本發(fā)明涉及茯苓(fu-ling(poriacocos))萃取物與土莫酸(tumulosicacid)(即，茯苓萃取物的一成分)或土莫酸的醫(yī)藥上可接受的鹽的應(yīng)用，尤其是關(guān)于使用茯苓萃取物、土莫酸、或土莫酸的醫(yī)藥上可接受的鹽以保護(hù)肌肉的應(yīng)用，包括抗肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)肌肉的再生與修復(fù)，以調(diào)節(jié)、治療及/或延緩肌肉萎縮，特別是因?yàn)槔匣⒓膊?、?或惡病質(zhì)所引起的肌肉萎縮。

背景技術(shù)：

肌肉組織是哺乳動(dòng)物體內(nèi)質(zhì)量最高的組織，其主要功能是產(chǎn)生力量以牽引身體各部位運(yùn)動(dòng)。肌肉可區(qū)分為骨骼肌、心肌及平滑肌三種。骨骼肌依其本身的代謝類型及特性可進(jìn)一步區(qū)分為慢肌和快肌，前者由慢肌纖維蛋白所組成，其收縮可持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間，但力量較??；后者則由快肌纖維蛋白所組成，收縮較快、力量較大，但也較容易感到疲勞。

在正常生理狀態(tài)下，肌蛋白的合成與降解呈動(dòng)態(tài)平衡。然而，當(dāng)發(fā)生肌蛋白降解速度大于肌蛋白合成速度的肌蛋白代謝失衡情形時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮(或稱肌肉流失)，且出現(xiàn)肌肉重量明顯減輕、肌纖維橫截面積減少、肌纖維類型相關(guān)蛋白(即，慢肌纖維蛋白與快肌纖維蛋白)選擇性減少等特征性的變化，造成肌力下降、運(yùn)動(dòng)障礙、易疲勞、代謝紊亂等癥狀，嚴(yán)重影響日常工作和生活機(jī)能。

一般而言，骨骼肌在受到損傷后可通過肌肉再生程序而修復(fù)受損部位，然而，當(dāng)該再生程序嚴(yán)重受阻則會(huì)發(fā)生肌肉萎縮的情形。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉再生程序相當(dāng)復(fù)雜，首先涉及星狀細(xì)胞(satellitecells)的活化，活化后的星狀細(xì)胞會(huì)分化形成單核的成肌細(xì)胞(myoblasts)，成肌細(xì)胞再進(jìn)一步增殖與分化以相互融合成多核的肌管(myotubes)，最后再由肌管成熟分化為新的肌纖維(myofibers)。于肌肉再生過程中，不同階段各自受到不同肌肉生成調(diào)節(jié)因子(myogenicregulatoryfactors，mrfs)所調(diào)控。例如，在成肌細(xì)胞分化形成肌管的過程中，myod及myogenin可調(diào)控肌球蛋白重鏈(myosinheavychain，myhc；一肌管特異性結(jié)構(gòu)蛋白)的生成，前述調(diào)控在肌肉再生過程中乃不可或缺的重要步驟，因此，myod、myogenin、及myhc可作為成肌細(xì)胞分化狀況的標(biāo)志性分子。

已知有些生理狀況或特殊疾病會(huì)引起肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肌蛋白代謝失衡或肌細(xì)胞死亡，最終造成肌肉萎縮。其中，前述生理狀況包括例如：神經(jīng)退化、長(zhǎng)期臥床、衰老、創(chuàng)傷和惡病質(zhì)(cachexia；例如癌癥惡病質(zhì))等；前述特殊疾病則包括例如：敗血病、艾滋病、腎臟衰竭、庫欣氏癥候群(cushing’ssyndrome，cs)、肌少癥(sarcopenia)、癌癥、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，copd)、郁血性心臟衰竭(congestiveheartfailure，chf)等。

老化是肌少癥的最主要成因，有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)指出，成人在60至70歲發(fā)生肌少癥的機(jī)率為13至24％，高于80歲的發(fā)生機(jī)率則為約50％。其中，美國每年因?yàn)榧∩侔Y所造成的醫(yī)療花費(fèi)高達(dá)約118至262億美元。惡病質(zhì)則與其他高發(fā)生率的疾病相關(guān)，舉例言之，約有50％的癌癥患者、20至40％的copd患者、及50至70％的chf患者會(huì)出現(xiàn)惡病質(zhì)的癥狀(例如營養(yǎng)不良)。

臨床上迄今尚無有效治療或延緩肌肉萎縮的方法。為開發(fā)更有效治療或延緩肌肉萎縮的方法，本發(fā)明人由傳統(tǒng)中藥材中選擇茯苓，探討其應(yīng)用于保護(hù)肌肉(抗肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)肌肉的再生與修復(fù))的可行性。

