本發(fā)明屬于天然提取領(lǐng)域，具體涉及一種菠蘿葉醇提取物的乙醚萃取物及其制備方法與抑制酪氨酸酶的用途。

背景技術(shù)：

黑色素(melanin)主要由人體的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生，它能減少紫外線對(duì)皮膚的傷害；然而黑色素的異常蓄積會(huì)造成色素沉著過度，容易引起雀斑、老年斑、黑斑病等。研究者發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶在黑色素的生物合成過程中有重大作用。在黑色素生物合成過程中，酪氨酸酶起著十分重要的催化作用。酪氨酸酶能夠促進(jìn)l-酪氨酸轉(zhuǎn)化為l-多巴，l-多巴又經(jīng)過氧化而轉(zhuǎn)化為多巴醌，多巴醌多聚生成黑色素。目前主要通過以下兩個(gè)途徑達(dá)到抑制生成的黑色素：一個(gè)是阻止黑色素的生成(抑制酪氨酸酶的活性)；另一途徑是促使已生成的色素排出體外。其中，前者效果較好，是目前研究的重點(diǎn)。

菠蘿葉具有很高的綜合開發(fā)價(jià)值，已有文獻(xiàn)報(bào)道，從葉片中提取的纖維，是一種優(yōu)異的天然抗菌紡織原料；提取纖維后的葉的渣還可以開發(fā)飼料、沼氣和有機(jī)肥，實(shí)現(xiàn)綜合利用。但目前尚未有關(guān)于其抑制酪氨酸酶活性的報(bào)道，其有望作為美白劑應(yīng)用與美白化妝品領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種菠蘿葉提取物，其特征在于所述菠蘿葉提取物由如下方法制備，所述方法包括如下步驟：

(1)取干燥菠蘿葉，粉碎后，加入溶劑中，于40-50℃條件下浸泡提取2-4次，每次提取時(shí)間為6-8小時(shí)，菠蘿葉與溶劑的質(zhì)量體積比(kg/l)為1：5-20；

(2)將步驟(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，過濾除去固體殘?jiān)?，得濾液；

(3)步驟(2)中得到的濾液經(jīng)減壓濃縮除去有機(jī)溶劑后，加入水使其分散，接著用石油醚萃取2-4次；

(4)將步驟(3)萃取后的石油醚相進(jìn)行合并，減壓濃縮后，干燥得所述菠蘿葉提取物。

步驟(1)中所述溶劑選自甲醇-乙醇-異丙醇混合溶劑，三者體積比為甲醇：乙醇：異丙醇＝3：6：1；步驟(3)中水的用量為步驟(1)中有機(jī)溶劑體積的1/3至1/2；石油醚的用量為水體積的1-3倍；步驟(4)中所述的干燥為烘干或噴霧干燥。

本發(fā)明提供菠蘿葉提取物對(duì)酪氨酸酶具有很強(qiáng)的抑制作用，可用于化妝品領(lǐng)域作為美白劑，天然無刺激。本發(fā)明有效解決了菠蘿加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物——菠蘿葉資源浪費(fèi)、對(duì)環(huán)境造成污染的問題。

本發(fā)明提供一種菠蘿葉提取物的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)取干燥菠蘿葉，粉碎后，加入溶劑中，于40-50℃條件下浸泡提取2-4次，每次提取時(shí)間為6-8小時(shí)，菠蘿葉與溶劑的質(zhì)量體積比(kg/l)為1：5-20；

(2)將步驟(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，過濾除去固體殘?jiān)?，得濾液；

(3)步驟(2)中得到的濾液經(jīng)減壓濃縮除去有機(jī)溶劑后，加入水使其分散，接著用石油醚萃取2-4次；

(4)將步驟(3)萃取后的石油醚相進(jìn)行合并，減壓濃縮后，干燥得所述菠蘿葉提取物。

步驟(1)中所述溶劑選自甲醇-乙醇-異丙醇混合溶劑，三者體積比為甲醇：乙醇：異丙醇＝3：6：1；步驟(3)中水的用量為步驟(1)中有機(jī)溶劑體積的1/3至1/2；石油醚的用量為水體積的1-3倍；步驟(4)中所述的干燥為烘干或噴霧干燥。

本發(fā)明提供一種菠蘿葉提取物在制備美白劑中的用途。

本發(fā)明提供一種菠蘿葉提取物在抑制酪氨酸酶方面的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的菠蘿葉與溶劑的質(zhì)量體積比(kg/l)為1：5-20是指單次浸泡提取時(shí)每千克菠蘿葉使用5-20l溶劑。

