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的活性評(píng)價(jià)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的u87mg細(xì)胞，消化后離心，在磷酸緩沖液pbs中分散為單細(xì)胞懸液，將1×106個(gè)細(xì)胞(分散于10ulpbs中)用立體定位儀接種5ul于裸鼠右側(cè)紋狀體中。接種位置坐標(biāo)定位如下：裸鼠前囟前0.6mm，右側(cè)1.8mm，深3mm。

將裸鼠隨機(jī)分為4組每組7只，分別在接種后第11，15，18和21天注射100ul生理鹽水、ptx、pgg-ptx、rge/pgg-ptx，累積紫杉醇注射劑量為40mg/kg，記錄模型裸鼠的生存時(shí)間。參閱圖11，圖中結(jié)果顯示，生理鹽水n.s、游離紫杉醇ptx、無靶向的pgg-ptx、有靶向元件的rge/pgg-ptx各組的中位生存期分別為22、29、36、47天。由此可知，rge/pgg-ptx組荷瘤裸鼠的生存時(shí)間遠(yuǎn)長(zhǎng)于pgg-ptx組，說明crngrgpdc的修飾可顯著增強(qiáng)阿霉素脂質(zhì)體的抗腫瘤作用。