本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種治療急性白血病的發(fā)酵組合物及其制備方法。
技術(shù)背景
急性白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，發(fā)病時(shí)骨髓中異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞大量增殖并抑制正常造血，廣泛浸潤(rùn)肝、脾、淋巴結(jié)等臟器。表現(xiàn)為貧血、出血、感染和浸潤(rùn)等征象。急性白血病若不經(jīng)特殊治療，平均生存期僅3個(gè)月左右，短者甚至在診斷數(shù)天后即死亡。
急性白血病就診前病程多數(shù)為1～2個(gè)月，其起病約半數(shù)發(fā)病急驟而半數(shù)緩慢。其中，兒童及青年患者起病多急驟，有高熱、進(jìn)行性貧血、顯著出血傾向及全身骨、關(guān)節(jié)疼痛。老年及部分青年也可緩慢起病，逐步進(jìn)展，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的乏力、虛弱、蒼白、體重減輕、勞動(dòng)后氣短、食欲不振或體內(nèi)某處腫脹或疼痛等癥狀開始。少數(shù)病例以齒齦腫脹、失明、抽搐等為首發(fā)癥狀。
植物酵素是將數(shù)十種不同的蔬果、谷類、海藻類及菇類等植物經(jīng)自然發(fā)酵研制而成，保留了植物中的營(yíng)養(yǎng)精華，含有人體需要的各種酵素、寡糖及多種維他命和礦物質(zhì)，又可產(chǎn)生豐富的sod抗氧化酶成分，sod是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),可以抑制癌細(xì)胞再形成或擴(kuò)散，sod具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血脂、抗輻射、提高體內(nèi)抗氧化能力，進(jìn)而增強(qiáng)免疫力。而將藥食兩用的中草藥與植物酵素結(jié)合，作為預(yù)防和治療急性白血病的的藥物，將成為一種革新的急性白血病預(yù)防、治療手段，但是這類產(chǎn)品目前市面并不常見，即使存在效果也不理想。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種治療急性白血病發(fā)酵組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由這種治療急性白血病發(fā)酵組合物的制備方法。
本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，為直投式植物酵素發(fā)酵菌劑，該發(fā)酵組合物主要包括如下重量份數(shù)的組分：中藥提取物0.1～30份、復(fù)合益生菌種0.5～10份，
其中，所述中藥提取物由下列重量份的原料提取而成：
小薊15～35份、槐角10～25份、大青葉12～25份、大棗20～35份、紫草10～25份、蒲公英20～30份、連翹15～25份、玄參20～30份、赤芍15～20份、水牛角10～20份、半枝蓮20～35份、杏子35～50份、生地15～25份、葡萄30～45份，蘋果25～40份，
其中，復(fù)合益生菌種為釀酒酵母、雙叉桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸性乳桿菌和醋酸桿菌。
本發(fā)明所提供的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，原料天然、無(wú)毒，且配方科學(xué)合理，很好地復(fù)合了果蔬、中草藥食材等多種植物的綜合調(diào)理性，對(duì)急性白血病具有很好的治療效果，同時(shí)對(duì)白血病患者的身體進(jìn)行綜合性調(diào)理。
本發(fā)明所提供的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，原料還包括如下重量份的中藥材：
冬蟲夏草5～15份、白花蛇舌草5～10份。
為了獲得最佳療效，本發(fā)明在上述原料的基礎(chǔ)上加入還可加入冬蟲夏草和白花蛇舌草，這兩味藥清熱解毒，扶正益氣，可以提高免疫力。但因?yàn)樗幉膬r(jià)格昂貴，可選擇性取舍。
