本發(fā)明屬于醫(yī)療美容技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種基因重組人源膠原蛋白原液、敷料以及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
皮炎、濕疹、敏感皮膚及大部分微創(chuàng)美容術(shù)后患者的皮膚屏障功能均會(huì)出現(xiàn)不同程度的受損，因此需要建立新的皮膚屏障。
膠原蛋白是一種生物性高分子物質(zhì)，可以補(bǔ)充皮膚各層所需的營養(yǎng)，使皮膚中膠原活性增強(qiáng)，有滋潤(rùn)皮膚、延緩衰老、美容、消皺等功效。小分子膠原蛋白在滋潤(rùn)肌膚，提高皮膚營養(yǎng)吸收方面的作用更為顯著。膠原在修復(fù)皮膚屏障方面，如中度痤瘡、皮炎/濕疹等過敏性皮膚疾病、激光美容術(shù)后護(hù)理方面的作用也已得到證實(shí)，但天然膠原蛋白也存在免疫排斥反應(yīng)及病毒滅活風(fēng)險(xiǎn)。例如，申請(qǐng)?zhí)枮?01510641417.0、發(fā)明名稱為“一種膠原敷料貼制備方法及其應(yīng)用”的發(fā)明專利申請(qǐng)中公開了一種膠原蛋白敷料貼，其采用牛皮提取膠原并加工為敷料貼進(jìn)行皮膚護(hù)理，具有一定的免疫原性及過敏風(fēng)險(xiǎn)。
重組膠原蛋白的研究已經(jīng)取得很大突破，所得膠原蛋白活性高，具有良好的親水性及保水性，可以提高皮膚新陳代謝、無病毒殘留、無免疫原性、無內(nèi)毒素，仿皮膚角質(zhì)層設(shè)計(jì)，是純生物制劑，可長(zhǎng)期使用且安全。專利申請(qǐng)?zhí)枮?01510883490.9、發(fā)明名稱為“一種類人膠原蛋白粘膜修復(fù)凝膠”的發(fā)明專利申請(qǐng)中公開了一種可用于醫(yī)療、美容領(lǐng)域的粘膜修復(fù)凝膠，采用分子量為90kDa的重組類人膠原蛋白為主要原料，90KDa的膠原蛋白對(duì)于皮膚受損的修復(fù)及保濕具有一定效果，但難以被皮膚吸收，在美容領(lǐng)域的應(yīng)用效果不甚理想。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種重組人源膠原蛋白原液及其制備方法，以及包括該重組人源膠原蛋白原液的敷料及其制備方法。
一方面，本發(fā)明提供了一種重組人源膠原蛋白原液，按重量百分比計(jì)，包括：重組人源膠原蛋白0.05％-0.2％，保濕劑0.02％-7％，增稠劑0.1-1.0％，防腐劑0.1％-2％，和余量的水。
前述的重組人源膠原蛋白原液，所述重組人源膠原蛋白是由數(shù)均分子量為3kDa-20kDa的重組人源膠原蛋白和數(shù)均分子量為70kDa-140kDa的重組人源膠原蛋白優(yōu)選按照重量比1:1-5組成。
前述的重組人源膠原蛋白原液，所述重組人源膠原蛋白采用微生物發(fā)酵法獲得。
前述的重組人源膠原蛋白原液，所述保濕劑是透明質(zhì)酸鈉(優(yōu)選分子量是200kDa-400kDa)、甘油、神經(jīng)酰胺、NL-50中的任意一種或多種。
前述的重組人源膠原蛋白原液，所述增稠劑是羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、黃原膠、瓜爾豆膠中的任意一種或多種。
前述的重組人源膠原蛋白原液，所述防腐劑是山梨酸、苯甲酸鈉、乳酸鈉、尼泊金酯中的任意一種或多種。
前述的重組人源膠原蛋白原液，按重量百分比計(jì)，所述重組人源膠原蛋白原液包括：重組人源膠原蛋白0.1％-0.15％，保濕劑0.5％-3％，增稠劑0.1-0.5％，防腐劑0.2％-0.6％，和余量的水。
前述的重組人源膠原蛋白原液，按重量百分比計(jì)，所述重組人源膠原蛋白原液包括：重組膠原蛋白0.1％-0.15％，分子量是200kDa-400kDa的透明質(zhì)酸0.01％-1％，甘油0.2％-2％，羧甲基纖維素鈉0.1％-0.5％，乳酸鈉0.1％-0.3％，尼泊金酯0.1％-0.3％，和余量的水。
前述的重組人源膠原蛋白原液，所述重組人源膠原蛋白原液的pH值是4.5-6.5。
另一方面，本發(fā)明提供了前述的重組人源膠原蛋白原液的制備方法，包括如下步驟：
(1)將重組人源膠原蛋白溶解于純化水中得到相①；
(2)將保濕劑、增稠劑溶解于純化水中得到相②；
(3)將相①和相②混合并攪拌均勻，加入防腐劑，純化水將余量補(bǔ)足，加熱并攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH為4.5-6.5，得到重組膠原蛋白原液。
