本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

角膜內(nèi)皮是附著于后彈力層(descemet'smembrane)、位于角膜最內(nèi)側(cè)的單層細(xì)胞，直接與房水接觸，通過其主動(dòng)液泵功能維持角膜透明、保持角膜正常厚度。成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞無法再生，受損后主要由損傷區(qū)周邊細(xì)胞的擴(kuò)展移行進(jìn)行修復(fù)。各種原因如fuch角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良、外傷和手術(shù)等均會(huì)引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷，當(dāng)細(xì)胞密度低于500-1500個(gè)/mm²時(shí)即發(fā)生角膜內(nèi)皮功能失代償，導(dǎo)致角膜水腫渾濁，呈現(xiàn)大皰型角膜病變。針對(duì)這類疾病，可以通過單純移植內(nèi)皮的方法進(jìn)行治療，目前臨床上常用的方法包括帶后彈力層的角膜內(nèi)皮移植以及帶板層角膜的內(nèi)皮細(xì)胞移植，但角膜供體或角膜內(nèi)皮細(xì)胞的來源匱乏嚴(yán)重制約了臨床此類手術(shù)的開展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

意外地，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)通過將適宜大小的人多能干細(xì)胞結(jié)合豬角膜后彈力層，體外構(gòu)建組織工程化角膜內(nèi)皮，即本發(fā)明的第一目的在于提供一種組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)制備豬角膜后彈力層：將豬角膜去除豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞，使豬后彈力層與角膜基質(zhì)完整分離，將完整分離的豬角膜后彈力層干燥、滅菌備用；

2)培養(yǎng)、誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞：將常規(guī)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)至適宜大小，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，至人多能干細(xì)胞克隆內(nèi)細(xì)胞體積變大、細(xì)胞形態(tài)由圓形或卵圓形變?yōu)槎噙呅?，排列緊密，克隆周邊細(xì)胞呈梭形纖維狀，終止誘導(dǎo)；將終止誘導(dǎo)的人多能干細(xì)胞克隆消化后使用分化培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)備用；

3)構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮：將步驟1)獲得的豬角膜后彈力層，加入包被液進(jìn)行包被，再將步驟2)獲得的誘導(dǎo)分化后的人多能干細(xì)胞接種于步驟1)獲得的豬角膜后彈力層，貼壁培養(yǎng)后，更換新鮮分化培養(yǎng)基培養(yǎng)后，獲得組織工程角膜內(nèi)皮。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法中，所述步驟1)使用的豬角膜為滿足構(gòu)建植片直徑要求的完整全角膜或保有后彈力層的豬角膜。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法中，所述步驟1)中所述干燥滅菌處理為采用射線輻照或加入抗生素藥物滅菌處理。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法中，所述步驟2)中所述適宜大小的人多能干細(xì)胞的大小為60-100個(gè)細(xì)胞/克隆。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加以下物質(zhì)制成：β-巰基乙醇、谷氨酰胺、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bfgf)、非必須氨基酸(neaa)、血清替代物(knockoutserumreplacement，ksr)、全反式維甲酸(ra)；優(yōu)選地，所述β-巰基乙醇濃度為0.1mm、谷氨酰胺濃度為0.1mm、bfgf濃度為4-8ng/ml、neaa為0.1mm、ksr濃度為總液體量的20％(體積分?jǐn)?shù))、ra濃度為0.5-2μm。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法中，所述分化培養(yǎng)基為含rock抑制劑的5％dksfm培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法中，所述步驟3)中所述包被液為層黏連蛋白液或復(fù)合包被液(fnccoatingmix)。

更優(yōu)選地，本發(fā)明所述的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法中，包括以下步驟：

1)制備豬角膜后彈力層：新鮮或甘油保存的豬角膜，使用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡、沖洗20分鐘后，內(nèi)皮面朝上置于體式顯微鏡下，使用棉簽小心擦拭去除豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞，使用有齒鑷固定豬角膜，先撕去殘余的虹膜根部并暴露后彈力層游離部分，然后使用平頭鑷小心夾取豬后彈力層游離處，向角膜中央輕輕撕扯使豬后彈力層與角膜基質(zhì)完整分離。操作需注意力度，一旦后彈力層破裂卷曲即無法使用。

將完整分離的豬角膜后彈力層平整套在內(nèi)徑≤11.0mm的滅菌橡膠圓環(huán)上，內(nèi)皮面向上貼附于培養(yǎng)板使之干燥、滅菌，使用前加入抗生素浸泡置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱備用；