優(yōu)選地，本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，主要由下列重量份的原料經(jīng)加工制備而成：
小薊25份、槐角15份、大青葉25份、大棗30份、紫草15份、蒲公英25份、連翹20份、玄參20份、赤芍20份、水牛角15份、半枝蓮30份、杏子40份、生地20份、葡萄40份，蘋果35份、冬蟲夏草10份、白花蛇舌草5份。
作為另一種優(yōu)選，本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，主要由下列重量份的原料經(jīng)加工制備而成：
小薊15份、槐角20份、大青葉15份、大棗35份、紫草20份、蒲公英20份、連翹20份、玄參25份、赤芍18份、水牛角20份、半枝蓮25份、杏子45份、生地25份、葡萄35份，蘋果30份、冬蟲夏草15份、白花蛇舌草10份。
優(yōu)選地，本發(fā)明發(fā)酵組合物還包括重量份數(shù)為10～30份的麥芽糊精。
進(jìn)一步，復(fù)合益生菌為益生菌粉劑，由如下重量份數(shù)的粉劑均勻混合而成：釀酒酵母35～50份、雙叉桿菌35～45份、植物乳桿菌45～50份、鼠李糖乳桿菌35～50份、嗜酸性乳桿菌40～55份和醋酸桿菌30～50份，所述益生菌粉劑的活菌含量為1×108～5×108cfu/g。
本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物的制備方法，包括如下步驟：
(1)中藥提取物的制備：
稱取處方量玄參和紫草，加入90％～95％的乙醇進(jìn)行回流提取，得到提取液和殘?jiān)?，將提取液回收乙醇，在50～60℃下干燥，制得乙醇提取物；
稱取處方量的小薊、槐角、大青葉、大棗、蒲公英、連翹、赤芍、水牛角、半枝蓮、杏子、生地、葡萄，蘋果、冬蟲夏草、白花蛇舌草，合并步驟a)的殘?jiān)?后置于提取罐中，加水至原料重量的2～10倍量以上，使原料全部浸沒(méi)在水中，加熱水溫至60℃，浸泡6-10小時(shí)，再加熱至100℃以上，煎煮30-50分鐘后，將提取液過(guò)濾出來(lái)，再加原料2～8倍量水煎煮一次，過(guò)濾提取液，兩次提取液合并，減壓濃縮、冷凍干燥，低溫粉碎成0.05-0.2mm的中藥細(xì)粉；
(2)發(fā)酵組合物的制備：
將預(yù)定重量份數(shù)的益生菌粉劑、抗性糊精和步驟(1)中的中藥細(xì)粉均勻混合10～15min，將混合粉加入干法造粒機(jī)造粒，制得顆粒狀的發(fā)酵組合物。
更進(jìn)一步，植物酵素的制備方法，該方法包括以下步驟：
a)發(fā)酵組合物的制備
b)發(fā)酵組合物加入純化水中，加5-8％紅糖、2％蛋白胨調(diào)合，105℃高溫滅菌40分鐘，過(guò)濾，濾液即為營(yíng)養(yǎng)液；
c)冷卻、接種，將步驟b)的營(yíng)養(yǎng)液在發(fā)酵罐內(nèi)，冷卻至30-32℃接復(fù)合益生菌種，混合發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)邊攪拌邊發(fā)酵,發(fā)酵溫度為30℃-35℃，發(fā)酵時(shí)間為30-50天；
d)發(fā)酵完成后，質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)按照產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求檢測(cè)合格后，即得發(fā)酵組合物。
本發(fā)明還公開了一種治療急性白血病的植物酵素的制備方法，該方法包括：
1)制備發(fā)酵組合物
2)植物提取液的制備：凈選3kg的植物原料，添加1kg重量的糖至植物原料中，并加入10l的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過(guò)濾，得植物提取液；
3)植物酵素原液的制備：接種復(fù)合菌群至植物提取液中，混勻置于密閉環(huán)境，進(jìn)行避光發(fā)酵1～2個(gè)月，得到植物酵素原液；
其中接種量為8～12％；復(fù)合菌群為釀酒酵母、德氏乳桿菌乳亞種、植物乳桿菌、革蘭氏乳桿菌、嗜酸性乳桿菌和醋酸桿菌中的幾種；
