分案說明本申請是申請日為2009年11月24日、國家申請?zhí)枮?00980146985.6、發(fā)明名稱為“多價rna納米顆粒組合物”的發(fā)明專利申請的分案申請。政府利益聲明根據(jù)國家癌癥研究所/癌癥納米技術中心(nationalcancerinstitute/centersofcancernanotechnologyexcellence(ncf/ccne))授予的專款號5u54ca119341和國家健康研究所(nationalinstitutesofhealth,nih)授予的?？钐?dplod000285，本申請是在政府的支持下進行的。本發(fā)明涉及用雙鏈rna官能化的納米顆粒。本發(fā)明還提供將rna與納米顆粒綴合的方法。
背景技術：
：rna干擾(rnai)是這樣一種現(xiàn)象：其中，當雙鏈rna(dsrna)存在于細胞中時，其抑制具有與所述雙鏈rna中的單鏈充分互補的序列的基因的表達?；虮磉_的抑制是由從靶基因轉錄的信使rna(mrna)的降解造成的[sharpctah,genesanddevelopment15:485-490(2001)]。負責誘導rnai的雙鏈rna稱為干擾rna。利用遺傳方法和生物化學方法，已經(jīng)研究了dsrna介導rnai的機制和細胞機構。生物化學分析表明，引入細胞細胞質的dsrna首先被加工成長度為21-25個核苷酸的rna片段[hammondetal.,nature404:293-296(2000)；hamiltonetal.,science286:950-952(1999)；zamoreetal.,cell101:25-33(2000)；yangetal.,currentbiology10:1191-1200(2000)；parrishetal.,molecularcell6:1077-1087(2000)]。在體外研究中已經(jīng)證明，至少在一種機制中，通過rnaseiii(rna酶iii)樣酶dicer產(chǎn)生這些稱為小干擾rna(sirna)的dsrna[hammondetal.,nature404:293-296(2000)]。這些sirna可能發(fā)揮mrna切割的向導的功能，因為靶mrna在與特定sirna雜交的區(qū)域中心的位置受到切割[sharp2001]。生物化學證據(jù)表明，sirna是稱為rna誘導的沉默復合物rna-inducedsilencingcomplex(risc)的多組分核酸酶復合物的一部分[hammondetal.,nature404:293-296(2000)]。已經(jīng)將該復合物蛋白中的一種蛋白即argonaute2鑒定為argonaute基因家族的產(chǎn)物[sharpetal.,genesanddevelopment15:485-490(2001)]。該蛋白是小鼠發(fā)育必不可少的，并且缺乏argonaute2的細胞不能建立針對sirna的實驗反應。argonaute2內(nèi)隱性核糖核酸酶h結構域中的突變，可以通過與archealargonaute蛋白結構的比較來鑒定，并且使risc失活。因此argonaute將“切片機(slicer)”活性歸功于risc，從而為rnai提供催化引擎[liuetal.,science305(5689):1437-1441(2004)]。該基因家族也含有秀麗線蟲(c.elegans)同源物rde-1和相關基因、粗糙脈胞菌(n.crassa)同源物qde-2以及擬南芥(arabidopsis)同源物arg-1，并且通過遺傳研究已經(jīng)證明，該基因家族是rnai所需的[sharpetal.,genesanddevelopment15:485-490(2001)；hammondetal.,nature404:293-296(2000)；hamiltonetal.,science286:950-952(1999)]。秀麗線蟲中的遺傳篩查已經(jīng)確定mut-7基因是rnai必不可少的。該基因具有與rnased相似之處，這表明該基因產(chǎn)物在反應的mrna降解步驟中發(fā)揮作用[sharpetal.,genesanddevelopment15:485-490(2001)]。在過去的10年中，研究人員已經(jīng)設計、合成、研究以及應用了多家dna官能化的金納米顆粒(dna-aunp).[mirkinetal.,nature382:607(1996)]。這些努力已經(jīng)使得對有關雜合納米結構有了新的基本理解[demersetal.,anal.chem.72:5535(2000)；jinetal.,j.am.chem.soc.125:1643(2003)；lytton-jeanetal.,j.am.chemsoc127:12754-12754(2005)；storhoffetal.,j.am.chem.soc.122:4640(2000)；youetal.,softmatter2:190(2006)；wangetal.,nanomed.1:413(2006)]、重要且在某些情況下商業(yè)上可行的監(jiān)測和診斷測定[nametal.,science301:1884(2003)；stoevaetal.,j.am.chem.soc.128:8378(2006)；liuetal.,j.am.chem.soc.126:12298(2004)；fauldsetal.,anal.chem.76:412(2004)]，以及能通過使用dna合成子使材料組裝程序化[mirkinetal.,nature382:607(1996)；parketal.,nature451:553(2008)；nykypanchuketal.,nature,451:549(2008)]。多價dna-aunps具有幾個獨特的特性，諸如明顯且升高的解鏈溫度[jinetal.,j.am.chem.soc.125:1643(2003)]、增強的結合特性[lytton-jeanetal.,j.am.chemsoc127:12754-12754(2005)](與同一序列的游離鏈相比)和距離依賴性光學特性[elghanianetal.,science277:1078(1997)]。與有關多價分子系統(tǒng)的研究[gestwickietal.,j.am.chem.soc.124:14922(2002)]一致，被提議的這些獨特特性來源于高表面dna密度和納米顆粒參與多齒相互作用(multidentateinteractions)的能力。技術實現(xiàn)要素：本文所描述的是納米顆粒組合物，其具有賦予使得所述組合物可用于基因調節(jié)的物理特性的結合的rna單層。與將rna引入細胞的其他材料相反，這些組合物不僅僅是rna的送遞工具，相反是利用由表面配體的排列和高密度產(chǎn)生的協(xié)作特性的單實體試劑。本文所述的組合物無需轉染劑即可進入細胞，并且以與常規(guī)的多聚體載體相比增強抑制活性(knockdownactivity)的方式抵抗降解。因此，在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其包含與納米顆粒結合的一種或多種核糖核酸(rna)多核苷酸，其中，所述rna多核苷酸具有多肽相互作用位點，并且其中所述rna多核苷酸具有在適于形成雙鏈體的條件下形成雙鏈體的序列，所述雙鏈體在所述雙鏈體的單鏈中具有至少一個與靶多核苷酸的序列充分互補的結構域，以允許所述單鏈與所述靶多核苷酸在適當?shù)臈l件下雜交，且所述雙鏈體的結構域與所述靶多核苷酸的序列的雜交產(chǎn)生多肽識別的底物位點，且所述rna多核苷酸以相對于所述多肽相互作用位點和所述納米顆粒定向特異性方式結合所述納米顆粒。在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其中，所述rna多核苷酸與納米顆粒共價結合。在其他方面，提供了納米顆粒組合物，其中，所述rna多核苷酸不與納米顆粒共價結合。在其他方面，提供了納米顆粒組合物，其中，每個與所述納米顆粒結合的rna多核苷酸具有相同的序列。在其他方面，提供了納米顆粒組合物，其中至少兩個與所述納米顆粒結合的rna多核苷酸具有不同的序列。在某些實施方案中，提供了納米顆粒組合物，其中，所述雙鏈體包含rna多核苷酸所形成的發(fā)夾結構。本文所公開的方法考慮了進一步包含附加多核苷酸的納米顆粒組合物，所述附加多核苷酸具有與rna多核苷酸的序列充分互補的序列，以便允許在適當條件下與rna多核苷酸雜交，以形成雙鏈體。在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其中所述附加多核苷酸是rna。在其他方面，提供了納米顆粒組合物，其中所述附加多核苷酸是脫氧核糖核酸(dna)。在其他實施方案中，提供了納米顆粒組合物，其中，所述附加多核苷酸與納米顆粒共價結合。在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其中，所述附加多核苷酸不與納米顆粒共價結合。在某些實施方案中，提供了納米顆粒組合物，其中，所述多肽相互作用位點相對于rna多核苷酸中點，位于靠近所述納米顆粒的一端。在其他實施方案中，提供了納米顆粒組合物，其中，所述多肽相互作用位點相對于rna多核苷酸的中點，位于位于遠離所述納米顆粒的一端。在所述方法的某些方面，提供了納米顆粒組合物，其具有的rna的表面密度為至少約2pmol/cm2至約1000pmol/cm2。在各種實施方案中，提供了納米顆粒組合物，其中，所述多肽相互作用位點與選自以下的蛋白結合：rnaseh、rnased、rnasel、rnaseiii、dicer、argonaute、argonaute2以及人免疫缺陷病毒反式激活反應rna結合蛋白(transactivatingresponserna-bindingprotein,trbp)。所述方法的其他方面提供了納米顆粒組合物，其中，所述多核苷酸的結構域的長度為約10個核苷酸。在某些實施方案中，提供了納米顆粒組合物，其中，所述rna多核苷酸還包括與靶多核苷酸的第二序列充分互補的第二結構域，并且所述rna多核苷酸的第二結構域與靶多核苷酸的第二序列的雜交產(chǎn)生第二多肽識別的其他底物位點。在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其中，所述多核苷酸的第二結構域的長度為約10個核苷酸。在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其中，底物位點和其他底物位點是相同的。在其他方面，提供了納米顆粒組合物，其中，底物位點和其他底物位點是不同的。在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其中，所述rna多核苷酸和所述附加多核苷酸在足以允許雜交的長度上彼此互補。