本發(fā)明人從研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茯苓及其所含的土莫酸(tumulosicacid)，皆可有效抗肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)肌肉的再生與修復(fù)，故可用于調(diào)節(jié)、治療及/或延緩肌肉萎縮，特別是因?yàn)槔匣?、疾病、?或惡病質(zhì)所引起的肌肉萎縮，從而可用于提供保護(hù)肌肉的醫(yī)藥組合物、藥物或食品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一目的，在于提供一種使用茯苓萃取物于制備一保護(hù)肌肉的藥物或食品的用途。較佳地，該茯苓萃取物為茯苓的極性溶劑萃取物，該極性溶劑選自水、c1-c4醇類、及前述的組合；更佳地，該茯苓萃取物含有土莫酸；尤其較佳地，該茯苓萃取物為茯苓肉部、茯苓皮部及/或茯苓發(fā)酵產(chǎn)物的萃取物。其中，該藥物用于抗肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)肌肉再生與修復(fù)、或治療及/或延緩以下的至少一種所引起的肌肉萎縮：老化、疾病、及惡病質(zhì)；該食品用于調(diào)節(jié)以下的至少一種所引起的肌肉萎縮：老化、疾病、及惡病質(zhì)，從而有助于肌肉正常收縮、維持肌肉正常生理、維持神經(jīng)肌肉正常功能(neuromuscularfunction)、維持能量正常代謝或增強(qiáng)能量，且該食品為保健食品、營養(yǎng)補(bǔ)充食品或特殊營養(yǎng)食品。

本發(fā)明的另一目的，在于提供一種使用一活性成分于制備一保護(hù)肌肉的藥物或食品的用途，其中該活性成分為土莫酸及/或其醫(yī)藥上可接受的鹽。較佳地，該活性成分以植物萃取物的形式使用；更佳地，以茯苓萃取物的形式(例如：茯苓肉部、茯苓皮部及/或茯苓發(fā)酵產(chǎn)物的萃取物)使用，尤其是以茯苓的極性溶劑萃取物的形式使用，該極性溶劑選自水、c1-c4醇類、及前述的組合。其中，該藥物用于抗肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)肌肉再生與修復(fù)、或治療及/或延緩以下的至少一種所引起的肌肉萎縮：老化、疾病、及惡病質(zhì)；該食品用于調(diào)節(jié)以下的至少一種所引起的肌肉萎縮：老化、疾病、及惡病質(zhì)，從而有助于肌肉正常收縮、維持肌肉正常生理、維持神經(jīng)肌肉正常功能、維持能量正常代謝或增強(qiáng)能量，且該食品為保健食品、營養(yǎng)補(bǔ)充食品或特殊營養(yǎng)食品。

本發(fā)明的又一目的，在于提供一種保護(hù)肌肉的方法，其包含對(duì)一有需要的個(gè)體施用一有效量的上述活性成分或茯苓萃取物。該方法用于抗肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)肌肉再生與修復(fù)、或調(diào)節(jié)、治療及/或延緩以下的至少一種所引起的肌肉萎縮：老化、疾病、及惡病質(zhì)，或用于幫助肌肉正常收縮、維持肌肉正常生理、維持神經(jīng)肌肉正常功能、維持能量正常代謝或增強(qiáng)能量。

本發(fā)明的再一目的，在于提供一種保護(hù)肌肉的組合物，該組合物為一藥物或食品，且包含一有效量的上述活性成分或茯苓萃取物。其中，該組合物用于抗肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)肌肉再生與修復(fù)、或調(diào)節(jié)、治療及/或延緩以下的至少一種所引起的肌肉萎縮：老化、疾病、及惡病質(zhì)，或用于幫助肌肉正常收縮、維持肌肉正常生理、維持神經(jīng)肌肉正常功能、維持能量正常代謝或增強(qiáng)能量。

附圖說明

圖1所示為tnf-α對(duì)c2c12細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響；

圖2所示為茯苓萃取物對(duì)經(jīng)tnf-α誘導(dǎo)損傷的c2c12細(xì)胞的存活率的影響；以及

圖3所示為茯苓萃取物對(duì)經(jīng)tnf-α誘導(dǎo)損傷的c2c12細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)及較佳實(shí)施例，將描述于以下內(nèi)容中，以供本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員據(jù)以明了本發(fā)明的特征；但，在不背離本發(fā)明精神下，本發(fā)明還可以多種不同形式的實(shí)施例來實(shí)踐，不應(yīng)將本發(fā)明保護(hù)范圍解釋為限于說明書所陳述的。

除非文中有另外說明，于本說明書中(尤其是在權(quán)利要求書中)所使用之“一”、“該”及類似用語應(yīng)理解為包含單數(shù)及復(fù)數(shù)形式；所謂“有效量”，是指投予至個(gè)體時(shí)，可有效至少部分改善懷疑個(gè)體的病情的化合物數(shù)量；單位“毫克/公斤體重”是指每公斤體重個(gè)體所須的投與量。