4)植物酵素的制備：選用10l以上的大桶，添加天然麥芽糖125g、維生素c鈉5g、8l水以及植物原料0.5kg，加入150ml的植物酵素原液于密閉環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28～30℃，每天放氣1～2次，發(fā)酵1～2d后；添加30g的步驟1)制備的發(fā)酵組合物，發(fā)酵溫度不變，繼續(xù)發(fā)酵3-4d，過(guò)濾，即得植物酵素。
該方式適用于工業(yè)生產(chǎn)，結(jié)合植物酵素原液初次發(fā)酵和本發(fā)明發(fā)酵組合物的二次發(fā)酵實(shí)現(xiàn)多級(jí)深層液態(tài)發(fā)酵；大大提高發(fā)酵效率。發(fā)酵過(guò)程中可釋放出封閉在中藥或植物結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物素，對(duì)植物原有的活性物質(zhì)進(jìn)行保留，植物中不溶性纖維變?yōu)榭扇苄陨攀忱w維提高原有植物的功效。
本發(fā)明所提供的制備工藝運(yùn)用了現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，以多種中藥材和果蔬的提取液為營(yíng)養(yǎng)液，以多種復(fù)合益生菌為轉(zhuǎn)化工具，采用多級(jí)深層液態(tài)發(fā)酵，能降解原料中的有毒有害物，形成新的活性成分，釋放出其中的藥效成分和營(yíng)養(yǎng)物素，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生糖化酶、蛋白酶、sod抗氧化酶等有效成分。而且，該制備工藝實(shí)現(xiàn)了成本低、操作簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明研制的發(fā)酵組合物為新型發(fā)酵產(chǎn)品，是用于制備酵素的“發(fā)酵菌包”，改良了直接添加益生菌制備植物酵素的傳統(tǒng)工藝，該菌包使用方便，可直接以粉劑的菌包供家庭式制作使用，亦可投入各類植物酵素的工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)植物酵素的即配即用和多元化的功能性配置，極大地提高植物酵素的制備效率。
本發(fā)明中所用主要原料的來(lái)源如下：
小薊：為菊科刺兒菜屬植物刺兒菜的干燥地上部分帶花全草。味甘、苦，性涼，歸心、肝經(jīng)涼血。祛瘀，止血。治吐血，衄血，尿血，血淋。
槐角：為豆科植物槐的干燥成熟果實(shí)。味苦，性寒，歸肝、大腸經(jīng)。涼血止血，清肝明目，血痢，血淋，血熱吐衄，肝熱目赤，頭暈?zāi)垦！?/p>
大青葉：為十字花科植物菘藍(lán)的干燥葉。味苦，性寒，歸心、胃經(jīng)。清熱解毒，涼血消斑，用于溫邪入營(yíng)，高熱神昏，發(fā)斑發(fā)疹，黃疸，熱痢，痄腮，喉痹，丹毒，癰腫。
大棗：為鼠李科棗屬植物棗的干燥成熟果實(shí)。味甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)。補(bǔ)脾胃，益氣血，安心神，調(diào)營(yíng)衛(wèi)，和藥性，主脾胃虛弱；氣血不足，倦怠乏力。
紫草：為紫草科植物新疆紫草、紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根。味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)。涼血，活血，解毒透疹，用于血熱毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透。
蒲公英：為菊科植物蒲公英、堿地蒲公英或同屬數(shù)種植物的干燥全草。味苦、甘，性寒，歸肝、胃經(jīng)。清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋，用于疔瘡腫毒，乳癰，瘰癘，目赤，，濕熱黃疸，熱淋澀痛。
連翹：為木犀科植物連翹的干燥果實(shí)。味苦，性微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)。清熱解毒，消腫散結(jié)，用于癰疽，瘰癘，乳癰，丹毒，風(fēng)熱感冒，溫病初起，溫?zé)崛霠I(yíng)，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋尿閉。