前述的制備方法，在步驟(2)中，將保濕劑、增稠劑加入純化水中，隨后加熱至40-80℃進(jìn)行溶解，待完全溶解后冷卻至室溫。
前述的制備方法，在步驟(3)中，加熱溫度是50-100℃。
另一方面，本發(fā)明提供了一種重組人源膠原蛋白敷料，包括重組人源膠原蛋白原液和載體；
其中，所述重組人源膠原蛋白原液是前述的重組人源膠原蛋白原液或者前述的制備方法制備的重組人源膠原蛋白原液。
前述的重組人源膠原蛋白敷料，所述重組人源膠原蛋白原液和所述載體被無菌封裝于鋁箔袋中。
前述的重組人源膠原蛋白敷料，所述載體是非織無紡布。
另一方面，本發(fā)明提供了前述的重組人源膠原蛋白敷料的制備方法，包括：將重組人源膠原蛋白原液裝入含有載體的鋁箔袋中，隨后封口，并低溫輻照滅菌；
其中，所述重組人源膠原蛋白原液是前述的重組人源膠原蛋白原液或者前述的制備方法制備的重組人源膠原蛋白原液。
前述的制備方法，所述低溫輻照滅菌的溫度是-20℃至-10℃、輻照劑量是5kGy-30kGy。
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液、敷料以及它們的制備方法具有如下有益效果：
(1)本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液以及敷料的有效性和安全性更高。
(2)本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液以及敷料的生物活性高、保濕效果好、可提高人體吸收、增加表皮修復(fù)速度、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。
附圖說明
圖1是對(duì)使用一個(gè)療程后志愿者的角質(zhì)層膜套蛋白基因、發(fā)揮皮膚屏障功能相關(guān)合成酶的表達(dá)及神經(jīng)酰胺合成酶的表達(dá)進(jìn)行mRNA差異檢測(cè)的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
為了充分了解本發(fā)明的目的、特征及功效，通過下述具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。本發(fā)明的工藝方法除下述內(nèi)容外，其余均采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或裝置。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種重組人源膠原蛋白原液，按重量百分比計(jì)，包括：重組人源膠原蛋白0.05％-0.2％，保濕劑0.02％-7％，增稠劑0.1-1.0％，防腐劑0.1％-2％，和余量的水。
重組人源膠原蛋白是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因重組技術(shù)在動(dòng)物、植物或者微生物表達(dá)體系中獲得的人源膠原蛋白。在本發(fā)明中，所述重組人源膠原蛋白是由數(shù)均分子量為3kDa至20kDa的重組人源膠原蛋白和數(shù)均分子量為70kDa至140kDa的重組人源膠原蛋白按照重量比1:(1-5)組成的重組人源膠原蛋白混合物。前述各種分子量的重組人源膠原蛋白是以基因工程的方法由微生物發(fā)酵獲得，例如，采用如下方法：構(gòu)建畢赤酵母工程菌，篩選高表達(dá)畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵結(jié)束后離心取上清液，用孔徑為0.22μm中空纖維微濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾，收集濾過液，再采用中空纖維超濾系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)分子量的蛋白進(jìn)行截留超濾、脫鹽濃縮，收集濃縮液，采用離子交換層析、洗脫等進(jìn)行膠原蛋白純化，膠原蛋白溶液經(jīng)0.22um膜過濾后凍干。具體可參考申請(qǐng)?zhí)枮?01610388271.8、名稱為“一種重組人源膠原蛋白及其編碼基因和制備方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)，該專利申請(qǐng)通過引用的方式整體并入本申請(qǐng)中。
保濕劑用于促進(jìn)皮膚保水、保油，以使皮膚具有更好的保濕、保油功能。醫(yī)療美容領(lǐng)域常用的保濕劑均可用于本發(fā)明中，例如，保濕劑可以是透明質(zhì)酸鈉(優(yōu)選分子量是200kDa-400kDa的透明質(zhì)酸鈉)、甘油、神經(jīng)酰胺、NL-50(即吡咯烷酮羧酸鈉，PCA-Na)中的任意一種或多種。