附圖說明

圖1黑色素的吸光值與溫度(a-t)圖

圖2黑色素的吸光值與反應(yīng)時(shí)間(a-t)圖

圖3黑色素的吸光值與l-酪氨酸物質(zhì)的量濃度(a-c)圖

圖4黑色素的吸光值與l-酪氨酸用量(a-v)圖

圖5黑色素的吸光值與土豆質(zhì)量/緩沖溶液體積圖

圖6菠蘿葉提取物gc-ms圖

圖7菠蘿葉提取物濃度與酪氨酸酶抑制率的關(guān)系圖

圖8熊果苷酵素濃度與酪氨酸酶抑制率的關(guān)系圖

具體實(shí)施方案

本發(fā)明中涉及的酪氨酸酶是可按文獻(xiàn)的方法(李好樣，呂海燕，董金龍.馬鈴薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究[j].光譜實(shí)驗(yàn)室，2008，25(6)：1040-1043)從土豆中提取的；或按下列方法提?。簩⑼炼瓜磧粝髌ぃ袎K后放置于冰箱冷凍層，冷凍過夜。需用時(shí)取出稱重，與相應(yīng)比例的緩沖溶液[土豆質(zhì)量：緩沖溶液體積＝1：5(g/ml)]共置于攪拌機(jī)中攪拌；將所得溶液進(jìn)行離心，離心速率為4000r/min，離心時(shí)長為5min，取上清液為實(shí)驗(yàn)所用(即土豆提取液)。

本發(fā)明所述的緩沖溶液為ph＝6.86的混合磷酸鹽緩沖溶液。

本發(fā)明從菠蘿的不同部位(果皮、果肉、葉)中提取出酵素，測定其對(duì)土豆中酪氨酸酶活性的抑制作用，通過計(jì)算抑制率來反映抑制作用。用熊果苷作為陽性對(duì)照，比較ic50的大小(任紅榮，單承鶯，姜洪芳，等.香水蓮花提取物抑制酪氨酸酶活性的研究[j].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23(06)：1122-1126；葉孝兆，龔盛昭，廖國俊，等.當(dāng)歸提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[j].日用化學(xué)工業(yè)，2010，40(02)：98-100)。

抑制率計(jì)算公式：[1-(t2-t1)/(c2-c1)]×100％

c1表示只有底物(土豆提取液和緩沖溶液的混合溶液)的吸光度值，c2表示含有底物和l-酪氨酸的吸光度值，c2-c1表示在扣除底物的吸光度后生成的黑色素的吸光度值。t1表示含有底物和樣品的吸光度值，t2表示含有底物、l-酪氨酸和樣品的吸光度值，t2-t1表示經(jīng)過樣品的抑制，在扣除樣品和底物的吸光度后剩余的黑色素的吸光度值。

實(shí)施例1酪氨酸酶促進(jìn)l-酪氨酸生成黑色素的最佳活性條件的確定

(1)溫度對(duì)酪氨酸酶最佳活性的影響

取10ml干凈干燥的棕色容量瓶8個(gè)，分為4組，每組2個(gè)，分別標(biāo)記為c1和c2。按照表1加入各試液：

表1體系組成及各試劑加入量

按照上表給4組容量瓶加入對(duì)應(yīng)量的緩沖溶液和l-酪氨酸溶液作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對(duì)應(yīng)量的土豆提取液，將4組溶液分別置于0℃、10℃、30℃、40℃下，反應(yīng)35min后，立即進(jìn)行吸光度的測量(測量波長為475nm為最好)。如圖1。

(2)體系反應(yīng)時(shí)間對(duì)酪氨酸酶最佳活性的影響

取100ml干凈干燥的棕色容量瓶兩個(gè)，標(biāo)記為c1和c2，按照表2加入各試液：

表2體系組成及各試劑加入量

按照上表給2個(gè)容量瓶加入對(duì)應(yīng)量的緩沖溶液和l-酪氨酸溶液作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對(duì)應(yīng)量的土豆提取液，將容量瓶置于10℃水浴，每隔5min測量一個(gè)吸光度，反應(yīng)總時(shí)長為90min(測量波長為475nm)。如圖2。

(3)l-酪氨酸物質(zhì)的量濃度對(duì)酪氨酸酶最佳活性的影響

用電子天平準(zhǔn)確稱取0.0181g的l-酪氨酸粉末，用緩沖溶液溶解定容于100ml的容量瓶中,可得1mmol/l的l-酪氨酸溶液。

取6個(gè)10ml干凈干燥的容量瓶，分別加入上述溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，用緩沖溶液定容至刻度線，即得物質(zhì)的量濃度分別為0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l的l-酪氨酸溶液。