連翹：為木犀科植物連翹的干燥果實(shí)。味苦，性微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)。清熱解毒，消腫散結(jié)。用于癰疽，瘰癘，乳癰，丹毒，風(fēng)熱感冒，溫病初起，溫?zé)崛霠I(yíng)，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋尿閉。
玄參：為玄參科植物玄參的干燥根。味甘、苦、咸，性微寒。歸肺、胃、腎經(jīng)。涼血滋陰，瀉火解毒，用于熱病傷陰，舌絳煩渴，溫毒發(fā)斑，津傷便秘，骨蒸勞嗽，目赤，咽痛，瘰癘，白喉，癰腫瘡毒。
赤芍：為毛茛科植物芍藥(野生種)、草芍藥、川赤芍等的根。味酸苦，性涼，入肝、脾經(jīng)。行瘀，止痛，涼血，消腫，治瘀滯經(jīng)閉，疝瘕積聚，腹痛，脅痛，衄血，血痢，腸風(fēng)下血，目赤，癰腫。
水牛角：為?？苿?dòng)物水牛的角。味苦，性寒，歸心、肝經(jīng)。清熱解毒，涼血，定驚，用于溫病高熱，發(fā)斑發(fā)疹，吐血衄血，驚風(fēng)。
半枝蓮：為唇形科植物半枝蓮的干燥全草。味辛、苦，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)。清熱解毒，化瘀利尿，用于疔瘡腫毒，咽喉腫痛，毒蛇咬傷，跌撲傷痛，水腫，黃疸。
杏子：為薔薇科植物杏或山杏的果實(shí)。味酸甘，性溫。潤(rùn)肺定喘，生津止渴。主肺燥咳嗽，治心中冷熱。
生地：為玄參科植物地黃的塊根。味甘，性寒，歸心，肝，腎經(jīng)。內(nèi)蓄血者，并治鼻衄、吐血不盡，內(nèi)有瘀血，生地治時(shí)氣熱毒在臟腑，欲發(fā)赤斑
葡萄：葡萄科葡萄屬植物葡萄，以果、根、藤入藥。味甘酸，性平，入肺、脾、腎經(jīng)。補(bǔ)氣血，強(qiáng)筋骨，利小便，治氣血虛弱，肺虛咳嗽，心悸盜汗，風(fēng)濕痹病，淋病，浮腫。
蘋果：為薔薇科植物蘋果的果實(shí)。味甘，性涼。生津，潤(rùn)肺，除煩，解署，開胃，醒酒。
冬蟲夏草：為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。歸肺、腎經(jīng)，補(bǔ)虛損，益精氣，止咳化痰。治痰飲喘嗽，虛喘，癆嗽，咯血，自汗盜汗，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，病后久虛不復(fù)。
白花蛇舌草：為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草的全草。味甘、淡，性涼，入胃、大腸、小腸經(jīng)。清熱解毒，利濕，主肺熱喘咳，咽喉腫痛，癤腫瘡瘍，熱淋澀痛，水腫，痢疾，腸炎，濕熱黃疸，癌腫。
本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明治療急性白血病的發(fā)酵組合物經(jīng)科學(xué)合理配方，有效利用天然植物接入優(yōu)良有益菌株進(jìn)行發(fā)酵，很好地復(fù)合了果蔬、中草藥食等多種植物的綜合調(diào)理性，通過(guò)高質(zhì)量的發(fā)酵,中藥的部分毒性會(huì)進(jìn)一步削弱甚至消除,而且部分中藥成分經(jīng)過(guò)發(fā)酵改性更容易被服用者吸收，使制得的發(fā)酵組合物不但保持了治療急性白血病的中藥原有的藥效，還疊加了植物通過(guò)發(fā)酵可以產(chǎn)生人體需要的各種酵素、寡糖及多種維他命和礦物質(zhì)，又可產(chǎn)生豐富的可抑制癌細(xì)胞再形成或擴(kuò)散的sod抗氧化酶等效果。而且，本發(fā)明發(fā)酵組合物的制備方法，操作簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)，同時(shí)也適用于家庭自制，制得的發(fā)酵組合物比普通中藥湯劑更加適口。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
實(shí)施例1發(fā)酵組合物
發(fā)酵組合物處方：
中藥成分：小薊25g、槐角15g、大青葉25g、大棗30g、紫草15g、蒲公英25g、連翹20g、玄參20g、赤芍20g、水牛角15g、半枝蓮30g、杏子40g、生地20g、葡萄40g，蘋果35g、冬蟲夏草10g、白花蛇舌草5g。
益生菌粉劑：釀酒酵母45g、雙叉桿菌40g、植物乳桿菌50g、鼠李糖乳桿菌40g、嗜酸性乳桿菌45g和醋酸桿菌40g。