增稠劑屬于流變助劑，主要用于改進(jìn)和調(diào)節(jié)粘性。醫(yī)療美容領(lǐng)域常用的增稠劑均可用于本發(fā)明中，例如，增稠劑可以是羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、黃原膠、瓜爾豆膠中的任意一種或多種。
防腐劑主要用于抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖，以延長(zhǎng)物質(zhì)的保存時(shí)間，抑制物質(zhì)腐敗。常用的醫(yī)用防腐劑均可用于本發(fā)明中，例如，防腐劑可以是山梨酸、苯甲酸鈉、乳酸鈉、尼泊金酯中的任意一種或多種。
上述的保濕劑、增稠劑、防腐劑均可通過常規(guī)市購獲得。
本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液的pH值是4.5-6.5，一方面，能夠避免原液中出現(xiàn)沉淀物，另一方面，人體皮膚表面為弱酸性，原液pH值與人體皮膚表面pH值接近，更有利于皮膚的吸收與保護(hù)。
本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液采用不同分子量的膠原蛋白搭配使用，其中3kDa至20kDa的低分子量重組人源膠原蛋白具有吸收性強(qiáng)，改善皮膚細(xì)胞代謝，促進(jìn)皮膚修復(fù)、創(chuàng)面愈合等生物活性，70kDa至140kDa的高分子量重組人源膠原蛋白具有保濕、屏障保護(hù)、增強(qiáng)血液循環(huán)、抗菌消炎等功能，二者按照上述比例組合，即可保證產(chǎn)品較高的生物活性作用，較高的保濕效果，也可提高人體吸收，增加表皮修復(fù)速度，且其濕性環(huán)境更利于創(chuàng)面修復(fù)，減少瘢痕形成。并且，本發(fā)明中采用的各種分子量的重組人源膠原蛋白都是采用微生物發(fā)酵法，其免疫原性低、純度高、穩(wěn)定性和水溶性好。保濕劑能夠調(diào)節(jié)表皮膠質(zhì)形成細(xì)胞，調(diào)控膠原合成，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，本發(fā)明通過重組膠原蛋白與保濕劑的共同作用，有效調(diào)控膠原蛋白合成，減少瘢痕，提高皮膚修復(fù)效果；并且，通過加入增稠劑，與其它組分特別是不同大小的重組膠原蛋白協(xié)同作用，重組膠原大小分子優(yōu)良的親水性可以只添加極小量的增稠劑即可獲得理想的膚感舒適、使用方便的料液粘稠性狀；而防腐劑的加入，有效保證了各組分的最佳活性。上述這些組分的組合以及各組分的百分比范圍，都是發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)、付出創(chuàng)造性勞動(dòng)而確定的，上述組合以及百分比范圍使本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液具有上述的有效性和安全性。
在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液按重量百分比計(jì)包括：重組人源膠原蛋白0.1％-0.15％，保濕劑0.5％-3％，增稠劑0.1-0.5％，防腐劑0.2％-0.6％，和余量的水。
在一種特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液按重量百分比計(jì)包括：重組膠原蛋白0.1％-0.15％，分子量是200kDa-400kDa的透明質(zhì)酸0.01％-1％，甘油0.2％-2％，神經(jīng)酰胺0.1％-0.4％，羧甲基纖維素鈉0.1％-0.5％，乳酸鈉0.1％-0.3％，尼泊金酯0.1％-0.3％，和余量的水。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了上述重組人源膠原蛋白原液的制備方法，包括：
(1)按上述重量百分比將重組人源膠原蛋白溶解于純化水中得到相①；
(2)按上述重量百分比將保濕劑、增稠劑溶解于純化水中得到相②；
(3)將相①和相②混合并攪拌均勻，按上述重量百分比加入防腐劑，純化水將余量補(bǔ)足，加熱并攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH為4.5-6.5，得到重組膠原蛋白原液。