另取10ml干凈干燥的棕色容量瓶12個(gè)，分為6組，每組2個(gè)，分別標(biāo)記為c1和c2。按照表3加入各試液：

表3體系組成及各試劑加入量

按照上表給4組容量瓶加入對(duì)應(yīng)量的緩沖溶液和不同物質(zhì)的量濃度的l-酪氨酸溶液作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對(duì)應(yīng)量的土豆提取液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖3。

(4)l-酪氨酸用量對(duì)酪氨酸酶最佳活性的影響

取10個(gè)10ml干凈干燥的容量瓶，分為5組，每組2個(gè)，分別標(biāo)記為c1和c2。按照表4加入各試液：

表4體系組成及各試劑加入量

表中x為1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，對(duì)應(yīng)y為8.0ml、7.5ml、

7.0ml、6.5ml、6.0ml，向5組容量瓶加入對(duì)應(yīng)量的緩沖溶液和不同量的l-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/l)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對(duì)應(yīng)量的土豆提取液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖4。

(5)土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比對(duì)酪氨酸酶最佳活性的影響

取10個(gè)10ml干凈干燥的容量瓶，分為5組，每組2個(gè)，分別標(biāo)記為c1和c2。按照表4加入各試液：

表5體系組成及各試劑加入量

土豆提取液中土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比(g/ml)分別為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。向5組容量瓶加入對(duì)應(yīng)量的緩沖溶液和l-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/l)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對(duì)應(yīng)量的土豆提取液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖5。

經(jīng)確定酪氨酸酶促進(jìn)l-酪氨酸生成黑色素的最佳活性條件：溫度10℃，反應(yīng)時(shí)間35min，l-酪氨酸物質(zhì)的量濃度為0.3mmol/l，l-酪氨酸的體積用量為2.5ml，制備土豆提取液時(shí)土豆質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為1：4。

實(shí)施例2

(1)取干燥菠蘿葉1kg，粉碎后，加入甲醇-乙醇-異丙醇混合溶劑5l(三者體積比為3：6：1)，于40-50℃條件下浸泡提取4次，每次提取時(shí)間為6小時(shí)；

(2)將步驟(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，過濾除去固體殘?jiān)?，得濾液；

(3)步驟(2)中得到的濾液經(jīng)減壓濃縮除去有機(jī)溶劑后，加入2.5l水使其分散，接著用石油醚萃取2次，每次使用石油醚5l；

(4)將步驟(3)萃取后的石油醚相進(jìn)行合并，減壓濃縮后，噴霧干燥得菠蘿葉提取物3.9g(gc-ms如圖6)。

實(shí)施例3

(1)取干燥菠蘿葉3kg，粉碎后，加入甲醇-乙醇-異丙醇混合溶劑60l(三者體積比為3：6：1)，于40-50℃條件下浸泡提取2次，每次提取時(shí)間為8小時(shí)；

(2)將步驟(1)中每次浸泡提取得到的浸提液合并，得到提取液，過濾除去固體殘?jiān)?，得濾液；

(3)步驟(2)中得到的濾液經(jīng)減壓濃縮除去有機(jī)溶劑后，加入20l水使其分散，接著用石油醚萃取4次，每次使用石油醚20l；

(4)將步驟(3)萃取后的石油醚相進(jìn)行合并，減壓濃縮后，噴霧干燥得菠蘿葉提取物13.7g。

實(shí)施例4

按照文獻(xiàn)的方法(中草藥，第46卷第7期第949-954頁)

稱取干燥菠蘿葉20kg，粉碎后用95％乙醇(5l)室溫下浸泡提取3次，浸泡時(shí)間分別為5、7、7d，合并提取液減壓濃縮得乙醇提取物1.0kg，將乙醇提取物用水(5l)分散后，先用石油醚萃取4次(每次使用5l石油醚)、醋酸乙酯萃取4次(每次使用5l乙酸乙酯)，將石油醚相、乙酸乙酯相即水相分別濃縮、干燥得到石油醚部位32g，乙酸乙酯部位310g，水相部位105g。

實(shí)施例5

按照專利cn104523463a的方法得到菠蘿葉丙酮提取物。

將500.0g洗凈、烘干、粉碎的菠蘿葉，用10l丙酮50℃超聲90min，功率為144w，頻率為25hz。過濾，濾渣重復(fù)提取2次，合并3次濾液在50℃下減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥，制得11.21g的干燥提取物。