除非文中有另外說明，于本說明書中(尤其是在權(quán)利要求書中)所謂“個(gè)體”是指人類或非人的哺乳動(dòng)物；所謂“治療”包括預(yù)防特定疾病或癥狀、減輕特定的疾病或癥狀、及/或防止或消除該病癥；所謂“調(diào)節(jié)肌肉萎縮”是指幫助肌肉正常收縮、維持肌肉正常生理、維持神經(jīng)肌肉正常功能(neuromuscularfunction)、維持能量正常代謝、及/或增強(qiáng)能量；所謂“醫(yī)藥上可接受的鹽”是指投予至生物體后，可產(chǎn)生與母體化合物相同或類似的藥理活性、且為生理上可忍受(即，具有盡可能小的毒性作用)的鹽。

本說明書中所使用的數(shù)值范圍(例如5至100)應(yīng)理解為也包含在該范圍中的所有有理數(shù)以及在該范圍中的任何有理數(shù)所組成的范圍，因此，本說明書中所使用的數(shù)值范圍包含介于所列舉的最低值與最高值之間的數(shù)值的所有可能組合。另外，當(dāng)本文于數(shù)值前使用“約”時(shí)，實(shí)質(zhì)上代表與所述數(shù)值相差在20％以內(nèi)，較佳在10％以內(nèi)，且更佳在5％以內(nèi)。

茯苓藥材是指擬層孔菌科真菌(poriacocos(schw.)wolf)的干燥菌核。茯苓真菌常寄生在松樹根上，外皮呈淡棕色或黑褐色(茯苓皮部)，內(nèi)部則呈粉紅色或白色(茯苓肉部)。

本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，茯苓萃取物可有效地抗肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)肌肉再生與修復(fù)，故可用于保護(hù)肌肉，具有調(diào)節(jié)、治療及/或延緩肌肉萎縮的功效。如下附實(shí)施例所顯示，于不受理論限制下，堅(jiān)信本發(fā)明所使用的茯苓萃取物可針對(duì)因?yàn)槔匣?、疾病、?或惡病質(zhì)所引起的肌肉萎縮，提供調(diào)節(jié)、治療及/或延緩效果。因此，本發(fā)明提供一種使用茯苓萃取物于保護(hù)肌肉的應(yīng)用，包括使用茯苓萃取物于制備一保護(hù)肌肉的藥物或食品、對(duì)有需要的個(gè)體投予茯苓萃取物以保護(hù)肌肉的方法、以及提供一包含茯苓萃取物的食品或醫(yī)藥組合物。

根據(jù)本發(fā)明，所采用的茯苓萃取物可以是一通過使用一極性溶劑以萃取茯苓原料所提供的萃取液。其中，該茯苓原料可以是茯苓肉部、茯苓皮部及/或茯苓發(fā)酵產(chǎn)物；該極性溶劑可以是水及/或c1-c4醇類。較佳地，使用水、乙醇、或其組合作為該極性溶劑?？梢曅枰{(diào)整用于萃取的極性溶劑與茯苓的用量比率，一般而言，極性溶劑的用量并無特殊限制，只要可使原料均勻分散即可。于本發(fā)明一具體實(shí)施例中，使用乙醇作為極性溶劑，并以體積比約1：8的原料：乙醇，將原料分散于乙醇中，以進(jìn)行萃取。

于上述萃取操作中，進(jìn)行該萃取一段時(shí)間以達(dá)到所欲的萃取程度。以采用乙醇作為該極性溶劑為例，通常為至少1小時(shí)，較佳為至少2小時(shí)，更佳為至少3小時(shí)，且可視需要輔以例如煎煮、冷卻、過濾、減壓濃縮、樹脂管柱層析等其它操作。

視需要地，可以對(duì)前述通過使用一極性溶劑以萃取茯苓原料所提供的萃取液依序進(jìn)行堿化及酸化處理，以提升萃取液中的土莫酸含量。其中，所謂“堿化”是指使采用任何合宜的堿性物質(zhì)，以提高物料(于本發(fā)明是指前述通過使用一極性溶劑以萃取茯苓原料所提供的萃取液)的ph值。于本發(fā)明一具體實(shí)施例中，使用氫氧化鈉以進(jìn)行該堿化反應(yīng)。

一般而言，于堿化處理步驟中將物料的ph值提升到不小于約10；較佳是提升到不小于約11；最佳是提升到不小于約12。于本發(fā)明一具體實(shí)施例中，于堿化處理中添加使用1n的氫氧化鈉，以提升該萃取液的ph值到約12。在提升萃取液的ph值后，視需要于升溫下進(jìn)行堿化反應(yīng)。舉例言之，該堿化反應(yīng)于不小于50℃的溫度下進(jìn)行，較佳于不小于60℃的溫度下進(jìn)行。如下附實(shí)施例所示，可以于例如約70℃的溫度下進(jìn)行堿化反應(yīng)。

所謂“酸化”是指采用任何合宜的酸性物質(zhì)，以調(diào)降物料(于本發(fā)明是指前述經(jīng)堿化的萃取液)的ph值。于本發(fā)明一具體實(shí)施例中，使用鹽酸以調(diào)降經(jīng)堿化的萃取液的ph值。