在其他方面，提供了納米顆粒組合物，其中，所述rna多核苷酸和所述附加多核苷酸在它們的全長上彼此互補。在某些實施方案中,提供了納米顆粒組合物，其中，所述rna多核苷酸通過硫醇連接綴合于納米顆粒。在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其中，所述rna多核苷酸的半衰期與不和納米顆粒結合的相同rna多核苷酸的半衰期至少基本上相同。在其他方面，提供了納米顆粒組合物，其中所述rna多核苷酸的半衰期是不與納米顆粒結合的相同rna半衰期的約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍或更多。在各種實施方案中，提供了納米顆粒組合物，其中，所述rna多核苷酸的長度為約5至約100個核苷酸。在某些方面，提供了納米顆粒組合物，其中所述附加多核苷酸的長度為約5至約100個核苷酸。在某些實施方案中，提供了納米顆粒組合物，其中，所述納米顆粒是金。在某些方面，提供了納米顆粒，其中所述納米顆粒是銀。在某些方面，提供了使rna多核苷酸與納米顆粒結合的方法，其包括下述步驟：將硫醇化的rna多核苷酸雙鏈體與所述納米顆粒的混合物在一系列溶液中陳化(aging)，以便使所述rna多核苷酸與所述納米顆粒結合，從包含約0.1mnacl的第一溶液開始，每種溶液相對于前一溶液包含濃度漸增的氯化鈉(nacl)。在相關方面，所述方法還包括在最后的陳化步驟后超聲處理所述混合物的步驟。在某些方面，所述方法還包括分離所述納米顆粒的步驟。在某些實施方案中，提供了使rna與納米顆粒結合的方法，包括：(a)將硫醇化的rna雙鏈體與所述納米顆粒在包含約0.1m氯化鈉(nacl)的溶液中混合；(b)在一系列鹽溶液中陳化所述混合物，每種鹽溶液相對于前一溶液都包含濃度漸增的nacl；(c)超聲處理所述混合物；以及(d)純化綴合的納米顆粒。在所述方法的各種方面，鹽溶液系列的變化范圍為約0.1m至約0.3mnacl。所述方法的某些方面還包括用寡(乙二醇)硫醇(oeg)鈍化納米顆粒的表面。在某些實施方案中，提供了調節(jié)靶多核苷酸表達的方法，包括使所述靶多核苷酸與本公開的納米顆粒組合物的結構域雜交以形成多肽的底物位點的步驟。在某些方面，雜交導致靶多核苷酸降解。在各種方面，多肽選自rnaseh、rnased、rnasel、rnaseiii、dicer、argonaute、argonaute2以及trbp。根據(jù)下文所提供的詳細描述，本發(fā)明的其他方面將變得顯而易見。然而，應當理解的是，下列詳細描述和實施例盡管表示本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，但是其僅以例證的方式給出，因為根據(jù)本詳細描述，本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對本領域技術人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1描繪金納米顆粒(np)的特征。在高壓滅菌之前(a)和之后(b)，納米顆粒吸光度譜和tem成像。比例尺為50nm。圖2描繪金納米顆粒溶液中存在rnase。未處理的aunp表現(xiàn)出陽性信號，而使經(jīng)處理去除rnase活性的顆粒無rnase。圖3描繪匯合的hela細胞的光學顯微術圖像。在rna納米顆粒組合物合成時，在添加rna雙鏈體后，添加30μmol/ml寡乙二醇-硫醇(oeg-硫醇)，作為表面鈍化配體。發(fā)現(xiàn)該添加防止培養(yǎng)物中的顆粒沉淀。(a)沒有添加oeg-硫醇的細胞培養(yǎng)物中的rna-納米顆粒組合物表現(xiàn)出顆粒沉淀(黑色)。(b)具有oeg-硫醇的細胞培養(yǎng)物中的rna-納米顆粒組合物。比例尺為30μm。圖4描繪rna-aunp的細胞攝取。(a)與rna-aunp(cy5標記的rna)一起孵育了6個小時的hela細胞的熒光顯微術圖像。比例尺為20μm。(b)將rna-aunp處理的細胞與未處理的對照相比的流式細胞術分析。圖5描繪(a)4天內(nèi)熒光素酶表達的抑制。(b)rna-aunp的穩(wěn)定性。dsrna(正方形)和rna-aunp(三角形)在10％血清中的穩(wěn)定性的比較。圖6描繪rnaseiii對用雙鏈或單鏈發(fā)夾rna官能化的rna-aunp的活性。兩個系統(tǒng)都被rnaseiii識別為底物。最大熒光的差異部分歸因于裝載的差異(參見表1)。未添加酶的反應用于背景修正。圖7描繪dicer對用雙鏈(有義/fitcas、as/fitc有義)或單鏈發(fā)夾rna(fitchp)官能化的rna-aunp的活性。兩個系統(tǒng)都被dicer識別為底物，然而，如果有義鏈被固定，則可以觀察到更高的活性。最大熒光的差異部分歸因于裝載的差異(參見表1)。未添加酶的反應用于背景修正。圖8描繪rnaseiii對固定的有義、反義和發(fā)夾rna-aunp的活性。對于這種酶而言，如果固定有義鏈，則可觀察到更高的活性。具體實施方式到目前為止，還沒有研發(fā)出利用多價顆粒和它們不尋常的特性裝載和轉運rna穿過細胞膜的方法。實際上，必須開發(fā)克服合成途徑和材料，以克服與一種與rna有關的最富有挑戰(zhàn)性的問題，特別是其化學不穩(wěn)定性。rnai特異性抑制靶基因的表達的能力具有顯著的優(yōu)勢。例如，許多疾病都是由特定基因或基因組的異常表達引起的。rnai可用于抑制有害基因的表達，因而緩解疾病癥狀，或甚至提供治愈。例如，可以抑制有助于癌性狀態(tài)或病毒復制的基因。另外，可以抑制引起諸如強直性肌營養(yǎng)不良的顯性異常疾病的突變基因。炎性疾病，如關節(jié)炎，也可以通過抑制如環(huán)加氧酶或細胞因子的基因來治療。靶器官的實例包括但不限于肝、胰、脾、皮膚、腦、前列腺、心臟等。此外，rnai可用于產(chǎn)生模擬真實基因“敲除”動物的動物，以便研究基因功能。下文提供了所考慮的用途和靶標的其他描述。rna技術也可以促進藥物發(fā)現(xiàn)。用于靶標確認的rna方法提供了篩查潛在的藥物靶標的更快且花費更少的方法。藥物靶向信息不僅通過抑制潛在的藥物靶標獲得，而且還通過確定抑制的蛋白以及因此的通路是否具有顯著的表型作用獲得。例如，ldl受體表達的抑制應當提高血漿ldl水平，以及因此表明所述受體的上調具有治療益處?？梢杂帽磉_陣列測定抑制對除了靶基因或通路之外的基因的表達的應答作用[sharpetal.,genesanddevelopment15:485-490(2001)]。應當將基因產(chǎn)物置于功能通路和網(wǎng)絡(相互作用通路)內(nèi)。本文公開了rna寡核苷酸官能化的金納米顆粒利用由寡核苷酸的表面官能化而產(chǎn)生的全部特性來增加結合的rna的穩(wěn)定性和效能，同時保持在催化性rna干擾通路中起作用的能力。多價rna-納米顆粒組合物(如果納米顆粒是金，則為rna-aunp)的合成要求，所有的組分不含核酸酶，如rnase,核酸酶降解rna配體并且通過使au表面暴露而導致不穩(wěn)定的aunp相互作用(這可通過聚集來證明)。盡管制備無rnase的有機組分和溶液的條件已經(jīng)完全確立，但是本文還是提供了產(chǎn)生無rnase的無機金納米顆粒的方法。應當注意的是，術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中交換使用。還應當注意的是“綴合的”(conjugated)和“官能化”(functionalized)在本文中也交換使用。如本文所用，“底物位點”是被多肽識別和作用的多核苷酸(其是單鏈或雙鏈的)上的位置。如本文所用，“被……作用”應當理解為表示識別并與底物位點結合的多肽所執(zhí)行的任何酶促功能。如本文所用，“多肽相互作用位點”指多肽識別的多核苷酸(其是單鏈或者雙鏈的)上的位點。在各種方面，多肽識別相互作用位點導致多核苷酸的切割。在某些實施方案中，識別多肽相互作用位點的多肽自身作用于多核苷酸，在其他實施方案中，識別多核苷酸識別位點的多肽指導一種或多種其他多肽作用于所述多核苷酸的活性。如本文所用，術語“靶標”或“靶多核苷酸”指給定的rna多核苷酸所針對的多核苷酸。如本文所用，“rna”指包含至少一個核糖核苷酸殘基的分子。如本文所用，“雙鏈體”指兩個互補的或基本上互補的多核苷酸中的區(qū)域，所述多核苷酸彼此通過watson-crick堿基配對或通過允許互補或基本上互補的多核苷酸鏈間穩(wěn)定化的雙鏈體的任何其他方式形成堿基對。例如，具有21個核苷酸單元的多核苷酸鏈可以與另一個21個核苷酸單元的多核苷酸堿基配對，然而在每個鏈上僅19個堿基是互補或基本上互補的，以致“雙鏈體”具有19個堿基對。剩余的堿基可以例如作為5'和3'突出端(overhangs)存在。此外，在雙鏈體中，并不需要100％的互補性；在雙鏈體內(nèi)基本的互補性是允許的。基本的互補性指75％或更高的互補性。例如，由19個堿基對組成的雙鏈體中的錯配導致94.7％的互補性，從而是雙鏈體是基本上互補的。納米顆粒因此提供了被官能化為具有與其連接的多核苷酸的納米顆粒。納米顆粒的大小、形成和化學組成有助于所得的多核苷酸官能化的納米顆粒的特性。這些特性包括例如光學特性、光電特性、電化學特性、電子特性、在各種溶液中的穩(wěn)定性、磁特性以及孔和通道大小變化?？紤]了具有不同大小、形狀和/或化學組成的納米顆粒的組合物，以及具有統(tǒng)一大小、形狀和化學組成的納米顆粒的用途，和因此特性的混合。合適的顆粒的實例包括但不限于聚集顆粒、同向性顆粒(如球狀顆粒)、各向異性顆粒(如非球狀桿、四面體和/或棱柱)以及美國專利7,238,472和國際公開wo2003/08539所述的核-殼顆粒(core-shellparticle)，上述文獻的公開通過引用全文并入。在一實施方案中，納米顆粒是金屬的，并且在各種方面，納米顆粒是膠態(tài)金屬。因此，在各種實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒包括金屬(包括例如但不限于銀、金、鉑、鋁、鈀、銅、鈷、銦、鎳，或適用于納米顆粒形成的任何其他金屬)、半導體(包括例如但不限于cdse、cds和cds或用zns包被的cdse)和磁性(例如磁鐵)膠質材料。還如美國專利公開2003/0147966所述，本發(fā)明的納米顆粒包括商購可獲得的納米顆粒，以及合成的納米顆粒，如由在溶液中漸進性成核(如通過膠體反應)或通過各種物理和化學蒸汽淀積過程產(chǎn)生，如濺射淀積。參閱例如havashi,vac.sci.technol.a5(4):1375-84(1987)；hayashi,physicstoday,44-60(1987)；mrsbulletin,january1990,16-47。如美國專利公開2003/0147966進一步所述，利用本領域已知的方法，使用haucu和檸檬酸鹽還原劑，可選地產(chǎn)生所考慮的納米顆粒。