2)誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)至適宜大小即開始使用含有ra的誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)誘導(dǎo)3-5天，鏡下可見人多能干細(xì)胞克隆擴(kuò)大并相接，克隆內(nèi)細(xì)胞體積變大、細(xì)胞形態(tài)由圓形或卵圓形變?yōu)槎噙呅?，排列緊密，克隆周邊細(xì)胞呈梭形纖維狀。將終止誘導(dǎo)的人多能干細(xì)胞克隆消化后使用含rock抑制劑的5％dksfm分化培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)備用；

所述適宜大小的人多能干細(xì)胞克隆是指：倒置相差顯微鏡下約60-100個(gè)細(xì)胞/克隆，克隆大小均勻，密度適中；

所述含有ra的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在knockoutdmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加以下物質(zhì)制成：β-巰基乙醇、谷氨酰胺、bfgf、neaa、ksr、ra。添加后，β-巰基乙醇濃度為0.1mm、谷氨酰胺濃度為0.1mm、bfgf濃度為4-8ng/ml、neaa為0.1mm、ksr濃度為總液體量的20％(體積分?jǐn)?shù))、ra濃度為0.5-2μm；

所述含rock抑制劑的5％dksfm分化培養(yǎng)基是在dksfm基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加fbs和rock抑制劑制成的。其濃度分別為總液體量的5％(體積分?jǐn)?shù))、5-20μm；

3)構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮：制備好的豬角膜后彈力層，吸去抗生素液體，向豬后彈力層內(nèi)皮面加入1-10μg/ml層黏連蛋白(laminin,ln，購(gòu)于biolamina公司，貨號(hào)ln511,ln521)或fnccoatingmix(購(gòu)于athenaes公司，貨號(hào)0470)進(jìn)行包被以促進(jìn)細(xì)胞黏附，包被足夠時(shí)間后去掉包被液體，風(fēng)干備用。將消化好的誘導(dǎo)細(xì)胞按150-2000個(gè)細(xì)胞/mm²密度接種豬角膜后彈力層，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱貼壁過夜后，更換新鮮分化培養(yǎng)基培養(yǎng)一周左右，每日換液；

所述1-10μg/ml層黏連蛋白是指使用1×dpbs稀釋后的濃度，每次使用前新鮮配制，包被時(shí)間為于37℃1小時(shí)或4℃過夜；所述fnccoatingmix為商品即用型，包被時(shí)間為接種細(xì)胞前，室溫包被1分鐘左右。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法獲得的組織工程角膜內(nèi)皮。

本發(fā)明的又一目的在于提供上述構(gòu)建方法獲得的組織工程角膜內(nèi)皮在角膜(內(nèi)皮)移植中的用途。

如本發(fā)明后續(xù)實(shí)施例所示，本發(fā)明的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法及其組織工程角膜內(nèi)皮，至少有以下優(yōu)點(diǎn)：相較于羊膜或其他載體，本發(fā)明所使用后彈力層本身即為角膜正常結(jié)構(gòu)，不會(huì)過于柔軟、透明性好。所使用的種子細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來，不受原代細(xì)胞增殖能力低的限制。并且，本發(fā)明組織工程角膜內(nèi)皮制備過程簡(jiǎn)單，來源廣發(fā)，易于操作。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中所構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮茜素紅染色圖；

圖2為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中所構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞重要標(biāo)志na⁺-k⁺-atpase、zo-1圖。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說明，應(yīng)理解以下僅為本發(fā)明的示例性說明，并不用于限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

1.制備豬角膜后彈力層：取新鮮完整豬角膜，使用含青鏈雙抗(青鏈雙抗(100×，購(gòu)于美國(guó)corning公司))的無菌生理鹽水浸泡、沖洗20分鐘后，內(nèi)皮面朝上置于體式顯微鏡下，使用棉簽小心擦拭去除豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞，使用有齒鑷固定豬角膜，先撕去殘余的虹膜根部并暴露后彈力層游離部分，然后使用平頭鑷小心夾取豬后彈力層游離處，向角膜中央輕輕撕扯使豬后彈力層與角膜基質(zhì)完整分離。注意操作力度，避免后彈力層撕裂。

將完整分離的豬角膜后彈力層平整套在內(nèi)徑為9.0mm的滅菌橡膠圓環(huán)上，內(nèi)皮面向上貼附于35mm培養(yǎng)板中央，超凈臺(tái)中干燥，紫外線照射過夜滅菌，使用前加入抗生素浸泡置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱備用。