一般而言，該酸化處理所達(dá)的ph值的調(diào)降程度并無特殊要求，只要有降低ph值即可。舉例言之，使萃取液的ph值調(diào)降至少約3.0，較佳調(diào)降至少約4.0。于本發(fā)明一具體實(shí)施例中，于酸化處理中將經(jīng)堿化的萃取液的ph值調(diào)降至約7。

根據(jù)本發(fā)明所采用的茯苓萃取物，也可以是一干燥物，此干燥物可通過干燥前述經(jīng)或未經(jīng)堿化及酸化處理所得的萃取液而提供。為盡可能達(dá)到最大的萃取效益，視需要地，可以相同或不同極性溶劑重復(fù)萃取茯苓原料，并合并該多次萃取所得的萃取液，再進(jìn)行干燥，或視需要的堿化及酸化處理。其中，各萃取操作可以相同或不同的極性溶劑進(jìn)行。

本發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，于茯苓萃取物所含有的成分中，土莫酸本身即可有效地促進(jìn)肌肉的再生與修復(fù)，故可用于保護(hù)肌肉，具有調(diào)節(jié)、治療及/或延緩肌肉萎縮的功效。如下附實(shí)施例所顯示，于不受理論限制下，堅(jiān)信土莫酸可針對(duì)因?yàn)槔匣?、疾病、?或惡病質(zhì)所引起的肌肉萎縮，提供調(diào)節(jié)、治療及/或延緩效果。因此，本發(fā)明也提供一種使用土莫酸及/或其醫(yī)藥上可接受的鹽于保護(hù)肌肉的應(yīng)用，包括使用土莫酸及/或其醫(yī)藥上可接受的鹽于制備一保護(hù)肌肉的藥物或食品、對(duì)有需要的個(gè)體投予土莫酸及/或其醫(yī)藥上可接受的鹽以保護(hù)肌肉的方法、以及提供一包含土莫酸及/或其醫(yī)藥上可接受的鹽的食品或醫(yī)藥組合物。

較佳地，該土莫酸及/或其醫(yī)藥上可接受的鹽以植物萃取物的形式使用；更佳地，以茯苓萃取物的形式使用，尤其是以茯苓的極性溶劑萃取物的形式使用，該極性溶劑選自水、c1-c4醇類、及前述的組合。

于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的醫(yī)藥組合物或藥物可呈任何合宜的型式，并無特殊限制，端視所欲的用途而呈對(duì)應(yīng)的合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該醫(yī)藥組合物或藥物可以口服或非經(jīng)口服(例如：皮下、靜脈內(nèi)、肌肉、腹腔、或鼻腔)的投藥方式施用至有需要的個(gè)體上，以治療及/或延緩因?yàn)槔匣?、疾病、?或惡病質(zhì)所引起的肌肉萎縮。其中，視使用形式及用途而定，可選用合宜的載劑以提供該醫(yī)藥組合物或藥物，其中，該載劑包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結(jié)合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。

以適于口服的劑型為例，于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的醫(yī)藥組合物或藥物可含有任何不會(huì)不利影響活性成分(即，茯苓萃取物或土莫酸)的所欲效益的醫(yī)藥上可接受的載劑，例如：水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、淀粉、糖膨潤土(sugarbentonite)、及前述的組合?？衫萌魏魏弦说姆椒?，以適于口服投藥的劑型提供該醫(yī)藥組合物或藥物，例如：錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。

至于適于皮下、靜脈內(nèi)、肌肉、或腹腔注射的針劑或點(diǎn)滴劑，則可于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的醫(yī)藥組合物或藥物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩沖液(如磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液)、增溶劑、乳化劑、5％糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、干粉注射劑、懸液注射劑、或干粉懸液注射劑等劑型提供該醫(yī)藥組合物或藥物?；蛘?，可將該醫(yī)藥組合物或藥物制備成一注射前固體，以可溶于其他溶液或懸浮液中的劑型、或可乳化的劑型提供該注射前固體，并于投予至有需要的個(gè)體之前，將該注射前固體溶于其他溶液或懸浮液中或?qū)⑵淙榛峁┧淖⑸鋭?/p>

視需要地，可于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的醫(yī)藥組合物或藥物中另外含有合宜用量的添加劑，例如可提高該醫(yī)藥組合物或藥物于服用時(shí)的口適感及視覺感受的調(diào)味劑、調(diào)色劑、著色劑等，以及可改善該醫(yī)藥組合物或藥物的穩(wěn)定性及儲(chǔ)存性的緩沖劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該醫(yī)藥組合物或藥物可視需要另外含一或多種其他活性成分(例如維生素d、維生素b1、維生素b2、煙堿素、生物素、泛酸、鈣、碘、鎂、鋅、蛋白質(zhì)等)，或者與含該一種或多種其他活性成分的藥物并用，以進(jìn)一步加強(qiáng)該醫(yī)藥組合物或藥物的功效或增加制劑配方的運(yùn)用靈活性與調(diào)配度，只要該其他活性成分對(duì)本發(fā)明活性成分(即，茯苓萃取物或土莫酸)的效益沒有不利的影響即可。