參閱例如marinakosetal.,adv.mater.11:34-37(1999)；marinakosetal.,chem.mater.10:1214-19(1998)；enustun&turkevich,j.am.chem.soc.85:3317(1963)。納米顆粒平均直徑的大小范圍為約1nm至約250nm、約1nm至約240nm、約1nm至約230nm、約1nm至約220nm、約1nm至約210nm、約1nm至約200nm、約1nm至約190nm、約1nm至約180nm、約1nm至約170nm、約1nm至約160nm、約1nm至約150nm、約1nm至約140nm、約1nm至約130nm、約1nm至約120nm、約1nm至約110nm、約1nm至約100nm、約1nm至約90nm、約1nm至約80nm、約1nm至約70nm、約1nm至約60nm、約1nm至約50nm、約1nm至約40nm、約1nm至約30nm或約1nm至約20nm、約1nm至約10nm。在其他方面，納米顆粒的大小為約5nm至約150nm(平均直徑)、約5至約50nm、約10至約30nm、約10至150nm、約10nm至約100nm，或約10nm至約50nm。納米顆粒的大小為約5nm至約150nm(平均直徑)、約30nm至約100nm、約40nm至約80nm。方法中所用的納米顆粒大小根據(jù)它們具體用途或應用而變化。大小的變化有利地用于優(yōu)化納米2顆粒的某些物理特征，如可以按本文所述推理的光學特性或表面積的數(shù)量。與納米顆粒連接的多核苷酸因此提供了具有與其連接的多核苷酸的納米顆粒，其中，雙鏈rna與納米顆粒結合。在某些方面，與納米顆粒結合的rna是小干擾rna(sirna)?？紤]了雙鏈rna與納米顆粒通過各種方式的結合。根據(jù)本文所述的方法，合成檸檬酸鹽穩(wěn)定化的金納米顆粒，并用0.1％焦碳酸二乙酯(depc)將顆粒處理12小時，同時攪拌，隨后于120℃高壓滅菌60分鐘。在某些方面，用depc處理納米顆粒進行約1小時。在各種方面，用depc處理納米顆粒進行約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約10.5、約11、約11.5、約12、約12.5、約13、約13.5、約14、約14.5、約15、約20、約25、約30、約3天、約7天或更長。在一實施方案中，單鏈rna多核苷酸直接連接于納米顆粒，任選地通過本文所述的間隔區(qū)(spacer)連接。在單鏈rna多核苷酸連接于納米顆粒的方面中，rna多核苷酸包含兩個充分互補的部分，以允許所述兩個部分在適當?shù)臈l件下彼此雜交從而形成發(fā)夾結構。在另一實施方案中，任選地通過本文所述的間隔區(qū)，將雙鏈rna直接固定于納米顆粒上，從而使得雙鏈rna僅一條鏈直接連接于納米顆粒。在其他實施方案中，連接于納米顆粒的多核苷酸是dna。當dna連接于納米顆粒時，所述dna由與rna雙鏈體的單鏈區(qū)充分互補的序列構成，從而發(fā)生連接于納米顆粒的dna多核苷酸和rna雙鏈體的單鏈區(qū)的雜交，由此使雙鏈rna與納米顆粒結合。在一方面，雙鏈rna的單鏈區(qū)是突出端。在各種方面的dna是單鏈或者雙鏈的，只要雙鏈分子也包括與雙鏈rna的單鏈區(qū)雜交的單鏈區(qū)。多核苷酸定向有義對反義在某些方面，連接于納米顆粒的rna的鏈是“有義”鏈，且雙鏈rna的互補鏈與有義鏈雜交，但是不連接于納米顆粒。在其他方面，連接于納米顆粒的rna的鏈是“反義”鏈，且雙鏈rna的互補鏈與反義鏈雜交，但是不連接于納米顆粒。如本文所用，“有義”鏈是與靶多核苷酸相同的鏈，而“反義”鏈是與靶多核苷酸互補的鏈。有義鏈或反義鏈與納米顆粒的連接決定雙鏈rna與納米顆粒定向的一方面。本文證明，rna雙鏈體，其中的有義鏈連接于納米顆粒且反義鏈與有義鏈雜交但不連接于納米顆粒，比其中的反義鏈連接于納米顆粒且有義鏈與反義鏈雜交但不連接于納米顆粒的rna雙鏈體具有更高的活性(參閱實施例5)。在不受限于理論的情況下，認為rna雙鏈體與納米顆粒的連接的定向(例如但不限于無論是rna雙鏈體的有義鏈，還是反義鏈連接于納米顆粒)對呈遞本公開所考慮的多肽的底物是重要的。在某些方面，多肽是dicer。在某些方面，多肽是argonaute。多肽相互作用位點的位置在某些實施方案中，本公開考慮了連接于納米顆粒的多核苷酸是rna。還考慮了，使多核苷酸連接于納米顆粒，從而使位于rna序列中的蛋白相互作用位點相對于納米顆粒位于近端或遠端。在這些方面，“近端”和“遠端”指相對于多核苷酸的中點。例如，如果連接于納米顆粒的多核苷酸的長度為20個堿基，則中點在距納米顆粒10個堿基的位置，且蛋白相互作用位點相對于第10個堿基位于近端或遠端。利用本文所公開的方法將rna多核苷酸固定于納米顆粒上，允許控制本公開的多肽接近雙鏈體。在某些實施方案中，可以利用長度變化的間隔區(qū)序列，來改變納米顆粒上rna多核苷酸間的數(shù)量和距離，由此控制靶多核苷酸降解的速率。在不受限于理論的情況下，通過將rna多核苷酸固定于納米顆粒上，使得蛋白相互作用位點如上文所說位于近端位置，可以控制靶多核苷酸降解的速率。這方面，與下文所說的表面密度方法聯(lián)合，可以允許或者防止本公開的多肽接近蛋白相互作用位點。在下文，本文進一步詳細描述了間隔區(qū)。間隔區(qū)在某些方面，考慮了官能化的納米顆粒，其包括這樣的納米顆粒：其中寡核苷酸通過間隔區(qū)連接于納米顆粒。本文所用的“間隔區(qū)”表示這樣的部分：其本身不參與調節(jié)基因表達，但是當以多拷貝的方式連接于納米顆粒時，其作用是增加納米顆粒和功能寡核苷酸之間的距離，或增加個體寡核苷酸之間的距離。因此所考慮的間隔區(qū)以串聯(lián)方式位于個體寡核苷酸之間，無論寡核苷酸具有相同的序列還是具有不同的序列。在一方面，如果存在，間隔區(qū)是有機部分。在另一方面，間隔區(qū)是多聚體，包括但不限于水溶性多聚體、核酸、多肽、寡糖、碳水化合物、脂質、乙二醇或其組合。在某些方面，間隔區(qū)具有與其共價結合的多核苷酸，所述多核苷酸可以與納米顆粒結合。如上文所述，這些多核苷酸是相同的多核苷酸。作為間隔區(qū)與納米顆粒結合的結果，多核苷酸被遠離納米顆粒的表面隔開，并且更易與其靶標雜交。在間隔區(qū)是多核苷酸的情況中，在各種實施方案中，間隔區(qū)的長度為至少約10個核苷酸、10-30個核苷酸或甚至多于30個核苷酸。間隔區(qū)可以具有不干擾多核苷酸與納米顆?；虬卸嗪塑账峤Y合的能力的任何序列。間隔區(qū)不應當具有彼此互補或與寡核苷酸的序列互補的序列，但是可以與靶多核苷酸全部或部分互補。在某些方面，多核苷酸間隔區(qū)的堿基都是腺嘌呤、都是胸腺嘧啶、都是胞苷、都是鳥嘌呤、都是尿嘧啶或都是某些其他修飾的堿基。表面密度本文所提供的納米顆粒在納米顆粒的表面上具有多核苷酸的組裝密度，其在各種方面足以導致納米顆粒間和單個納米顆粒上多核苷酸鏈間的協(xié)作行為。在另一方面，納米顆粒間的協(xié)作行為增加了多核苷酸對核酸酶降解的抗性。仍然在另一方面，細胞攝取納米顆粒受與納米顆粒結合的多核苷酸的密度的影響。如pct/us2008/65366所述，其在此通過引用全文并入，在納米顆粒表面上更高密度的多核苷酸與細胞攝取的納米顆粒的增加有關。足以使納米顆粒穩(wěn)定的表面密度和對于期望的納米顆粒和多核苷酸的組合獲得所述密度所需的條件可以根據(jù)經(jīng)驗來確定。通常，至少2pmole/cm2的表面密度足以提供穩(wěn)定的納米顆粒-寡核苷酸組合物。在某些方面，表面密度為至少15pmoles/cm2。還通過了方法，其中多核苷酸以下述表面密度結合于納米顆粒：至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少約15pmol/cm2、至少約20pmol/cm2、至少約25pmol/cm2、至少約30pmol/cm2、至少約35pmol/cm2、至少約40pmol/cm2、至少約45pmol/cm2、至少約50pmol/cm2、至少約55pmol/cm2、至少約60pmol/cm2、至少約65pmol/cm2、至少約70pmol/cm2、至少約75pmol/cm2、至少約80pmol/cm2、至少約85pmol/cm2、至少約90pmol/cm2、至少約95pmol/cm2、至少約100pmol/cm2、至少約125pmol/cm2、至少約150pmol/cm2、至少約175pmol/cm2、至少約200pmol/cm2、至少約250pmol/cm2、至少約300pmol/cm2、至少約350pmol/cm2、至少約400pmol/cm2、至少約450pmol/cm2、至少約500pmol/cm2、至少約550pmol/cm2、至少約600pmol/cm2、至少約650pmol/cm2、至少約700pmol/cm2、至少約750pmol/cm2、至少約800pmol/cm2、至少約850pmol/cm2、至少約900pmol/cm2、至少約950pmol/cm2、至少約1000pmol/cm2或更高。已經(jīng)證明，納米顆粒表面上多核苷酸的密度調節(jié)與表面上多核苷酸和/或與納米顆粒本身的特異性多肽相互作用。在各種條件下，基于多核苷酸密度所引起的立體位阻，可以抑制一些多肽與結合于納米顆粒的多核苷酸的相互作用。在期望多核苷酸與多肽的相互作用另外被立體位阻排除的方面，降低納米顆粒表面上多核苷酸的密度，以允許多肽與多核苷酸相互作用。已經(jīng)證明，多核苷酸表面密度調節(jié)與納米顆粒結合的多核苷酸的穩(wěn)定性。在一實施方案中，提供了與納米顆粒結合的rna多核苷酸，其中rna多核苷酸的半衰期至少基本上與不與納米顆粒結合的相同rna多核苷酸的半衰期相同。在其他實施方案中，與納米顆粒結合的rna多核苷酸的半衰期比不與納米顆粒結合的相同rna多核苷酸的半衰期長約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％，是不與納米顆粒結合的相同rna多核苷酸的半衰期的約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍、約1000倍、約5000倍、約10,000倍、約50,000倍、約100,000倍、約200,000倍、約300,000倍、約400,000倍、約500,000倍、約600,000倍、約700,000倍、約800,000倍、約900,000倍、約1,000,000倍或更多。連接多核苷酸的方法考慮用于所述方法的多核苷酸包括通過任何方式結合于納米顆粒的多核苷酸。不管多核苷酸通過何種方式連接于納米顆粒，在各種方面中的連接通過5'連接、3'連接、有些內(nèi)連接類型或這些連接的任何組合實現(xiàn)。一方面，使納米顆粒、多核苷酸或兩者官能化，以便將多核苷酸連接于納米顆粒。使納米顆粒和多核苷酸官能化的方在本領域內(nèi)是已知的。