其中，在步驟(2)中，將保濕劑、增稠劑加入純化水中，隨后加熱至40-80℃進(jìn)行溶解，待完全溶解后冷卻至室溫；在步驟(3)中，加熱溫度是50-100℃。
本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液具有較高的生物活性、保濕效果、利于吸收且具有較好的皮膚修復(fù)功效，因此具有極高的醫(yī)療、美容領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，可以通過多種形式進(jìn)行使用。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種重組人源膠原蛋白敷料，包括上述的重組人源膠原蛋白原液和載體，其中，所述載體可以是醫(yī)療美容領(lǐng)域常用的任何載體，包括但不限于非織無紡布。在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組人源膠原蛋白敷料包括無菌封裝于鋁箔袋中的重組人源膠原蛋白原液和非織無紡布。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了上述重組人源膠原蛋白敷料的制備方法，包括將重組人源膠原蛋白原液裝入含有載體的鋁箔袋中，隨后封口，并低溫輻照滅菌。采用低溫輻照，既可以保證產(chǎn)品的無菌水平(10-6)，又可防止膠原結(jié)構(gòu)損壞或發(fā)生變性。優(yōu)選地，所述低溫輻照滅菌的溫度是-20℃至-10℃、輻照劑量是5kGy-30kGy。
本發(fā)明的重組人源膠原蛋白原液及由其制成的敷料可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、美容護(hù)理領(lǐng)域，主要針對(duì)皮炎、濕疹、敏感肌膚及光子嫩膚、激光美容、果酸活膚等術(shù)后皮膚屏障功能受損者。
實(shí)施例
下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。下列實(shí)施例中采用的重組人源膠原蛋白粉采用申請(qǐng)?zhí)枮?01610388271.8、名稱為“一種重組人源膠原蛋白及其編碼基因和制備方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)中公開的方法制備獲得。
實(shí)施例1
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白原液的組成如下(％表示重量百分比)：
重組人源膠原蛋白：0.12％，其中，70kDa的重組人源膠原蛋白與15kDa的重組人源膠原蛋白的重量比是1:1
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白原液的制備方法如下：
(1)在十萬級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)，將純化的重組人源膠原蛋白粉溶解于10ml純化水中為相①，其中加入分子量70kDa重組人源膠原蛋白0.06g，分子量15kDa重組人源膠原蛋白0.06g；
(2)將0.05g透明質(zhì)酸鈉，1.5g甘油，0.1g羧甲基纖維素、0.1g神經(jīng)酰胺溶解于50ml純化水中得到相②；
(3)將相①和相②混合并攪拌均勻，再次加入0.3g乳酸鈉、0.1g尼泊金甲酯并混勻，純化水將余量補(bǔ)足100g，加熱80℃攪拌均勻并調(diào)節(jié)pH為6.0，得到重組人源膠原蛋白原液。
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白敷料是將25ml上述重組人源膠原蛋白原液灌裝于含有非織無紡布的鋁箔袋中構(gòu)成。制備方法是：將25ml上述重組人源膠原蛋白原液灌裝于含有非織無紡布的鋁箔袋中，封口，于-20℃冷凍處理4h，15kGy輻照滅菌，獲得基因重組膠原蛋白敷料。
實(shí)施例2
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白原液的組成如下(％表示重量百分比)：
重組人源膠原蛋白：0.15％，其中，70kDa的重組人源膠原蛋白與15kDa的重組人源膠原蛋白的重量比是2:1
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白原液的制備方法如下：
(1)在十萬級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)，將純化的重組人源膠原蛋白粉溶解于10ml純化水中為相①，其中加入分子量70kDa重組人源膠原蛋白0.1g，分子量15kDa重組人源膠原蛋白0.05g；