于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的醫(yī)藥組合物或藥物可以一日一次、一日多次、或數(shù)日一次等不同投藥頻率施用，端視投予個(gè)體的需求、年齡、體重、及健康況狀而異。舉例言之，當(dāng)以口服方式施用至一個(gè)體以保護(hù)肌肉時(shí)，以茯苓萃取物計(jì)，其用量為每天約0.003毫克/公斤體重至約30毫克/公斤體重，較佳為每天約0.05毫克/公斤體重至約20毫克/公斤體重，更佳為每天約1毫克/公斤體重至約15毫克/公斤體重?；蛘?，以土莫酸計(jì)，其用量為每天約0.5毫克/公斤體重至約20毫克/公斤體重，較佳為每天約1毫克/公斤體重至約15毫克/公斤體重，更佳為每天約5毫克/公斤體重至約10毫克/公斤體重。

于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的食品有助于肌肉正常收縮、維持肌肉正常生理、維持神經(jīng)肌肉正常功能(neuromuscularfunction)、維持能量正常代謝或增強(qiáng)能量，可用于調(diào)節(jié)因?yàn)槔匣?、疾病、?或惡病質(zhì)所引起的肌肉萎縮。

于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的食品可以是保健食品、營養(yǎng)補(bǔ)充食品或特殊營養(yǎng)食品，且可以制成例如乳制品、肉類加工品、面包類、面食品、餅干、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運(yùn)動(dòng)飲料、營養(yǎng)飲料等產(chǎn)品，但不以此為限。較佳地，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用的食品以保健食品的型式提供。

于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的保健食品、營養(yǎng)補(bǔ)充食品及特殊營養(yǎng)食品可以一日一次、一日多次、或數(shù)日一次等不同頻率食用，端視投予個(gè)體的年齡、體重、運(yùn)動(dòng)量、及健康狀況而采用的建議攝取量而異。也可針對(duì)特定族群調(diào)整本發(fā)明所提供的保健食品、營養(yǎng)補(bǔ)充食品及特殊營養(yǎng)食品中茯苓萃取物或土莫酸的含量，較佳為調(diào)整至每日應(yīng)服用的量。

可于本發(fā)明保健食品、營養(yǎng)補(bǔ)充食品及/或特殊營養(yǎng)食品的外包裝標(biāo)示建議使用量、特定族群(例如重度運(yùn)動(dòng)者、孕婦、癌癥患者、心臟衰竭患者)的使用標(biāo)準(zhǔn)及條件、或與其他食品或醫(yī)藥共同服用的建議事項(xiàng)，以利用戶在無醫(yī)師、藥師或相關(guān)執(zhí)事人員指導(dǎo)下可在家自行服用而無安全疑慮。

本發(fā)明也提供一種于一個(gè)體中保護(hù)肌肉的方法，其包含對(duì)該個(gè)體施用一有效量的活性成分，其中該活性成分為茯苓萃取物、土莫酸、及/或土莫酸的醫(yī)藥上可接受的鹽。于根據(jù)本發(fā)明的保護(hù)肌肉的方法中，有關(guān)該活性成分的實(shí)施例、投予途徑、投予形式、適用劑量、以及相關(guān)治療的應(yīng)用，均如上述的說明。

現(xiàn)以下列實(shí)施例進(jìn)一步例示說明本發(fā)明。其中這些實(shí)施例僅提供作為說明，而非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明保護(hù)范圍應(yīng)如權(quán)利要求書界定為準(zhǔn)。

實(shí)施例1：茯苓萃取物的制備與成分分析

(1-1)

取茯苓藥材(來源產(chǎn)地為云南)，清洗后剝?nèi)∑渫馄?下稱“茯苓皮部”)，其余即為肉部(下稱“茯苓肉部”)。

(1-2)

取(1-1)的茯苓肉部700公斤，于室溫以約1：8(茯苓肉部：75％乙醇)的體積比浸泡于75％乙醇中，歷時(shí)12小時(shí)，然后煮沸并進(jìn)行萃取(歷時(shí)3小時(shí))。重復(fù)前述萃取步驟，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并過濾以去除不溶物。接著，進(jìn)行減壓濃縮以去除乙醇，再以噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥，獲得一萃取物。

(1-3)

以液相層析/紫外光/質(zhì)譜儀(lc/uv/ms，liquidchromatographycoupledtodiodearrayuvdetectionandmassspectrometry)，分別于243納米及210納米波長(zhǎng)下檢測(cè)由(1-2)所獲得的萃取物的成分。結(jié)果顯示，由(1-2)所獲得的萃取物含有茯苓酸(pachymicacid)、去氫茯苓酸(dehydropachymicacid)、土莫酸(tumulosicacid)、去氫土莫酸(dehydrotumulosicacid)、豬苓酸c(polyporenicacidc)、及3-表-去氫土莫酸(3-epi-dehydrotumulosicacid)等成分。接著，以高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，hplc)定量該萃取物中各成分的含量，結(jié)果示于表1。