例如，在3’末端或5’末端用烷烴硫醇官能化的多核苷酸易于連接于金納米顆粒。參閱whitesides,proceedingsoftheroberta.welchfoundation39thconferenceonchemicalresearchnanophasechemistry,houston,tex.,pages109-121(1995)。還參閱mucicetal.[chem.commun.555-557(1996)]，其描述了將3'硫醇dna連接于平坦的金表面的方法。烷烴硫醇方法也可以用于將寡核苷酸連接于其他金屬、半導體和磁膠體并連接于本文所述的其他類型的納米顆粒。將寡核苷酸連接于固體表面的其他官能團包括硫代磷酸酯基團(參閱例如美國專利5,472,881，用于有關寡核苷酸-硫代磷酸酯與金表面能的結合)、取代的烷基硅氧烷[(參閱例如burwell,chemicaltechnology,4,370-377(1974)和matteucciandcaruthers,j.am.chem.soc,103,3185-3191(1981)，用于寡核苷酸與硅石和玻璃表面的結合，以及參閱grabaretal.,[anal.chem.,67,735-743]，用于氨基烷基硅氧烷的結合和巰基烷基硅氧烷的相似結合]。具有5'硫代核苷或3’硫代核苷的多核苷酸可用于將寡核苷酸連接于固體表面。下述參考文獻描述了可用于將寡核苷酸連接于納米顆粒的其他方法：nuzzoetal.,j.am.chem.soc,109,2358(1987)(在金上的二硫化物)；allaraandnuzzo,langmuir,1,45(1985)(在鋁上的羧酸)；allaraandtompkins,j.colloidinterfacescl,49,410-421(1974)(在銅上的羧酸)；her,thechemistryofsilica,chapter6,(wiley1979)(在硅石上的羧酸)；timmonsandzisman,j.phys.chem.,69,984-990(1965)(在鉑上的羧酸)；soriagaandhubbard,j.am.chem.soc,104,3937(1982)(在鉑上的芳環(huán)化合物)；hubbard,acechem.res.,13,177(1980)(在鉑上的環(huán)丁砜、亞砜和其他官能化的溶劑)；hickmanetal.,j.am.chem.soc,111,7271(1989)(在鉑上的異腈)；maozandsagiv,langmuir,3,1045(1987)(在硅石上的硅烷)；maozandsagiv,langmuir,3,1034(1987)(在硅石上的硅烷)；wassermanetal.,langmuir,5,1074(1989)(在硅石上的硅烷)；eltekovaandeltekov,langmuir,3,951(1987)(在二氧化鈦和硅石上的芳族羧酸、醛、醇、和甲氧基)；leeetal.,j.phys.chem.,92,2597(1988)(在金屬上的剛性磷酸鹽)。美國專利申請第09/760,500號和第09/820,279號及國際申請第pct/us0l/01190號和第pct/us01/10071號描述了用環(huán)狀二硫化物官能化的寡核苷酸。在某些方面，環(huán)狀二硫化物在其環(huán)上具有5個或6個原子，包括2個硫原子。合適的環(huán)狀二硫化物可商購獲得，或通過已知方法合成。還考慮了用還原形式的環(huán)狀二硫化物官能化。用三個環(huán)狀二硫化物錨定基團官能化描述在pct/us2008/63441中，在此通過引用將其全文并入。在利用環(huán)狀二硫化物官能化的某些方面，將寡核苷酸通過一個或多個連接體連接于納米顆粒。在一實施方案中，連接體包含連接于環(huán)狀二硫化物的烴部分。合適的烴可商購獲得，并且連接于環(huán)狀二硫化物。一方面，烴部分是類固醇殘基。與利用烷烴硫醇或非環(huán)狀二硫化物作為連接體制備的組合物相比，利用包含連接于環(huán)狀二硫化物的類固醇殘基的連接體制備的寡核苷酸-納米顆粒組合物更穩(wěn)定，并且在某些情況下，發(fā)現(xiàn)寡核苷酸-納米顆粒組合物的穩(wěn)定性是其300倍。在某些實施方案中，環(huán)狀二硫化物的兩個硫原子足夠緊密地靠在一起，使得這兩個硫原子同時連接于納米顆粒。在其他方面，兩個硫原子彼此鄰近。在使用兩個硫原子的方面，烴部分足夠大，以便呈遞篩查納米顆粒表面的疏水表面。在其他方面，使寡核苷酸連接于表面的方法基于下述文獻所述的陳化方法：1999年6月25日提交的美國專利申請序列號09/344,667；2000年6月26日提交的序列號09/603,830；2001年1月12日提交的序列號09/760,500；2001年3月28日提交的序列號no.09/820,279；2001年8月10日提交的序列號09/927,777；和1997年7月21日提交的國際申請第pct/us97/12783號；2000年6月26日提交的pct/us00/17507；2001年1月12日提交的pct/us0l/01190；2001年3月28日提交的pct/us0l/10071，上述文獻的公開通過引用全文并入。陳化方法提供了穩(wěn)定性和選擇性增強的納米顆粒-寡核苷酸組合物。一方面，所述方法包括提供寡核苷酸，所述寡核苷酸具有與其共價結合的部分，所述部分包含可以與納米顆粒結合的官能團。所述部分和官能團是允許寡核苷酸與納米顆粒結合(即通過化學吸附或共價結合)的部分或官能團。例如，具有共價結合于其5’或3’末端的烷烴硫醇、烷烴二硫化物或環(huán)狀二硫化物的寡核苷酸將所述寡核苷酸結合于多種納米顆粒，包括金納米顆粒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用“陳化”步驟所產(chǎn)生的組合物比無“陳化”步驟所產(chǎn)生的組合物穩(wěn)定得多。納米顆粒表面上寡核苷酸密度的增加通過“陳化”步驟實現(xiàn)?！瓣惢辈襟E所實現(xiàn)的表面密度會取決于納米顆粒的大小和類型以及寡核苷酸的長度、序列和濃度。可以根據(jù)經(jīng)驗確定足以使納米顆粒穩(wěn)定的表面密度和對于期望的納米顆粒和寡核苷酸的組合獲得所述密度所需的條件。通常，至少2picomole/cm2的表面密度足以提供穩(wěn)定的納米顆粒-寡核苷酸組合物。無論如何，如本文所公開的，考慮了各種寡核苷酸密度。在寡核苷酸與納米顆粒初始結合后，將“陳化”步驟并入官能化的納米顆粒的生產(chǎn)中。簡而言之，使寡核苷酸與納米顆粒在水中接觸足以允許至少一些所述寡核苷酸通過官能團與納米顆粒結合的時間。此類時間可以根據(jù)經(jīng)驗確定。在一方面，考慮了約12-24小時的時間。用于寡核苷酸結合的其他合適的條件也可以根據(jù)經(jīng)驗確定。例如，考慮了約10-20nm納米顆粒的濃度和在室溫下孵育。接下來，將至少一種鹽添加到水中，以便形成鹽溶液。所述鹽是任何水溶性鹽，包括例如但不限于氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、氯化銨、乙酸鈉、乙酸銨或這些鹽中兩種或多種的組合，或這些鹽中之一的磷酸緩沖液。以濃縮溶液或可選地以固體的方式添加鹽。在各種實施方案中，一次添加全部的鹽，或者隨時間逐漸添加鹽?！半S時間逐漸”表示以至少兩部分、以被一段時間隔開的間隔添加鹽。合適的時間間隔可以根據(jù)經(jīng)驗確定。鹽溶液的離子強度必須足以至少部分地克服寡核苷酸彼此間的靜電排斥，和帶負電荷的寡核苷酸對帶正電荷的納米顆粒的靜電吸引或帶負電荷的寡核苷酸與帶負電荷的納米顆粒的靜電排斥。通過隨時間逐漸添加鹽降低靜電吸引和排斥，在納米顆粒上產(chǎn)生寡核苷酸的最高表面密度。對于每種鹽或鹽的組合，可以根據(jù)經(jīng)驗確定合適的離子強度。在一方面，所利用的氯化鈉的終濃度在磷酸緩沖液中為0.01m至約1.0m，同時隨時間逐漸增加氯化鈉的濃度。在另一方面，所利用的氯化鈉的終濃度為約0.01m至約0.5m或約0.1m至約0.3m，同時隨時間逐漸增加氯化鈉的濃度。在添加鹽之后，使寡核苷酸和納米顆粒在鹽溶液中孵育一段時間，以允許其他寡核苷酸與納米顆粒結合以產(chǎn)生穩(wěn)定的納米顆粒-寡核苷酸組合物。納米顆粒上寡核苷酸密度的增加使組合物穩(wěn)定，本文已對此做了描述。該孵育的時間可根據(jù)經(jīng)驗確定。作為實例，在一方面，考慮了約24-28的總孵育時間，其中在該總時間內(nèi)逐漸增加鹽濃度。在鹽溶液中孵育的該第二時段在本文中稱為“陳化”步驟。用于該“陳化”步驟的其他合適的條件也可以根據(jù)經(jīng)驗確定。作為實例，在室溫下和ph7.0孵育來進行陳化步驟。利用“陳化”所產(chǎn)生的組合物通常比無“陳化”步驟所產(chǎn)生的組合物穩(wěn)定得多。如上文所指出的，該穩(wěn)定性的增加是由于納米顆粒表面上寡核苷酸的密度增加導致的，密度增加可通過“陳化”步驟實現(xiàn)。通過“陳化”步驟所獲得的表面密度將取決于納米顆粒的大小和類型以及寡核苷酸的長度、序列和濃度。如本文所用，“穩(wěn)定”表示，在組合物制備后至少6個月的時期內(nèi)，大多數(shù)核苷酸保持與納米顆粒連接，且在檢測核酸的方法和納米加工的方法所經(jīng)歷的標準條件下，寡核苷酸能與核酸和寡核苷酸靶標雜交。多核苷酸本文所用術語“核苷酸”和其復數(shù)可以與本文所討論的或者本領域中以其他方式所知的修飾形式互換。在某些情況下，本領域使用“核堿基”，其包括天然存在的核苷酸以及可以聚合的核苷酸的修飾物。因此核苷酸或核堿基表示天然存在的核堿基腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)，以及非天然存在的核堿基，如黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-n6-甲基腺嘌呤、7-去氮雜黃嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、n4,n4-橋亞乙基胞嘧啶、n',n'-橋亞乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mc)、5-(c3-c6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌甙，以及benneretal.,美國專利5,432,272和susanm.freierandkarl-heinzaltmann,1997,nucleicacidsresearch,vol.25:pp4429-4443所述的“非天然存在”的核堿基。術語“核堿基”不但包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，而且還包括其雜環(huán)類似物和互變異構體。