制備方法：
本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物的制備方法，包括如下步驟：
a)稱取20g玄參和15g紫草，加入90％～95％的乙醇進(jìn)行回流提取，得到提取液和殘?jiān)?，將提取液回收乙醇，在50℃下干燥，制得乙醇提取物；
b)稱取小薊25g、槐角15g、大青葉25g、大棗30g、蒲公英25g、連翹20g、赤芍20g、水牛角15g、半枝蓮30g、杏子40g、生地20g、葡萄40g，蘋果35g、冬蟲夏草10g、白花蛇舌草5g，合并步驟a)的殘?jiān)?后置于提取罐中，加水至原料重量的2～10倍量以上，使原料全部浸沒(méi)在水中，加熱水溫至60℃，浸泡6小時(shí)，再加熱至100℃以上，煎煮50分鐘后，將提取液過(guò)濾出來(lái)，再加原料6倍量水煎煮一次，過(guò)濾提取液，兩次提取液合并，減壓濃縮、冷凍干燥，低溫粉碎成0.05-0.2mm的中藥細(xì)粉；將預(yù)定重量份數(shù)的益生菌粉劑、抗性糊精和步驟(1)中的中藥細(xì)粉均勻混合10～15min，將混合粉加入干法造粒機(jī)造粒，制得顆粒狀的發(fā)酵組合物。
實(shí)施例2發(fā)酵組合物
發(fā)酵組合物處方：
中藥成分：小薊15g、槐角20g、大青葉15g、大棗35g、紫草20g、蒲公英20g、連翹20g、玄參25g、赤芍18g、水牛角20g、半枝蓮25g、杏子45g、生地25g、葡萄35g，蘋果30g、冬蟲夏草15g、白花蛇舌草10g。
益生菌粉劑：釀酒酵母35g、雙叉桿菌30g、植物乳桿菌45g、鼠李糖乳桿菌40g、嗜酸性乳桿菌40g和醋酸桿菌30g。
本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物的制備方法，包括如下步驟：
a)稱取紫草20g和玄參25g，加入90％～95％的乙醇進(jìn)行回流提取，得到提取液和殘?jiān)?，將提取液回收乙醇，在50℃下干燥，制得乙醇提取物；
b)稱取小薊15g、槐角20g、大青葉15g、大棗35g、蒲公英20g、連翹20g、赤芍18g、水牛角20g、半枝蓮25g、杏子45g、生地25g、葡萄35g，蘋果30g、冬蟲夏草15g、白花蛇舌草10g。,a)的殘?jiān)?后置于提取罐中，加水至原料重量的10倍量以上，使原料全部浸沒(méi)在水中，加熱水溫至60℃，浸泡10小時(shí)，再加熱至100℃以上，煎煮30分鐘后，將提取液過(guò)濾出來(lái)，再加原料8倍量水煎煮一次，過(guò)濾提取液，兩次提取液合并，減壓濃縮、冷凍干燥，低溫粉碎成0.05-0.2mm的中藥細(xì)粉；將預(yù)定重量份數(shù)的益生菌粉劑、抗性糊精和步驟(1)中的中藥細(xì)粉均勻混合10～15min，將混合粉加入干法造粒機(jī)造粒，制得顆粒狀的發(fā)酵組合物。
實(shí)施例3植物酵素
本實(shí)施例的植物酵素由下述方法制備而成：
a)發(fā)酵組合物的制備:按照實(shí)施例1的發(fā)酵組合物制備；
b)發(fā)酵組合物加入純化水中，加5-8％紅糖、2％蛋白胨調(diào)合，105℃高溫滅菌40分鐘，過(guò)濾，濾液即為營(yíng)養(yǎng)液；
c)冷卻、接種，將步驟b)的營(yíng)養(yǎng)液在發(fā)酵罐內(nèi)，冷卻至30-32℃接復(fù)合益生菌種，混合發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)邊攪拌邊發(fā)酵,發(fā)酵溫度為30℃-35℃，發(fā)酵時(shí)間為30-50天；
d)發(fā)酵完成后，質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)按照產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求檢測(cè)合格后，即得發(fā)酵組合物。感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈紅褐色，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。
實(shí)施例4植物酵素
1)制備發(fā)酵組合物
2)植物提取液的制備：凈選3kg的植物原料，添加1kg重量的糖至植物原料中，并加入10l的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過(guò)濾，得植物提取液；