表1

(1-4)

取3250公克(1-2)所獲得的萃取物，以約1：10(萃取物：純水)的體積比均勻分散于純水中。接著，加入氫氧化鈉使該混合物的堿濃度為1n(即，提升該混合物的ph值到約12)，再倒入溫度維持于70℃的調(diào)制桶中且均勻攪拌直至反應(yīng)完全。然后，以12n的濃鹽酸進(jìn)行中和，使該混合物的ph值下降至7，再于室溫下以1000(rpm)進(jìn)行離心(以平板式離心機(jī))，歷時(shí)30分鐘，去除濾液，并以純水清洗剩余的不溶物。將該不溶物烘干并研磨成粉末后，以約1：40(不溶物：95％乙醇)的體積比，使用95％乙醇進(jìn)行萃取，重復(fù)該萃取步驟，共三次，合并三次萃取所得萃取液并進(jìn)行減壓濃縮以去除乙醇，獲得2000公克產(chǎn)物(此即，后續(xù)實(shí)驗(yàn)所使用的茯苓肉部萃取物)。

(1-5)

以液相層析/紫外光/質(zhì)譜儀，分別于243納米及210納米波長(zhǎng)下檢測(cè)由(1-4)所獲得的萃取物的成分。結(jié)果顯示，由(1-4)所獲得的萃取物含有土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸c、及3-表-去氫土莫酸等成分，但不含茯苓酸及去氫茯苓酸。接著，以高效液相色譜法定量該萃取物中各成分的含量，結(jié)果顯示，土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸c、及3-表-去氫土莫酸于(1-4)所得的萃取物中的總含量為6.2重量％。其中，以土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸c、及3-表-去氫土莫酸的總重量計(jì)，土莫酸約占53.74％、去氫土莫酸約占21.26％、豬苓酸c約占12.10％、3-表-去氫土莫酸約占12.90％。

(1-6)

取(1-1)的茯苓皮部，于室溫以約1：8(茯苓皮部：75％乙醇)的體積比浸泡于75％乙醇中，歷時(shí)12小時(shí)，然后煮沸并進(jìn)行萃取(歷時(shí)3小時(shí))。重復(fù)前述萃取步驟，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并過濾以去除不溶物。接著，進(jìn)行減壓濃縮以去除乙醇，再以噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥，獲得一茯苓皮部萃取物供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

(1-7)

以滅菌后的固態(tài)基質(zhì)接種茯苓菌株，置于20～35℃、相對(duì)濕度30～70％的環(huán)境避光發(fā)酵數(shù)周至數(shù)月，以獲得茯苓發(fā)酵產(chǎn)物。取前述的茯苓發(fā)酵產(chǎn)物100公克，將其烘干并研磨成粉末后，于室溫以約1：8(發(fā)酵產(chǎn)物粉末：75％乙醇)的體積比均勻分散于75％乙醇中，歷時(shí)12小時(shí)，然后煮沸并進(jìn)行萃取(歷時(shí)3小時(shí))。重復(fù)前述萃取步驟，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并過濾以去除不溶物。接著，進(jìn)行減壓濃縮以去除乙醇，再以噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥，獲得一茯苓發(fā)酵萃取物供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

實(shí)施例2：肌細(xì)胞損傷模型的建立

腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactoralpha，tnf-α)是一種促進(jìn)發(fā)炎反應(yīng)(pro-inflammatory)的細(xì)胞激素(cytokine)，分子量為17,000。人體臨床數(shù)據(jù)顯示，在一些特殊疾病(如癌癥、艾滋病、慢性阻塞性肺病等)患者、施用抗癌藥物者、及老年人的體內(nèi)，tnf-α的濃度會(huì)上升，伴隨肌肉異化作用(即，肌肉分解消耗)或肌細(xì)胞死亡增加的現(xiàn)象。研究顯示，將tnf-α注射至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)或投予藥物使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)tnf-α濃度增加會(huì)誘發(fā)肌細(xì)胞損傷(包括肌蛋白代謝失衡、肌細(xì)胞死亡等)，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉的萎縮。為了探討茯苓萃取物及其中的成分于保護(hù)肌肉的功效與作用機(jī)制，本發(fā)明人以tnf-α進(jìn)行誘導(dǎo)，建立肌細(xì)胞損傷模型。