其他天然和非天然存在的核堿基包括以下文獻所公開的核堿基：美國專利3,687,808(merigan,etal.)；chapter15bysanghvi,inantisenseresearchandapplication,ed.s.t.crookeandb.lebleu,crcpress,1993；englischetal.,1991,angewandtechemie,internationaledition,30:613-722(特別是參閱622和623頁，以及theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering,j.i.kroschwitzed.,johnwiley&sons,1990,pages858-859,cook,anti-cancerdrugdesign1991,6,585-607，上述每篇文獻在此通過引用全文并入)。在各種方面，多核苷酸也包括一個或多個“核苷堿基”或“堿基單元”，其包括諸如雜環(huán)化合物的化合物，所述化合物的作用如同包括某些“通用堿基”在內(nèi)的核堿基，所述通用堿基在最經(jīng)典的意義看來不是核苷堿基但是發(fā)揮核苷堿基的作用。通用堿基包括3-硝基吡咯、任選地取代的吲哚(如5-硝基吲哚)以及任選地取代的次黃嘌呤。其他期望的通用堿基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本領域已知的通用堿基。多核苷酸也可以包括修飾的核堿基?！靶揎椀膲A基”在本領域內(nèi)應當理解為是能與天然堿基(如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配對和/或能與非天然存在的堿基配對的堿基。示例性的修飾的堿基描述于ep1072679和wo97/12896中，兩者的公開通過引用并入本文。修飾的堿基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶堿基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代脲嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代特別是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-f-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤和7-去氮雜腺嘌呤和3-去氮雜鳥嘌呤和3-去氮雜腺嘌呤。其他修飾的堿基包括三環(huán)嘧啶，如吩噁嗪胞苷(lh-嘧啶[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(lh-嘧啶[5,4-b][l,4]苯并噻嗪-2(3h)-酮)；g形夾具(g-clamp)如取代的吩噁嗪胞苷(如9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶[5,4-b][l,4]苯并噁唑-2(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶[3',2':4,5]吡咯[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修飾的堿基也可以包括這樣的堿基：其中，嘌呤或嘧啶堿基被其他雜環(huán)取代，如7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、2-氨基嘧啶和2-吡啶酮。其他核堿基包括：美國專利3,687,808所公開的核堿基、公開于theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering,pages858-859,kroschwitz,j.l,ed.johnwiley&sons,1990的核堿基，公開于englischetal.,1991,angewandtechemie,internationaledition,30:613的核堿基，以及sanghvi,y.s.,chapter15,antisenseresearchandapplications,pages289-302,crooke,s.t.andlebleu,b.,ed.,crcpress,1993公開的核堿基。這些堿基中有某些可用于增加結合親和性，并包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和n-2、n-6和o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)證明，5-甲基胞嘧啶取代使核酸雙鏈體的穩(wěn)定性增加0.6-1.2℃，并且在某些方面，與2'-o-甲氧基乙基糖修飾物組合。參閱u.s.pat.nos.3,687,808、u.s.pat.nos.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，上述專利公開通過引用并入本文。制備預定序列的多核苷酸的方法，是眾所周知的。參閱例如sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual(2nded.1989)andf.eckstein(ed.)oligonucleotidesandanalogues,1sted.(oxforduniversitypress,newyork,1991)。對于多核糖核苷酸和多脫氧核糖核苷酸兩者而言，優(yōu)選固相合成方法(合成dna的眾所周知的方法可用于合成rna)。多核糖核苷酸也可以酶促制備。也可以將非天然存在的核堿基并入多核苷酸中。參閱例如美國專利7,223,833；katz,j.am.chem.soc,74:2238(1951)；yamane,etal.,j.am.chem.soc,83:2599(1961)；kosturko,etal.,biochemistry,13:3949(1974)；thomas,j.am.chem.soc,76:6032(1954)；zhang,etal.,j.am.chem.soc,127:74-75(2005)；和zimmermann,etal.,j.am.chem.soc,124:13684-13685(2002)。所提供的用多核苷酸或其修飾形式官能化的納米顆粒通常包含長度為約5個核苷酸至約100個核苷酸的多核苷酸。更具體而言，納米顆粒用多核苷酸官能化，所述多核苷酸的長度為約5至約90個核苷酸、約5至約80個核苷酸、約5至約70個核苷酸、約5至約60個核苷酸、約5至約50個核苷酸、約5至約45個核苷酸、約5至約40個核苷酸、約5至約35個核苷酸、約5至約30個核苷酸、約5至約25個核苷酸、約5至約20個核苷酸、約5至約15個核苷酸、約5至約10個核苷酸，和長度位于具體公開的大小至能使多核苷酸實現(xiàn)期望結果的長度之間的全部多核苷酸。因此考慮了長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個核苷酸的多核苷酸?？紤]用于連接于納米顆粒的多核苷酸包括調節(jié)靶多核苷酸所表達的具有產(chǎn)物表達的多核苷酸。因此，考慮了與靶多核苷酸雜交并啟動rnase活性(例如rnaseh)的rna多核苷酸、與雙鏈多核苷酸雜交并抑制轉錄的形成三螺旋的多核苷酸以及與靶多核苷酸雜交并抑制翻譯的核酶。在各種方面，如果靶向特定mrna，則單個納米顆粒-結合劑組合物能與多個拷貝的相同轉錄物結合。在一方面，提供了用相同多核苷酸官能化的納米顆粒，即每個多核苷酸具有相同的長度和相同的序列。在其他方面，用兩個或多個多核苷酸使納米顆粒官能化，所述多核苷酸是不同的，即至少一個連接的多核苷酸與至少另一個連接的多核苷酸的不同在于，其具有不同的長度和/或不同的序列。在使不同的多核苷酸連接于納米顆粒的方面，這些不同的多核苷酸與相同的單個靶多核苷酸結合，但是在不同的位置或不同的底物位點與編碼不同的基因產(chǎn)物的不同的靶多核苷酸結合。因此，在各種方面，單個納米顆粒-結合劑組合物靶向多個基因產(chǎn)物。多核苷酸因此是靶標特異性多核苷酸，根據(jù)需要，是在靶多核苷酸的一個或多個特異性區(qū)域，還是在所述靶多核苷酸的全長中實現(xiàn)期望的具有表達的抑制水平。多核苷酸特征本公開在各種實施方案中提供了用于基因調節(jié)的共價rna-納米顆粒組合物。小干擾rnas是雙鏈rna試劑，其與靶rna(通常是信使rna(mrna))的一部分具有互補性(即能與之雜交)。通常，這類互補性為100％，如果需要，可以小于100％，如約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約70％、約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。例如，21個堿基中有19個堿基是堿基配對的。因此，應當理解，所述方法所用的寡核苷不必與代特異性雜交的期望的靶核酸100％互補。而且，寡核苷酸可在一個或多個片段內(nèi)彼此雜交，從而使得干擾或鄰近片段不參與雜交事件(如環(huán)狀結構或發(fā)夾結構)。利用blast程序(basiclocalalignmentsearchtools)和本領域已知的powerblast程序(altschuletcil,1990,j.moi.biol.,215:403-410；zhangandmadden,1997,genomeres.,7:649-656)，可以按常規(guī)方式測定任何給定寡核苷酸之間的互補性百分比。在某些方面，如果期望在各種等位基因變體間進行選擇，需要與靶基因的100％的互補性，以便從其他等位基因序列中有效辨別靶序列。當在等位基因靶標之間進行選擇時，長度的選擇也是重要的因素，因為其是與互補性百分比和區(qū)分等位基因差異的能力有關的其他因素。“雜交”表示根據(jù)本領域已知的watson-crickdna互補性、hoogstein結合或其他序列特異性結合規(guī)則，兩鏈或三鏈核酸通過氫鍵間的相互作用。雜交可以在本領域已知的不同嚴格條件下進行。術語“rna”兩條單獨鏈的雙鏈體以及單鏈、三鏈或四鏈結構。單鏈rna的實例是具有發(fā)夾環(huán)的rna。rna序列需要具有足夠的長度，以便使小干擾rna和靶rna通過互補堿基配對相互作用結合在一起。本文所公開的方法可用的rna可以具有不同的長度。本文所公開的rna包含雙鏈體的單鏈中與靶多核苷酸的序列充分互補的結構域，以便允許所述單鏈與所述靶多核苷酸在適當?shù)臈l件下雜交，并且雙鏈體的結構域與靶多核苷酸的序列的雜交產(chǎn)生了多肽識別的底物位點。該結構域的長度通常大于或等于10個核苷酸，并且具有與靶rna雜交的足夠長度；特別是10-100個核苷酸；更特別是10-80個核苷酸間的任何整數(shù)，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99以及100?！