3)植物酵素原液的制備：接種復(fù)合菌群至植物提取液中，混勻置于密閉環(huán)境，進(jìn)行避光發(fā)酵1～2個(gè)月，得到植物酵素原液；
其中接種量為8～12％；復(fù)合菌群為釀酒酵母、德氏乳桿菌乳亞種、植物乳桿菌、革蘭氏乳桿菌、嗜酸性乳桿菌和醋酸桿菌中的幾種；
4)植物酵素的制備：選用10l以上的大桶，添加天然麥芽糖125g、維生素c鈉5g、8l水以及植物原料0.5kg，加入150ml的植物酵素原液于密閉環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28～30℃，每天放氣1～2次，發(fā)酵1～2d后；添加30g的步驟1)制備的發(fā)酵組合物，發(fā)酵溫度不變，繼續(xù)發(fā)酵3-4d，過(guò)濾，即得植物酵素。
感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈紅褐色，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。
試驗(yàn)例1藥效學(xué)試驗(yàn)
(一)實(shí)驗(yàn)材料
1.動(dòng)物
icr小鼠，體重25-30g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科院血液病研究所動(dòng)物室。
2.細(xì)胞株
可移植性l7212白血病小鼠，由中國(guó)醫(yī)科院血液病研究所動(dòng)物室提供。
3.藥品與試劑
實(shí)驗(yàn)組：采用實(shí)施例1、2的發(fā)酵組合物；
對(duì)照組：生理鹽水
(二)試驗(yàn)方法
給藥方法：實(shí)驗(yàn)組，每天給藥一次，每次每只小鼠給藥0.3ml，采用灌胃法連續(xù)給藥6天。
對(duì)照組每次灌胃給生理鹽水0.3ml，次數(shù)和時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組。
每組小鼠各為30只，無(wú)差異性。
接種方法：取l7212白血病小鼠，脫頸椎處死，腹部用碘酊、酒精消毒。無(wú)菌條件下取脾放入組織研磨器中，加無(wú)菌生理鹽水6ml,輕輕研磨，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為2500～2800萬(wàn)/ml，于每只實(shí)驗(yàn)小鼠的右下腹部注射上述混勻的脾細(xì)胞懸液0.1ml。
生存時(shí)間觀察：運(yùn)用公式(t-c)/t計(jì)算,其中t表示治療組小鼠平均生存天數(shù)，c表示對(duì)照組小鼠平均生存天數(shù)；
血常規(guī)檢查：由小鼠尾靜脈取血，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)及白血病細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，血紅蛋白，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。
骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及涂片分類：取一段完整的股骨，用4ml生理鹽水反復(fù)沖洗3～4c次，使細(xì)胞分散，混勻，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算有核細(xì)胞數(shù)。取一段股骨，用注射器蘸小牛血清一滴，將骨髓吹出，涂片5張，涂片曬干后用姬氏染色法染色后，于油鏡下計(jì)數(shù)200～500個(gè)有核細(xì)胞求出白血病細(xì)胞的百分比、絕對(duì)值。
肝脾指數(shù)的計(jì)算：打開小鼠腹腔，取出肝脾后立即稱重。肝指數(shù)：肝重(g)/體重(g),脾數(shù)：脾(g)/體重(g)。
表1接種6天時(shí)各組血像比較
表2各種小鼠骨髓變化比較
4.結(jié)果
4.1外觀表現(xiàn)：接種6天后，對(duì)照組小鼠萎靡，少動(dòng)，松毛，實(shí)驗(yàn)組無(wú)這些現(xiàn)象，第8、9天開始，實(shí)驗(yàn)組陸續(xù)出現(xiàn)這些現(xiàn)象。