2.誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞：傳代后常規(guī)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞(h1人胚胎干細(xì)胞株，自atcc獲得)培養(yǎng)至適宜大小即開始誘導(dǎo)，使用含有ra(購(gòu)于sigma公司，貨號(hào)r2625)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)誘導(dǎo)5天，鏡下可見人多能干細(xì)胞克隆擴(kuò)大、相鄰克隆發(fā)生融合，克隆內(nèi)細(xì)胞體積變大、細(xì)胞形態(tài)由圓形或卵圓形變?yōu)槎噙呅?，排列緊密，克隆周邊細(xì)胞呈梭形纖維狀。終止誘導(dǎo)，除去誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入2ml無ca²⁺、mg²⁺的pbs緩沖液洗滌2遍，加入0.25％胰酶-0.02％edta溶液1.5ml(trypsin-edtasolution，10x，購(gòu)于sigma公司，貨號(hào)t4174)，去除纖維狀細(xì)胞及胰酶后，剩余細(xì)胞克隆放置培養(yǎng)箱繼續(xù)消化，待大多細(xì)胞脫落時(shí)使用含rock抑制劑的5％dksfm分化培養(yǎng)基(購(gòu)于invitrogen公司，貨號(hào)10744019)終止、重懸，吹打至單細(xì)胞后計(jì)數(shù)備用。

所述適宜大小的人多能干細(xì)胞克隆是指；倒置相差顯微鏡下約60-100個(gè)細(xì)胞/克隆，克隆大小均勻，密度適中。

所述含有ra的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在knockoutdmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加以下物質(zhì)制成：β-巰基乙醇、谷氨酰胺、bfgf、neaa、ksr、ra。添加后，β-巰基乙醇濃度為0.1mm、谷氨酰胺濃度為0.1mm、bfgf濃度為4ng/ml、neaa為0.1mm、ksr濃度為總液體量的20％(體積分?jǐn)?shù))、ra濃度為1μm。

所述含rock抑制劑的5％dksfm分化培養(yǎng)基是在dksfm基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加fbs和rock抑制劑制成的。其濃度分別為總液體量的5％(體積分?jǐn)?shù))、10μm。

3.構(gòu)建組織工程化角膜內(nèi)皮：取出制備好的豬角膜后彈力層，吸去抗生素液體，向豬角膜后彈力層內(nèi)皮面加入fnccoatingmix進(jìn)行包被以促進(jìn)細(xì)胞黏附，室溫包被約1分鐘后去掉包被液體，置于生物安全柜中風(fēng)干備用。

將消化好的誘導(dǎo)細(xì)胞按150-2000個(gè)細(xì)胞/mm²密度接種豬角膜后彈力層，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱貼壁過夜，第二天更換新鮮分化培養(yǎng)基培養(yǎng)一周左右，鏡下可見后彈力層上人多能干細(xì)胞來源的角膜內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密、形態(tài)規(guī)則、細(xì)胞邊界清晰。

所述fnccoatingmix為商品即用型，包被時(shí)間為接種細(xì)胞前，室溫包被1分鐘左右。

如圖1所示，使用實(shí)施例1中方法獲得組織工程角膜內(nèi)皮，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)后彈力層。將構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮片使用茜素紅染液染色5分鐘，浸于生理鹽水中小心漂洗，置于潔凈玻片光鏡下觀察。其中，a：鏡下可見所構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密、細(xì)胞邊界清晰；b；所構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮茜素紅染色，可見細(xì)胞邊界著色清晰，形態(tài)規(guī)則，活性良好，胞核無著染。結(jié)果說明：本發(fā)明方法所獲得的角膜內(nèi)皮具有良好形態(tài)和細(xì)胞活性。

如圖2所示，使用實(shí)施例1中方法獲得組織工程角膜內(nèi)皮，鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿后，使用4％多聚甲醛固定角膜內(nèi)皮片，pbs緩沖液洗滌，加入na⁺-k⁺-atpase、zo-1相應(yīng)一抗、二抗孵育后，熒光顯微鏡下觀察。其中，a：組織工程角膜內(nèi)皮表達(dá)角膜內(nèi)皮細(xì)胞液泵功能標(biāo)志na⁺-k⁺-atpase；b：組織工程角膜內(nèi)皮表達(dá)角膜內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)志緊密蛋白zo-1。結(jié)果說明：本發(fā)明方法所獲得的組織工程角膜內(nèi)皮表達(dá)角膜內(nèi)皮重要的結(jié)構(gòu)和功能標(biāo)志，是行使角膜內(nèi)皮相應(yīng)功能的基礎(chǔ)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。