白銐蜷L度”表示大于或等于10個核苷酸的寡核苷酸，其具有的長度大小足以在期望的條件下提供預期的功能。rna可以在體外聚合，重組rna含有嵌合序列或這些基團的衍生物。在各種實施方案中，rna含有核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、合成的核苷酸或任何合適的組合，使得靶序列的表達受到抑制。送遞的rna可以停留在細胞質或細胞核內(nèi)?？蓪na送遞到細胞，以抑制內(nèi)源或外源核苷酸序列的表達，或影響不與細胞天然相關的特定生理特征?？蓪na送遞到細胞，以便產(chǎn)生治療性的細胞變化。送遞用于治療目的(改善動物健康的現(xiàn)有技術包括治療或預防疾病)的rna或其他遺傳材料稱為基因療法?？梢詫na直接原位送遞到生物體，或間接轉移到離體細胞，隨后再將所述離體細胞移植到生物體。進入細胞需要rna阻斷蛋白的產(chǎn)生或降低rna的量。本公開所考慮的多核苷酸序列在下文做了進一步描述。多核苷酸序列和雜交在某些方面，本公開提供了靶向具體核酸的方法?？梢园邢蛉魏晤愋偷暮怂?，并且所述方法可以用于例如基因表達的治療性調節(jié)(參閱例如pct/us2006/022325，所述文獻的公開通過引用并入本文)?？梢员槐景l(fā)明的方法靶向的核酸的實例包括但不限于基因(如與具體疾病有關的基因)、病毒rna或mrna、rna、單鏈核酸。靶核酸可以位于細胞、組織樣品或生物流體中，這在本領域內(nèi)也是已知的。參閱例如sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual(2nded.1989)和b.d.hamesands.j.higgins,eds.,geneprobes1(irlpress,newyork,1995)。術語“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”指從翻譯起始密碼子起在任一方向(5'或3')上包括連續(xù)核苷酸的一部分mrna或基因。同樣，術語“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”指從翻譯終止密碼子起在任一方向(5'或3')上包括連續(xù)核苷酸的一部分此類mrna或基因。因此，“起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或“翻譯終止密碼子區(qū)”)都是可被官能化的納米顆粒上的寡核苷酸有效靶向的區(qū)域。其他靶區(qū)域包括5'非翻譯區(qū)(5'utr)，其是從翻譯起始密碼子起在5’方向上的一部分mrna，包括mrna的5'帽位點和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上的相應序列)；和3'非翻譯區(qū)(3'utr)，其是從自翻譯終止密碼子起在3’方向上的一部分mrna，包括mrna的翻譯終止密碼子和3'末端之間的核苷酸(或基因上的相應核苷酸)。mrna的5'帽位點包含通過5'-5'三磷酸鍵連接于mrna的5’最遠端的殘基的n7甲基化的鳥苷。mrna的5'帽區(qū)被認為包括5'帽結構本身以及鄰近帽位點的前50個核苷酸。對于原核靶核酸而言，在各種方面，核酸是從基因組dna轉錄的rna。對于真核靶核酸而言，核酸是動物核酸、植物核酸、真菌核酸，包括酵母核酸在內(nèi)。如上，靶核酸是從基因組dna序列轉錄的rna。在某些方面，靶核酸是線粒體核酸。對于病毒靶核酸而言，核酸是病毒基因組rna，或從基因組dna轉錄的rna。所提供的抑制基因產(chǎn)物表達的方法包括：與缺少寡核苷酸官能化的納米顆粒情況下的基因產(chǎn)物表達相比，靶基因產(chǎn)物的表達受到至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％的抑制。換而言之，所提供的方法包括實質上導致以任何程度抑制靶基因產(chǎn)物表達的方法。抑制程度通過體液樣品或活檢樣品在體內(nèi)測定或通過本領域眾所周知的成像技術測定。可選地，在細胞培養(yǎng)測定中測定抑制的程度，這通常作為抑制程度的可預測的度量，其可以在體內(nèi)通過使用的具體類型的納米顆粒和具體寡核苷酸來預計。修飾的多核苷酸考慮了用于使納米顆粒官能化的修飾的多核苷酸，其中多核苷酸的核苷酸單元中一個或多個糖和/或一個或多個核苷酸間連接被“非天然存在”的基團取代。在一方面，該實施方案考慮了肽核酸(pna)。在pna化合物中，多核苷酸的糖-主鏈被含有酰胺的主鏈取代。參閱例如美國專利5,539,082；5,714,331和5,719,262，以及nielsenetal.,science,1991,254,1497-1500，上述文獻的公開通過引用并入本文。針對公開的多核苷酸所考慮的核苷酸和非天然核苷間的其他連接包括下述文獻所述的連接：美國專利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920；u.s.patentpublicationno.20040219565；internationalpatentpublicationnos.wo98/39352和wo99/14226；mesmaekeret.al.,currentopinioninstructuralbiology5:343-355(1995)以及susanm.freierandkarl-heinzaltmann,nucleicacidsresearch,25:4429-4443(1997)，上述文獻的公開通過引用并入本文。多核苷酸的具體實例包括含有修飾的主鏈或非天然核苷酸間連接的多核苷。具有修飾的主鏈的多核苷酸包括在主鏈上保留了磷原子的多核苷酸和在主鏈上不具有磷原子的多核苷酸。在核苷間主鏈上不具有磷原子的修飾的多核苷酸被認為在“多核苷酸”含義的范圍內(nèi)。含有磷原子的修飾的多核苷酸主鏈包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯，甲基和其他烷基磷酸酯，包括3'-亞烴基磷酸酯、5'-亞烴基磷酸酯和手性亞烴基磷酸酯，亞膦酸酯，氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯(3-aminophosphoramidate)和氨基烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)，硫代氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)，硫羰烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonate)，硫羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriester)，具有正常的3'-5'連接的硒基磷酸酯(selenophosphate)和硼烷基磷酸酯(boranophosphate)，這些的2'-5'連接的類似物，具有反極性的那些，其中一個或多個核苷酸間連接是3'到3'、5'到5'或2'到2'連接。還考慮了具有反極性的多核苷酸，其在最遠的3’核苷酸間連接處包含單個3'到3'連接，即脫堿基(abasic)的單個反核苷殘基(核苷酸遺失具有取代其的羥基)。還考慮了鹽、混合鹽和游離酸形式。教導了上述含磷連接的代表性美國專利包括u.s.pat.nos.3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697以及5,625,050，上述的公開通過引用并入本文。不包括磷原子的修飾的多核苷酸主鏈具有由以下形成的主鏈：短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接，混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接，或一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接。這些主鏈包括：具有嗎啉代連接的主鏈；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰基(formacetyl)和硫代甲?；?thioformacetyl)主鏈；亞甲基甲?；土虼柞；麈湥缓颂且阴；?riboacetyl)主鏈；含有烯烴的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基聯(lián)氨基主鏈；磺酸酯和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；和其他具有混合的n、o、s以及ch2組成部分的主鏈。仍然在其他實施方案中，多核苷酸具有硫代磷酸酯主鏈，且寡核苷具有雜原子主鏈，且包括美國專利5,489,677和5,602,240所述的-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和o-n(ch3)-ch2-ch2-。參閱例如美國專利5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269和5,677,439，上述專利的公開通過引用全文并入本文。在各種形式中，寡聚體中兩個連續(xù)單體間連接由選自以下的2-4個，優(yōu)選3個基團/原子組成：-ch2-、-o-、-s-、-nrh-、>c＝o、>c＝nrh、>c＝s、-si(r")2-、-so-、-s(o)2-、-p(o)2-、-po(bh3)-、-p(o,s)-、-p(s)2-、-po(r")-、-po(och3)-和-po(nhrh)-，其中rh選自氫和c1-4-烷基，且r"選自c1-6-烷基和苯基。