首先，以h-dmem培養(yǎng)基(購自sigma公司)對(duì)c2c12細(xì)胞(即，小鼠的成肌細(xì)胞，購自atcc)進(jìn)行培養(yǎng)，待c2c12細(xì)胞生長(zhǎng)至80％匯合度(即，混合單層細(xì)胞占80％面積)后，將細(xì)胞分成四組，并將各組的培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基。接著，加入tnf-α(購自sigma公司)使其在各組培養(yǎng)基中的最終濃度達(dá)到0、2、5、或10納克/毫升(ng/ml)。在歷時(shí)4天的分化培養(yǎng)基與tnf-α的共處理之后，測(cè)定c2c12細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(reactiveoxidativestress，ros)作為模型評(píng)價(jià)指針，建立肌細(xì)胞損傷模型。最后，以未經(jīng)tnf-α處理的組別(即，tnf-α的使用濃度為0納克/毫升)的結(jié)果為基準(zhǔn)，計(jì)算其他各組的相對(duì)的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，結(jié)果示于圖1(數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±sem，n＝6，由t檢驗(yàn)分析得到，***p<0.001)。

由圖1可知，當(dāng)使用5納克/毫升的tnf-α，c2c12細(xì)胞內(nèi)活性氧水平有升高的現(xiàn)象；當(dāng)使用10納克/毫升的tnf-α，c2c12細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的升高更為明顯。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以10納克/毫升作為tnf-α誘導(dǎo)肌細(xì)胞損傷的濃度。

實(shí)施例3：茯苓萃取物于抗肌細(xì)胞損傷的效果

取實(shí)施例1(1-4)所提供的茯苓萃取物，以二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，dmso；購自sigma公司)配制成茯苓肉部萃取物溶液。待c2c12細(xì)胞在h-dmem培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)至80％匯合度后，將其分成五組，并進(jìn)行以下處理：

(1)控制組：以h-dmem培養(yǎng)基(不含茯苓萃取物)進(jìn)行培養(yǎng)，歷時(shí)6小時(shí)。接著，將培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基，以進(jìn)行培養(yǎng)，歷時(shí)4天。

(2)tnf-α組：以h-dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，歷時(shí)6小時(shí)。接著，將培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基，并加入tnf-α使其于培養(yǎng)基中的最終濃度為10納克/毫升，以與分化培養(yǎng)基進(jìn)行共處理，歷時(shí)4天。

(3)tnf-α+茯苓萃取物組(共三組)：于h-dmem培養(yǎng)基中加入上述的茯苓肉部萃取物溶液，使其于培養(yǎng)基中的最終濃度為1、5、或10微克/毫升，以進(jìn)行預(yù)處理，歷時(shí)6小時(shí)。接著，將培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基，并加入tnf-α使其于培養(yǎng)基中的最終濃度為10納克/毫升，以與分化培養(yǎng)基進(jìn)行共處理，歷時(shí)4天。

其后，測(cè)定各組c2c12細(xì)胞的存活率(以mttassay進(jìn)行測(cè)試)、以及細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，并以控制組的結(jié)果為基準(zhǔn)，計(jì)算其他各組的相對(duì)的存活率以及細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，以測(cè)定茯苓萃取物抗tnf-α誘導(dǎo)的肌細(xì)胞損傷的有效濃度，結(jié)果示于圖2及圖3(數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±sem，n＝6，由t檢驗(yàn)分析得到，#p<0.05，###p<0.001，*p<0.05，***p<0.001)。

由圖2及圖3可知，在經(jīng)tnf-α誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的組別中，若以1至5微克/毫升的茯苓萃取物進(jìn)行預(yù)處理，c2c12細(xì)胞的存活率隨著茯苓萃取物濃度的升高而呈逐漸上升的趨勢(shì)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平則隨茯苓萃取物濃度的升高而呈逐漸下降的趨勢(shì)。其中，以5微克/毫升的茯苓萃取物進(jìn)行預(yù)處理，活性氧水平下降至與控制組(未經(jīng)tnf-α誘導(dǎo)損傷)相當(dāng)。前述結(jié)果顯示，茯苓萃取物可有效降低tnf-α對(duì)肌細(xì)胞所造成的損傷，具有抗肌細(xì)胞損傷的效果。

實(shí)施例4：茯苓萃取物及土莫酸于促進(jìn)肌肉再生與修復(fù)的效果

如上述說明，myogenin、及myhc可作為成肌細(xì)胞分化狀況的標(biāo)志性分子。為探討茯苓萃取物與土莫酸是否具有促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的效果，將土莫酸(購自杏輝藥品工業(yè)股份有限公司)、實(shí)施例1(1-4)所提供的茯苓肉部萃取物、實(shí)施例1(1-6)所提供的茯苓皮部萃取物、及實(shí)施例1(1-7)所提供的茯苓發(fā)酵萃取物，分別以二甲基亞砜(dmso；購自sigma公司)配制成土莫酸溶液、茯苓肉部萃取物溶液、茯苓皮部萃取物溶液、茯苓發(fā)酵萃取物溶液。

待c2c12細(xì)胞在h-dmem培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)至80％匯合度后，將其分成十四組，并進(jìn)行以下處理：

(1)控制組：將培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基，以進(jìn)行培養(yǎng)，歷時(shí)4天。