(2)將0.12g透明質(zhì)酸鈉，2.5g甘油，0.2g羧甲基纖維素溶解于50ml純化水中得到相②；
(3)將相①和相②混合并攪拌均勻，加入0.3g苯甲酸鈉并混勻，純化水將余量補(bǔ)足100g，加熱70℃攪拌均勻并調(diào)節(jié)pH為6.0，得到重組人源膠原蛋白原液。
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白敷料是將23ml上述重組人源膠原蛋白原液灌裝于含有非織無紡布的鋁箔袋中構(gòu)成。制備方法是：將23ml上述重組人源膠原蛋白原液灌裝于含有非織無紡布的鋁箔袋中，封口，于-10℃冷凍處理8h，20kGy輻照滅菌，獲得基因重組膠原蛋白敷料。
實(shí)施例3
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白原液的組成如下(％表示重量百分比)：
重組人源膠原蛋白：0.16％，其中，70kDa的重組人源膠原蛋白與5kDa的重組人源膠原蛋白的重量比是3:1
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白原液的制備方法如下：
(1)在十萬級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)，將純化的重組人源膠原蛋白粉溶解于10ml純化水中為相①，其中加入分子量70kDa重組人源膠原蛋白0.12g，分子量5kDa重組人源膠原蛋白0.04g；
(2)將0.2g透明質(zhì)酸鈉，2.2g甘油，0.3g黃原膠溶解于50ml純化水中得到相②；
(3)將相①和相②混合并攪拌均勻，加入0.3g苯甲酸鈉、0.05g乳酸鈉并混勻，純化水將余量補(bǔ)足100g，加熱85℃攪拌均勻并調(diào)節(jié)pH為6.0，得到重組人源膠原蛋白原液。
本實(shí)施例的重組人源膠原蛋白敷料是將25ml上述重組人源膠原蛋白原液灌裝于含有非織無紡布的鋁箔袋中構(gòu)成。制備方法是：將25ml上述重組人源膠原蛋白原液灌裝于含有非織無紡布的鋁箔袋中，封口，于-15℃冷凍處理5h，25kGy輻照滅菌，獲得基因重組膠原蛋白敷料。
實(shí)施例4-8
實(shí)施例4-8的重組人源膠原蛋白原液的組成如表1所示，其中的％表示重量百分比，其中實(shí)施例4和5中的重組人源膠原蛋白是100kDa的重組人源膠原蛋白與20kDa的重組人源膠原蛋白按重量比是1:1組成，實(shí)施例6和7中的重組人源膠原蛋白是140kDa的重組人源膠原蛋白與20kDa的重組人源膠原蛋白按重量比是5:1組成，實(shí)施例8中的重組人源膠原蛋白是100kDa的重組人源膠原蛋白與20kDa的重組人源膠原蛋白按重量比是3:1組成。實(shí)施例4-8的重組人源膠原蛋白原液的制備方法是按照表1中各組分的含量重復(fù)實(shí)施例1的方法。
實(shí)施例4-8的重組人源膠原蛋白敷料是將25ml各實(shí)施例中制備的重組人源膠原蛋白原液分別灌裝于含有非織無紡布的鋁箔袋中構(gòu)成。實(shí)施例4-8的重組人源膠原蛋白敷料的制備方法與實(shí)施例1相同。
表1
應(yīng)用實(shí)施例1
選取28名志愿者，22-30歲，混合性膚質(zhì)，痘史12年，T區(qū)毛孔大，皮膚粗糙，發(fā)紅嚴(yán)重，有少量痘痘。左側(cè)面部使用實(shí)施例1的敷料作為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)面部采用市購?fù)惍a(chǎn)品作為對(duì)照組，對(duì)照組采用的敷料的組成是：(膠原蛋白94KDa 0.18wt％、山梨酸1.8wt％、苯甲酸鈉0.8wt％、醫(yī)用矯味劑2.1wt％，水補(bǔ)足100％)。兩側(cè)分別使用敷料貼7貼，其中第1、2、3、4貼每天連續(xù)使用，第5、6、7貼間隔兩天使用。
(1)保濕性和血紅素變化
固定每天早上11點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試，收集使用后面部水分含量及血紅素含量數(shù)據(jù)。
測(cè)試結(jié)果如表2所示：
表2
由上表可知，實(shí)驗(yàn)組水分含量持續(xù)穩(wěn)定升高，優(yōu)于對(duì)照組，差異明顯。對(duì)照組血紅素與實(shí)驗(yàn)組均下降，實(shí)驗(yàn)組更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明采用本發(fā)明配方制備敷料，作用顯著，功效明顯。
(2)粘度與舒適性