這類連接的說明性實例是-ch2-ch2-ch2-、-ch2-co-ch2-、-ch2-choh-ch2-、-o-ch2-o-、-o-ch2-ch2-、-o-ch2-ch＝(當用作與隨后單體的連接時，包括r5)、-ch2-ch2-o-、-nrh-ch2-ch2-、-ch2-ch2-nrh-、-ch2-nrh-ch2-、-o-ch2-ch2-nrh-、-nrh-co-o-、-nrh-co-nrh-、-nrh-cs-nrh-、-nrh-c(＝nrh)-nrh-、-nrh-co-ch2-nrh-o-co-o-、-o-co-ch2-o-、-o-ch2-co-o-、-ch2-co-nrh-、-o-co-nrh-,-nrh-co-ch2-、-o-ch2-co-nrh-、-o-ch2-ch2-nrh-、-ch＝n-o-、-ch2-nrh-o-、-ch2-o-n＝(當用作與隨后單體的連接時包括r5)、-ch2-o-nrh-、-co-nrh-ch2-、-ch2-nrh-o-、-ch2-nrh-co-、-o-nrh-ch2-、-o-nrh、-o-ch2-s-、-s-ch2-o-、-ch2-ch2-s-、-o-ch2-ch2-s-、-s-ch2-ch＝(當用作與隨后單體的連接時包括r5)、-s-ch2-ch2-、-s-ch2-ch2-o-、-s-ch2-ch2-s-、-ch2-s-ch2-、-ch2-so-ch2-、-ch2-so2-ch2-、-o-so-o-、-o-s(o)2-o-、-o-s(o)2-ch2-、-o-s(o)2-nrh-、-nrh-s(o)2-ch2-、-o-s(o)2-ch2-、-o-p(o)2-o-、-o-p(o,s)-o-、-o-p(s)2-o-、-s-p(o)2-o-、-s-p(o,s)-o-、-s-p(s)2-o-、-o-p(o)2-s-、-o-p(o,s)-s-、-o-p(s)2-s-、-s-p(o)2-s-、-s-p(o,s)-s-、-s-p(s)2-s-、-o-po(r")-o-、-o-po(och3)-o-、-o-po(och2ch3)-o-、-o-po(och2ch2s-r)-o-、-o-po(bh3)-o-、-o-po(nhrn)-o-、-o-p(o)2-nrhh-、-nrh-p(o)2-o-、-o-p(o,nrh)-o-、-ch2-p(o)2-o-、-o-p(o)2-ch2-和-o-si(r")2-o-；其中，考慮了-ch2-co-nrh-、-ch2-nrh-o-、-s-ch2-o-、-o-p(o)2-o-o-p(-o,s)-o-、-o-p(s)2-o-、-nrhp(o)2-o-、-o-p(o,nrh)-o-、-o-po(r")-o-、-o-po(ch3)-o-以及-o-po(nhrn)-o-，如果rh選自氫和c1-4-烷基，且r"選自c1-6-烷基和苯基。其他說明性實例在下述文獻中給出：mesmaekeret.al.,1995,currentopinioninstructuralbiology,5:343-355和susanm.freierandkarl-heinzaltmann,1997,nucleicacidsresearch,vol25:pp4429-4443。其他修飾形式的多核苷酸還詳細描述于美國專利申請20040219565中，該申請的公開通過引用全文并入本文。修飾的多核苷酸也可以含有一個或多個取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2'位置包含下述之一：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的c1-c10烷基或c2-c10烯基和炔基。其他實施方案包括o[(ch2)no]mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2以及o(ch2)non[(ch2)nch3]2，其中n和m為1到約10。附加多核苷酸在2’位置包含下述之一：c1-c10低級烷基、取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基(polyalkylamino)、取代的甲硅烷基、rna切割基團、報道基團、嵌入物(intercalator)、改善多核苷酸藥物動力學特性的基團或改善多核苷酸藥效特性的基團，以及具有相似特性的其他取代基。在一方面，修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2'-o-ch2ch2och3，也稱為2'-o-(2-甲氧基乙基)或2'-moe)(martinetal.,1995,heiv.chim.acta,78:486-504)，即烷氧基烷氧基基團。其他修飾包括2'-二甲基氨氧基乙氧基(dimethylaminooxyethoxy)，即o(ch2)2on(ch3)2基團，也稱為2'-dmaoe，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領域也稱為2'-o-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-dmaeoe)，即2'-o-ch2-o-ch2-n(ch3)2。其他修飾還包括2'-甲氧基(2'-o-ch3)、2'-氨丙基(t-och2ch2ch2nh2)、2'-烯丙基(2'-ch2-ch＝ch2)、2'-o-烯丙基(2'-o-ch2-ch＝ch2)和2'-氟(2'-f)。2'修飾可以位于阿拉伯(向上)的位置或核糖(向下)的位置。在一方面，2'-阿拉伯修飾是2'-f。也可以在多核苷酸的其他位置進行相似的修飾，例如在3'末端核苷酸或2'-5'連接的多核苷酸上的糖的3'位置，和5'末端核苷酸的5'位置。多核苷酸也可以具有取代戊呋喃糖基糖的諸如環(huán)丁基部分的糖模擬物。參閱例如u.s.pat.nos.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，上述專利的公開通過引用全文并入本文。在一方面，糖的修飾包括鎖核酸(lna)，其中2'羥基連接于糖環(huán)的3'或4'碳原子。由此形成雙環(huán)糖部分。在某些方面連接時橋接2'氧原子和4'碳原子的亞甲基(-ch2-)n基團，其中n是1或2。lna和其制劑描述于wo98/39352和wo99/14226，上述文獻的公開通過引用并入本文。嵌合在給定化合物中并不需要所有位置都統(tǒng)一受到修飾，并且事實上，可以在單個化合物中，甚至在寡核苷酸內(nèi)的單個核苷處，并入多于1個的上述修飾。這些“嵌合”反義化合物通常含有至少一個包括上文所述修飾在內(nèi)的區(qū)域，而剩余的寡核苷酸保持“未修飾的”。在某些方面，修飾賦予對核酸酶降解的增加的抗性，增加的細胞攝取，增加的穩(wěn)定性和/或對靶核酸的結合親和性。在其他方面，修飾充當能切割rna:dna或rna:rna雜合體的酶的底物。作為實例，rnaseh是細胞內(nèi)切核酸酶，且切割rna:dna雙鏈體的rna鏈。因此，rnaseh的激活導致rna靶標的切割，從而極大地增強寡核苷酸介導的基因表達的抑制的效率。rna:rna雜合體的切割可以以相似的方式通過諸如rnasel的內(nèi)切核糖核酸酶的作用實現(xiàn)，rnasel切割細胞rna和病毒rna兩者。rna靶標的切割可以通過凝膠電泳，且如果需要和本領域已知的相關的核酸雜交技術以常規(guī)的方式檢測。如上文所述，嵌合化合物可以兩個或多個寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復合合結構形成。這類化合物在本領域中也稱為雜合體或gapmer。參閱例如美國專利5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922。上述專利的公開通過引用全文并入本文。實施例實施例1.無rnase的納米顆粒的制備利用公開的方法[frens,naturephysicalscience241:20-22(1973)]，制備檸檬酸鹽穩(wěn)定化的金納米顆粒(13nm)。合成后，用0.1％焦碳酸二乙酯(depc)將顆粒處理12小時，同時攪拌，然后于121℃高壓滅菌60分鐘。重要且相當令人驚訝的是，納米顆粒的光學和物理特性未受到該相對極端處理的影響，這可由uv分光術和透射電鏡tem分析(圖1)測量。隨后的配體官能化也未受到該處理的影響。利用rnasealert試劑盒(ambion)，對這些溶液中rnase活性的檢測表明，與對照或未處理的顆粒相比，沒有可檢測的rnase活性(圖2)。實施例2.無rnase的納米顆粒的修飾所得的無rnase的納米顆粒利用公開的程序[demersetal.,anal.chem.72:5535(2000)]，通過硫醇化的寡核苷酸進一步適當?shù)匦揎?。在無該預處理的情況下，不能實現(xiàn)隨后的用rna的官能化，推測是由于基于rna的表面加帽配體的快速降解所致。使雙鏈體雜交，并添加于無rnase的aunp，所述雙鏈體由27個堿基的rna鏈和以乙二醇間隔區(qū)和烷基硫醇終止的25個堿基的互補體組成，其中允許它們經(jīng)由硫醇-金鍵以化學的方式吸收。對于這項工作，將序列設計為靶向螢火蟲熒光素酶基因。利用tom-rna試劑(glenresearch)和mermade6(bioautomation)合成rna寡核苷酸，或以商業(yè)方式制備(integrateddnatechnologies)。使用top-rna盒(varian)，純化通過非商業(yè)來源合成的寡核苷酸。本研究所用的序列是：熒光素酶有義序列，5'-磷酸rcrgrarcrururcrgrurgrcrcrargrargrurcrurururcrgac間隔區(qū)18間隔區(qū)18-硫醇-3'(seqidno:1)，熒光素酶反義序列，5'-rgrurcrgrararargrarcrurcrurgrgrcrarcrgrarargrurcrgrura-3'(seqidno:2)，cy3熒光素酶，5'-cy3rgrurcrgrararargrarcrurcrurgrgrcrarcrgrarargrurcrgrura-3'(seqidno:3)，cy5熒光素酶，5'-cy5rgrurcrgrararargrarcrurcrurgrgrcrarcrgrarargrurcrgrura-3'(seqidno:4)，熒光素酶dabcyl，5'-rcrgrarcrururcrgrurgrcrcrargrargrurcrurururcrgac-dabcyl-3'(seqidno:5)，海腎(renilla)熒光素酶有義，5'-磷酸rgrgrargrgrarcrgrcrurcrcrargrarurgrarararurgrggt間隔區(qū)18間隔區(qū)18-硫醇-3'(seqidno:6)，海腎熒光素酶反義，5'rarcrcrcrarurururcrarurcrurgrgrargrcrgrurcrcrurg-3'(seqidno:7)。將預形成的硫醇化的rna雙鏈體(1000nm)與已經(jīng)用0.1m的nacl調整的無rnase的aunp溶液(10nm)一起孵育。將該混合物在濃度漸增的鹽溶液(從0.1到0.3mnacl)中陳化，并進行超聲處理，以增加表面上寡核糖核苷酸的覆蓋度。在添加雙鏈體24小時后，添加寡乙二醇(oligoethyleneglycol,oeg)(30μmol/ml的終濃度)，并防止顆粒在細胞培養(yǎng)物中沉淀(圖3)。在此濃度下添加不改變雙鏈體裝載。在官能化后，通過在4℃下離心(13,000rpm,20分鐘)，純化顆粒，并懸浮于無菌的磷酸緩沖鹽溶液(pbs:137mmnacl、10mm磷酸鹽、2.7mmkcl，ph7.4)中。重復該過程三次。為了防止由于離心過程引起的發(fā)熱所導致的雙鏈體去雜交，必須冷凍離心。為了測定dsrna裝載，用花菁3(cy3)熒光染料標記反義鏈。