(2)肉部萃取物組(共三組)：將培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基，并加入上述的茯苓肉部萃取物溶液，使其于培養(yǎng)基中的最終濃度為0.1、1、或10微克/毫升，以進(jìn)行處理，歷時(shí)4天。

(3)皮部萃取物組(共四組)：將培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基，并加入上述的茯苓皮部萃取物溶液，使其于培養(yǎng)基中的最終濃度為0.01、0.1、0.5、或1微克/毫升，以進(jìn)行處理，歷時(shí)4天。

(4)發(fā)酵萃取物組(共三組)：將培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基，并加入上述的茯苓發(fā)酵萃取物溶液，使其于培養(yǎng)基中的最終濃度為0.2、2、或20微克/毫升，以進(jìn)行處理，歷時(shí)4天。

(5)土莫酸組(共四組)：將培養(yǎng)基更換為2％馬血清的分化培養(yǎng)基，并加入土莫酸溶液，使其于培養(yǎng)基中的最終濃度為0.01、0.1、1、或10微克/毫升，以進(jìn)行處理，歷時(shí)4天。

其后，萃取各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，并以西方墨點(diǎn)法偵測(cè)myogenin、myhc等成肌細(xì)胞分化指標(biāo)蛋白的表現(xiàn)。最后，以控制組的結(jié)果為基準(zhǔn)(即，以控制組的表現(xiàn)量為100％)，計(jì)算其他各組細(xì)胞的myogenin及myhc蛋白的相對(duì)表現(xiàn)量，結(jié)果示于表2。

表2

由表2可知，針對(duì)myogenin蛋白的表現(xiàn)量，低劑量(0.1微克/毫升)的茯苓肉部萃取物可提升約30％的表現(xiàn)量，高劑量(10微克/毫升)的茯苓肉部萃取物則可提升高達(dá)170％的表現(xiàn)量；另一方面，低劑量(0.01微克/毫升)的茯苓皮部萃取物可提升約50％的表現(xiàn)量，0.1至0.5微克/毫升的茯苓皮部萃取物可提升約70-80％的表現(xiàn)量，1微克/毫升的茯苓皮部萃取物也具有提升myogenin蛋白表現(xiàn)量的效果；又一方面，低劑量(0.2微克/毫升)的茯苓發(fā)酵萃取物可提升約70％的表現(xiàn)量，而2微克/毫升的茯苓發(fā)酵萃取物可提升高達(dá)120％的表現(xiàn)量，20微克/毫升的茯苓發(fā)酵萃取物也具有提升myogenin蛋白表現(xiàn)量的效果；再一方面，低劑量(0.01至0.1微克/毫升)的土莫酸可提升約30％的表現(xiàn)量，且myogenin蛋白表現(xiàn)量隨著土莫酸濃度提升而呈現(xiàn)正向增加的趨勢(shì)，其中10微克/毫升的土莫酸時(shí)提升約390％的表現(xiàn)量。

由表2也可知，針對(duì)myhc蛋白的表現(xiàn)量，10微克/毫升的茯苓肉部萃取物可提升約30％的表現(xiàn)量；另一方面，低劑量(0.01微克/毫升)的茯苓皮部萃取物即可提升10％的表現(xiàn)量，且myhc蛋白表現(xiàn)量隨著茯苓皮部萃取物的濃度提升而呈現(xiàn)正向增加的趨勢(shì)，其中1微克/毫升的茯苓皮部萃取物可提升約120％的表現(xiàn)量；又一方面，低劑量(0.2微克/毫升)的茯苓發(fā)酵萃取物可提升約60％的表現(xiàn)量，而20微克/毫升的茯苓發(fā)酵萃取物可提升高達(dá)90％的表現(xiàn)量；再一方面，10微克/毫升的土莫酸可提升約80％的表現(xiàn)量。

上述結(jié)果顯示，茯苓萃取物(包含茯苓肉部萃取物、茯苓皮部萃取物、茯苓發(fā)酵萃取物等)及土莫酸皆可有效提升c2c12細(xì)胞中的myogenin、myhc等成肌細(xì)胞分化指標(biāo)蛋白的表現(xiàn)，具有促進(jìn)肌細(xì)胞分化的效果，有助于受損的肌肉組織的再生與修復(fù)。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，茯苓萃取物可有效保護(hù)損傷的肌細(xì)胞，使肌細(xì)胞的存活率上升，同時(shí)可抑制活性氧水平的上升。因此，茯苓萃取物對(duì)于損傷的肌細(xì)胞具有改善氧化壓力(oxidativestress)的功效。此外，茯苓萃取物及其所含的土莫酸能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。此說明，茯苓萃取物及其所含成分可有效抗肌細(xì)胞損傷、以及促進(jìn)肌肉再生與修復(fù)，故可用于保護(hù)肌肉，并且有助于肌肉正常收縮、維持肌肉正常生理、維持神經(jīng)肌肉正常功能(neuromuscularfunction)、維持能量正常代謝或增強(qiáng)能量。