采用品氏粘度計(jì)分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組敷料中料液進(jìn)行粘度檢測(cè)，結(jié)果為：實(shí)驗(yàn)組：50～120mm2/s；對(duì)照組20～50mm2/s。
同時(shí)受試者反應(yīng)對(duì)照組敷料貼料液較稀，敷貼過程中容易流下，且料液不足，20min后面膜布較干，敷貼期間需要補(bǔ)液，不便使用。本發(fā)明制備敷料粘度合適，舒適感強(qiáng)，膚感較好，且用后未出現(xiàn)過敏或其它不良癥狀。這得益于本發(fā)明重組蛋白分子大小不同，與增稠劑起協(xié)同作用，增加膚感和使用性；并使用特殊低溫輻照技術(shù)保證最終產(chǎn)品的滅菌，既不破壞增稠體系，也保證了產(chǎn)品安全性。
(3)促進(jìn)新陳代謝作用
分別對(duì)使用一個(gè)療程后志愿者的角質(zhì)層膜套蛋白基因、發(fā)揮皮膚屏障功能相關(guān)合成酶的表達(dá)及神經(jīng)酰胺合成酶的表達(dá)等進(jìn)行mRNA差異檢測(cè)，以間接反應(yīng)蛋白合成的變化，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，實(shí)驗(yàn)組各基因表達(dá)量與對(duì)照組相比均增加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
(4)不良反應(yīng)
實(shí)驗(yàn)組使用過程中未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)；對(duì)照組有1例1級(jí)不良反應(yīng)(瘙癢、紅斑)，1例2級(jí)不良反應(yīng)(水腫、局部皮損)，停止使用后消退，因此，本發(fā)明的敷料在安全性、持續(xù)使用性方面優(yōu)于現(xiàn)有產(chǎn)品及技術(shù)，可放心使用。
應(yīng)用實(shí)施例2
對(duì)實(shí)施例1的敷料進(jìn)行多項(xiàng)生物相容性評(píng)價(jià)，檢測(cè)結(jié)果如下：
(1)遲發(fā)性致敏反應(yīng)
按GB/T 16886.10-2005規(guī)定的最大劑量致敏方法進(jìn)行檢驗(yàn)，具體為：取白化豚鼠30只，分成3組，陽性對(duì)照組(10只)，實(shí)驗(yàn)組(10只)、陰性對(duì)照組(10只)，開始適應(yīng)環(huán)境，為時(shí)一周。試驗(yàn)前一天，在胸廓的背前區(qū)備皮(4cm×6cm)。在豚鼠背部去毛，消毒后于肩胛骨內(nèi)側(cè)從頭向尾成對(duì)注射6個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.1mL；其中一對(duì)注射完全弗氏佐劑與生理鹽水(1:1)混合液；另一對(duì)注射待檢物(1:9的浸提液)與完全弗氏佐劑的等體積混合物，陰性對(duì)照組則注射生理鹽水，陽性對(duì)照組注射巰基苯并噻唑；最后一對(duì)注射前2種注射液的等體積混合物。之后進(jìn)行局部誘導(dǎo)和激發(fā)，并于激發(fā)后24h和48h觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物激發(fā)部位皮膚情況，在自然光或全光譜光線下觀察皮膚反應(yīng)。
Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：
表3
由表3結(jié)果可知，根據(jù)Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，本產(chǎn)品的致敏性與陰性對(duì)照評(píng)分均為0，陽性對(duì)照均有中、重度的致敏反應(yīng)。因此，本發(fā)明的產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果為無致敏反應(yīng)。
(2)皮膚刺激