4.2脾臟變化：接種第5天后，對(duì)照組小鼠可觸及腫大的脾臟，接種可觸及腋下腫大的淋巴結(jié)。實(shí)驗(yàn)組在第8天開始出現(xiàn)上述現(xiàn)象。
4.3血像變化：接種第6天后，實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞計(jì)數(shù)及白血病細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，血紅蛋白，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均較對(duì)照組差異具有顯著意義。
4.4骨髓變化:實(shí)驗(yàn)組骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，有核紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
由此可見，實(shí)施例1、2的發(fā)酵組合物具有明顯抑制和殺傷實(shí)驗(yàn)白血病小鼠白血病細(xì)胞的作用，可以減輕、緩解白血病細(xì)胞對(duì)臟器的浸潤(rùn)作用，顯著延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。
試驗(yàn)例二.毒性試驗(yàn)
(一)急性毒性試驗(yàn)
1.試驗(yàn)對(duì)象：健康sd大鼠
試驗(yàn)組10例，雄鼠，年齡5周齡；
對(duì)照組10例，雄鼠，年齡5周齡。
2.試驗(yàn)方法：
試驗(yàn)組：將本發(fā)明的發(fā)酵組合物，給大鼠按一次40ml/kg灌胃，一日內(nèi)連續(xù)兩次，然后停藥，停藥后繼續(xù)觀察7天。
對(duì)照組：用生理鹽水給大鼠按一次40ml/kg灌胃，一日內(nèi)連續(xù)兩次，然后停藥，停藥后繼續(xù)觀察7天。
3.統(tǒng)計(jì)方法：分別在試驗(yàn)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天，記錄兩組大鼠的死亡率及大鼠行為有無(wú)明顯異常；在觀察期結(jié)束后，于第8天處死大鼠，進(jìn)行剖檢，記錄兩組大鼠的臟器異常改變情況。
4.試驗(yàn)結(jié)果：
試驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3急性毒性試驗(yàn)結(jié)果
5.結(jié)論：本發(fā)明的發(fā)酵組合物，安全度高，無(wú)急性毒性。
(二)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)
1.試驗(yàn)對(duì)象：健康sd大鼠
試驗(yàn)組10例，雄鼠，年齡5周齡；
對(duì)照組10例，雄鼠，年齡5周齡。
2.試驗(yàn)方法：
試驗(yàn)組：喂食拌有本發(fā)明的發(fā)酵組合物的食物，用藥劑量以白鼠體重計(jì)，每日0.05g/kg，連續(xù)180天，停藥后繼續(xù)觀察30天。
對(duì)照組：喂食與試驗(yàn)組一樣的食物，食物量也與試驗(yàn)組一樣，連續(xù)180天；隨后的30天觀察期期間，大鼠與試驗(yàn)組一樣對(duì)待。
3.統(tǒng)計(jì)方法：分別在試驗(yàn)0天、30天、60天、90天、120天、150天、180天、及觀察期結(jié)束時(shí)，記錄兩組大鼠的死亡率及大鼠行為有無(wú)明顯異常；在觀察期結(jié)束后，處死大鼠，進(jìn)行剖檢，記錄兩組大鼠的臟器異常改變情況。
4.試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果見表4。
表4長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果
表4的比較結(jié)果如下：
5.結(jié)論：本發(fā)明的發(fā)酵組合物，安全度高，無(wú)長(zhǎng)期毒性。
(三)結(jié)論
由急性毒性試驗(yàn)結(jié)果和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明的發(fā)酵組合物，安全度高，無(wú)毒性。
試驗(yàn)例3人體試食評(píng)價(jià)試驗(yàn)
1.一般資料