利用550nm下激發(fā)的jobinyvonfluorologfl3-22并測量1nm增長中從560到620nm的發(fā)射，來測量熒光，并與標準曲線進行比較。每個顆粒的雙鏈體的數(shù)量通過以下方式計算：利用25μm的氰化鉀氧化金，測量熒光反義鏈(表示形成的雙鏈體)的數(shù)量，并除以納米顆粒的濃度。每個rna金納米顆粒組合物在每個13nmaunp上含有33+4個rna雙鏈體。為了防止rna雙鏈體的去雜交，在添加雙鏈體之前，將aunp溶液的鹽濃度用nacl調整為0.1m。隨后，每次添加之后，使鹽濃度在12小時內(nèi)從0.1mnacl增加到0.3mnacl，以便增加納米顆粒表面上寡核苷酸的覆蓋度[hurstetal.,analchem78:8313(2006)]。為了產(chǎn)生更穩(wěn)定的組合物，用30μmol/ml寡乙烯基乙二醇硫醇(oeg-硫醇)作為其他表面鈍化配體處理rna官能化的顆粒(方案1)。發(fā)現(xiàn)在細胞培養(yǎng)條件下，oeg-硫醇鈍化使這些納米材料穩(wěn)定延長的時期。方案1.共價rna金納米顆粒組合物的制備。通過雜交，形成rna雙鏈體(含有雙鏈rna序列、乙烯基乙二醇間隔區(qū)和烷基硫醇基團)，隨后與無rnase的納米顆粒一起孵育。用寡乙烯基乙二醇硫醇(oeg-thiol)進一步鈍化增加細胞培養(yǎng)物的另外穩(wěn)定性。實施例3.rna-納米顆粒組合物的細胞攝取通過共焦顯微鏡，利用上文所制備的熒光(花菁5,cy5)組合物，研究組合物進入細胞的能力。向hela細胞的培養(yǎng)物添加rna-aunp。將細胞培養(yǎng)于玻璃蓋玻片上并以用熒光團標記的rna雙鏈體官能化的納米顆粒處理。處理6小時后，去除蓋玻片，用pbs洗滌，并固定于用pbs填充的封固于載玻片上的小室(chamber)中。通過掃描式共焦顯微鏡(zeiss510lsm)在63x放大率和633nmhene激光激發(fā)源下獲得所有圖像。6小時后，成像研究在全部hela細胞中都表現(xiàn)出熒光(圖4a)。有意思的是，注意到如同dnaau-nps，rnaau-nps不需要轉染劑進入細胞[giljohannetal.,nanolett.7:3818(2007)]。實際上，分析流式細胞術證實rna-aunp在>99％的細胞群中攝取(圖4b)。對于流式細胞術實驗，用熒光標記的(cy5)rna-納米顆粒組合物處理細胞。轉染后6個小時，使細胞胰蛋白酶化，以便從細胞培養(yǎng)孔中去除它們。利用在635nm下激發(fā)的dakocytomationcyan，進行流式細胞術。實施例4.rna-納米顆粒組合物的活性已經(jīng)確定rna-aunps通過細胞內(nèi)在化，因此接下來檢查rna-金納米顆粒組合物的細胞內(nèi)活性。利用轉染的熒光素酶質粒作為該模型系統(tǒng)的靶標，在hela細胞中進行蛋白抑制研究。將hela細胞(atcc)培養(yǎng)于具有10％熱失活的胎牛血清(fbs)的eagle極限必須培養(yǎng)基(emem)中，并維持在37℃、5％co2。將細胞接種于96孔板，并培養(yǎng)1天后，轉染含有螢火蟲熒光素酶和海腎基因的質粒(psicheck2,promega)。利用lipofectamine2000(invitrogen)，根據(jù)制造商的推薦，添加質料(每孔0.2μg)。在質粒引入后(24小時)，將此培養(yǎng)基用含有針對螢火蟲熒光素酶的官能化的rna-aunps(3nm納米顆粒濃度，≈100nmrna雙鏈體濃度)的血清減少的培養(yǎng)基替換。在處理1天后，細胞是約70％匯合的。在實驗結束時，計數(shù)處理細胞的重復孔，并利用guavaeasycytemini(guavatechnologies)，測量生存力。對于用rnaaunp處理的細胞而言，孵育后生存力>98％。為了比較，利用商業(yè)試劑lipofectamine2000，根據(jù)制造商推薦的實驗方案，轉染相同數(shù)量的熒光素酶rna雙鏈體(100nm)。在處理24小時后，用新鮮的emem替換培養(yǎng)基。利用dual-glo(promega)測定，根據(jù)制造商的實驗方案，在所示的天數(shù)后，測定細胞的熒光素酶表達。針對未受到轉染的對照，使熒光素酶表達定量歸一化，此定量歸一化表明納米顆粒試劑以劑量和試劑依賴性方式下調螢火蟲熒光素酶。對照(海腎)表達不受針對螢火蟲熒光素酶而設計的rna-aunp的影響，這表明抑制也是序列特異性的。有意思的是，三個用rna-aunp的獨立實驗的結果表現(xiàn)出的抑制均優(yōu)于處理4天后無rna的抑制(73+7％rna-aunps對33+2％無rna，圖5a)。熒光素酶持久穩(wěn)固的抑制是納米顆粒上rna穩(wěn)定化的結果。為了進行該測定，將cy3-標記的rna顆粒在96孔板、在90μl的pbs中稀釋至5nm的濃度。對于dabcyl標記的分子rna，濃度為150nm。將微量培養(yǎng)板置于維持在37℃的photontechnologyinternationalfluodiat70熒光平板讀數(shù)器中。在允許樣品平衡(10分鐘)后，添加10μl胎牛血清(fbs,geminibioproducts)，使樣品達到10％血清濃度。為了防止蒸發(fā)，用40μl礦物油覆蓋反應。每5分鐘，測量樣品的熒光(激發(fā)＝530nm，發(fā)射＝570nm)，達48小時。用取代fbs的10μlpbs的等分試樣處理的樣品，測定基線熒光。當觀察不到進一步的熒光增加時，將反應的終點測定為時間函數(shù)。一式三份，測量所有樣品。在這些穩(wěn)定性實驗中，在血清中孵育的組合物相對于它們的分子副本，表現(xiàn)出穩(wěn)定性極大地增強。例如，在存在10％血清的情況下，rna-aunp組合物的半衰期比分子rna雙鏈體的半衰期大6倍(816+59分鐘對133+30分鐘，圖5b)。這些數(shù)據(jù)表明，納米顆粒結合在細胞外環(huán)境中提供了顯著的免于降解的保護。由于rna的細胞外壽命對于它們的貯存、處理和潛在的治療應用而言非常重要，因此納米顆粒結合為功能rna配體的保護和送遞提供了顯著的優(yōu)勢。重要的是，這種增強的穩(wěn)定性不需要化學修飾來保護rna的完整性。實施例5.多核苷酸在納米顆粒表面上的定向可以控制固定于納米顆粒上的rna的定向。固定dicer酶的rna底物的策略允許控制對雙鏈體的接近?？梢岳貌煌墓潭ɑ瘜W品單硫醇或二硫醇以及不同長度的間隔區(qū)序列，來改變rna雙鏈體間的數(shù)量和距離，從而控制rna降解的速率。進行實驗，來確定dicer即在本系統(tǒng)中負責抑制rnai的rnase是否能識別并切割這些雙鏈體。在典型的酶促動力學實驗中，將rna-aunp(約5nm)與dicer(0.1u/ml終濃度)于37℃在反應緩沖液中混合。通過監(jiān)測每72秒熒光的增加達至少12小時，測量rna雙鏈體降解的速率。為了測定最大和最小熒光，使用不含有溶解金的酶(最小值)或含有3mm氰化鉀(kcn)的樣品(最大值)。kcn氧化金納米顆粒，從而排除熒光團標記的鏈的淬火。每個納米顆粒的雙鏈體的數(shù)量通過以下方式測定：熒光標記1條或兩條鏈，并將與給定濃度的rna官能化的納米顆粒有關的熒光與利用相同的鏈所產(chǎn)生的標準曲線進行比較。代表性裝載研究的結果示于表1中。納米顆粒的類型熒光團的位置雙鏈體的數(shù)量兩條鏈雜交鏈的5’末端91單鏈rna發(fā)夾發(fā)夾的5’末端34表1.利用兩種不同的rna裝載策略，測定rna雙鏈體裝載。綴合物在反義鏈(與共價連接于納米顆粒的有義鏈雜交)上包含熒光素，或在發(fā)夾系統(tǒng)的情況下，rna在5’末端用熒光素標記。將rnaseiii與dicer的活性進行比較，rnaseiii是已知降解dsrna的核糖核酸酶。rnaseiii和dicer都具有針對所檢測的兩種系統(tǒng)的活性，這可通過在一段時間內(nèi)高于背景(沒向反應中添加酶)的熒光的增加來測量。圖6表示在存在rnaseiii的情況下的活性。當每個系統(tǒng)都以與rnaseiii相似的方式用dicer處理時，隨時間觀察到相稱的熒光增加(圖7)。因此，與rnaseiii相比，高于背景的熒光中的絕對差異，對于dicer而言，更高。這些數(shù)據(jù)表明，當這些rna濃密地固定于納米顆粒表明上時，dicer比如rnaseiii的非特異性酶更特異性地識別所述rna。此外，對于固定與反義鏈相比的有義鏈，可以觀察定向偏愛(圖8)。在有義鏈化學連接于顆粒的情況下，觀察到更高的活性。在不受限于理論的情況下，這可以反映反義鏈在rnai機制中擔當引導鏈的能力。認為這種差異具有調節(jié)和調諧細胞中rnai反應的用途。序列表<110>mirkin,etal.<120>共價rna納米顆粒組合物<130>30938/28168<150>us-61/117,449<151>2008-11-24<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>磷酸酯<220><221>misc_structure<222>(25)..(25)<223>與硫醇基團結合的36碳間隔區(qū)<400>1cgacuucgugccagagucuuucgac25<210>2<211>27<212>rna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>2gucgaaagacucuggcacgaagucgua27<210>3<211>27<212>rna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>cy3<400>3gucgaaagacucuggcacgaagucgua27<210>4<211>27<212>rna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>cy5<400>4gucgaaagacucuggcacgaagucgua27<210>5<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>dabcyl<400>5cgacuucgugccagagucuuucgac25<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>磷酸酯<220><221>misc_structure<222>(25)..(25)<223>與硫醇基團結合的36碳間隔區(qū)<400>6ggaggacgcuccagaugaaaugggt25<210>7<211>24<212>rna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>7acccauuucaucuggagcguccug24當前第1頁12