取本品按GB/T 16886.10-2005規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體為：取12只新西蘭兔，體重2.0kg±0.2kg，3-4個(gè)月齡。分籠飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫21±2℃，相對(duì)濕度40-70％，每天光照12小時(shí)，自由飲用自來水。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)三天。并在試驗(yàn)前24h將動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)背毛除去(2.5cm×2.5cm)。樣品采用生理鹽水進(jìn)行浸提(1:9)，分為實(shí)驗(yàn)部位和陽性觀察部位(各2cm×2cm)。通過單次接觸、多次涂抹給藥在同一部位行皮膚刺激性試驗(yàn)，確保每次給藥時(shí)間相同，貼敷時(shí)間一般不超過4周。在自然光線下觀察皮膚反應(yīng)(紅斑和水腫)，判定皮膚刺激強(qiáng)度。
積分標(biāo)準(zhǔn)：
表4
由表4結(jié)果可知，本發(fā)明的產(chǎn)品與陽性對(duì)照的評(píng)分差值小于1，且平均積分小于0.5，根據(jù)GB16886.第十部分對(duì)刺激的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，判斷本發(fā)明產(chǎn)品無刺激性。
(3)細(xì)胞毒性
取本品按照GB/T 16886.5-2003中規(guī)定的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體為：將傳代48-72h生長(zhǎng)旺盛的L929細(xì)胞胰酶消化收集，用高糖DMEM培養(yǎng)基配置成1×104/ml的細(xì)胞懸液，接種至96孔板中，每孔200μl。樣品按照1:9比例浸提，浸提介質(zhì)為含10％新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，浸提溫度為37℃，浸提時(shí)間為24h。將實(shí)驗(yàn)組、空白組及陽性對(duì)照組分別加入細(xì)胞懸液中，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。在培養(yǎng)第5d時(shí)，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度值(OD值)，用空白調(diào)零孔OD值調(diào)零，取平均值并記錄。根據(jù)各組的吸光度均值計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增值率。
細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
表5
根據(jù)細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合表5的結(jié)果可知，細(xì)胞毒性均為1級(jí)，說明材料安全性高，無明顯細(xì)胞毒性。
(4)無菌檢測(cè)
對(duì)樣品敷料進(jìn)行無菌檢測(cè)，具體為無菌拆開包裝，分別接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中，按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)三部附錄Ⅻ A規(guī)定的方法測(cè)定，結(jié)果顯示無菌。
(5)重金屬檢測(cè)
對(duì)樣品敷料進(jìn)行重金屬檢測(cè)，具體為稱取樣品1.0g，置已熾灼至恒重的坩堝中，精密稱定，于600℃以下緩緩熾灼至完全炭化，放冷后加硫酸0.5mL，于600℃下再次橫重，收取殘?jiān)?，按《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄Ⅷ H第二法規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果<10μg/g。
由以上檢測(cè)結(jié)果可知，本發(fā)明制備產(chǎn)品符合參照醫(yī)療器械管理的安全性要求，可應(yīng)用于醫(yī)療美容領(lǐng)域。
本發(fā)明在上文中已以優(yōu)選實(shí)施例公開，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于描繪本發(fā)明，而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)注意的是，凡是與這些實(shí)施例等效的變化與置換，均應(yīng)設(shè)為涵蓋于本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求書中所界定的范圍為準(zhǔn)。