選擇2012年5月～2014年5月，綜合評(píng)價(jià)以服用本發(fā)明發(fā)酵組合物的急性白血病患者40例，患者均符合急性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男17例，女23例，年齡20～52歲。其中，急性淋巴細(xì)胞白血病(all)18例，急性非淋巴細(xì)胞白血病(anll)22例。
2.評(píng)價(jià)方法：
初治：使用本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，每日2次，一月為一個(gè)療程，連續(xù)使用四個(gè)療程。
復(fù)治：初治未緩解或復(fù)發(fā)，使用本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，口服每日2次，一月為一個(gè)療程，連續(xù)使用兩個(gè)療程。
3.評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：
完全緩解：患者同時(shí)滿足：(1)臨床無(wú)白血病浸潤(rùn)所致的癥狀和體征，生活正常或接近正常；(2)血常規(guī)化驗(yàn)顯示血紅蛋白≥100g/l(男性)或≥90g/l(女性及兒童)，中性粒細(xì)胞絕對(duì)值>1.5×109/l，血小板≥100×109/l，外周血中未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞；(3)骨髓中原始細(xì)胞≤5％，紅細(xì)胞及巨核細(xì)胞系正常。
部分緩解：患者骨體檢查符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，但臨床或血常規(guī)化驗(yàn)尚未達(dá)到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。
無(wú)效：患者經(jīng)治療后病情基本無(wú)變化或者更重。
4.試驗(yàn)結(jié)果：
表5治療急性白血病的療效
5.效果判定：本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物,40例急性白血病患者中，完全緩解(cr)19例(47.5％),部分緩解(pr)8例(20％)總有效率67.5％，可以很好地緩解急性白血病，治療急性白血病患者身體。
典型應(yīng)用1：
李某，女，38歲，皮膚粘膜蒼白、頭暈、乏力、心悸、氣急及多汗，多次反復(fù)高燒。當(dāng)做普通發(fā)燒久治無(wú)效，去醫(yī)院檢查為急性白血病。治療：按療程使用由本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，使用方法為每日2次，一月為一個(gè)療程，連續(xù)使用四個(gè)療程，患者完全緩解。繼續(xù)使用1個(gè)療程，加以鞏固。跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)一年后無(wú)復(fù)發(fā)。
典型應(yīng)用2：
劉某，男，32歲，突痛、惡心、嘔吐，脾、淋巴結(jié)腫，去醫(yī)院做化療后效果不理想。治療：按療程使用由本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，使用方法每日2次，一月為一個(gè)療程，連續(xù)使用四個(gè)療程，治療4個(gè)療程后，急性白血病部分緩解。繼續(xù)使用2個(gè)療程，完全緩解。繼續(xù)使用1個(gè)療程，加以鞏固。跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)兩年后無(wú)復(fù)發(fā)。
典型應(yīng)用3：
王某，男，62歲，脾、淋巴結(jié)腫，診斷為急性白血病。治療：按療程使用由本發(fā)明的治療急性白血病的發(fā)酵組合物，使用方法每日2次，一月為一個(gè)療程，連續(xù)使用四個(gè)療程，治療4個(gè)療程后，急性白血病部分緩解。繼續(xù)使用2個(gè)療程，完全緩解。繼續(xù)使用1個(gè)療程，加以鞏固。跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)一年后無(wú)復(fù)發(fā)。