經(jīng)hplc分析，實(shí)施例2和實(shí)施例3制備得到的菠蘿葉提取物的hplc圖出峰情況一致性在93％，其與實(shí)施例4制備的石油醚部位的出峰一致性較差，相似性僅為52％，與乙酸乙酯部位和水相部位一致性更差，僅為8％-15％；與實(shí)施例5的菠蘿葉丙酮提取物出峰一致性也較差，相似性僅為33％。

實(shí)施例6

在實(shí)施例1確定的酪氨酸酶促進(jìn)l-酪氨酸生成黑色素的最佳活性條件下，分別測試實(shí)施例2制備得到的菠蘿葉提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響，以熊果苷作為陽性對(duì)照。

(1)菠蘿葉提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

取1個(gè)25ml干凈干燥的容量瓶，精確稱量25mg的實(shí)施例2的菠蘿葉提取物固體樣品，用緩沖溶液溶解定容于容量瓶中，可得濃度為1mg/ml的樣品溶液。

另取6個(gè)10ml干凈干燥的容量瓶，每個(gè)容量瓶中分別加入上述樣品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，用緩沖溶液定容至刻度線，可得質(zhì)量濃度分別為0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.20mg/ml、0.25mg/ml、0.30mg/ml的6瓶溶液，貼上標(biāo)簽標(biāo)記。

再取24個(gè)10ml干凈干燥的容量瓶，分為6組，每組4個(gè)，分別標(biāo)記為c1、c2、t1、t2。按照表6加入各試液：

表6體系組成及各試劑加入量

按照上表給6組容量瓶加入對(duì)應(yīng)量的緩沖溶液和l-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/l)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對(duì)應(yīng)量的土豆提取液(土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比為1:4)，不同組中t1和t2中加入不同濃度的等量的樣品溶液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖7，當(dāng)石油醚萃取物的濃度由0.05mmol/l增加到0.20mmol/l時(shí)，石油醚萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率在逐漸升高，當(dāng)石油醚萃取物的濃度增到0.20mmol/l時(shí)，此時(shí)石油醚萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為90％，但是當(dāng)石油醚萃取物的濃度大于0.2mmol/l時(shí)，隨著石油醚萃取物濃度的增加石油醚萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率不再增加，在抑制率上升部分，半數(shù)抑制濃度為0.08mg/ml，即ic50＝0.08mg/ml。

(2)熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

取1個(gè)25ml干凈干燥的容量瓶，精確稱量0.25g的熊果苷固體樣品，用緩沖溶液溶解定容于容量瓶中，可得濃度為10mg/ml的樣品溶液。

另取9個(gè)10ml干凈干燥的容量瓶，每個(gè)容量瓶中分別加入上述溶液0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml、1.8ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml，用緩沖溶液定容至刻度線，可得質(zhì)量濃度分別為0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml的9瓶溶液，貼上標(biāo)簽標(biāo)記。

再取36個(gè)10ml干凈干燥的容量瓶，分為9組，每組4個(gè)，分別標(biāo)記為c1、c2、t1、t2。按照表7加入各試液：

表7體系組成及各試劑加入量

按照上表給9組容量瓶加入對(duì)應(yīng)量的緩沖溶液和l-酪氨酸溶液(濃度為0.3mmol/l)作為反應(yīng)體系的底物，然后加入對(duì)應(yīng)量的土豆提取液(土豆質(zhì)量與緩沖溶液體積比為1:4)，不同組中t1和t2中加入不同濃度的等量的樣品溶液。將容量瓶置于10℃水浴，反應(yīng)35min后，立即測量吸光度(測量波長為475nm)。如圖8，在酪氨酸酶活性最佳條件下，當(dāng)濃度為0.5mg/ml～2.0mg/ml之間時(shí)，樣品對(duì)酶活性的抑制率隨濃度的增大而增大，并在濃度為2.0mg/ml時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)的抑制率為61.68％；當(dāng)濃度為2.0mg/ml～3.5mg/ml之間時(shí)，抑制率隨濃度的增大而減小。在抑制率上升部分，半數(shù)抑制濃度為1.55mg/ml，即ic50＝1.55mg/ml。

實(shí)施例7

按照本發(fā)明實(shí)施例6中的方法，對(duì)實(shí)施例4制備的石油醚部位、乙酸乙酯部位和水相部位以及實(shí)施例5制備的菠蘿葉丙酮提取物進(jìn)行測試?yán)野彼崦敢种苹钚裕Y(jié)果發(fā)現(xiàn)水相部位、菠蘿葉丙酮提取物在濃度為5mg/ml時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶抑制率不足20％；石油醚部位在濃度為5mg/ml時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶抑制率不足50％；而乙酸乙酯部位在濃度為1mg/ml時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶顯示出一定的激活作用，激活率為15％。