一種新型類人膠原蛋白止血敷料的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型富集鈣、鋅、銅、鐵元素的類人膠原蛋白止血敷料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)的一種纖維蛋白，富含于皮膚、筋腱、骨骼中，具有良好的生物相容性，常被用作重要的生物醫(yī)用材料原料，可作為吸收性創(chuàng)面止血材料，常利用膠原蛋白被交聯(lián)后的多孔結(jié)構(gòu)吸收血液膨脹，形成凝血的網(wǎng)架，封閉血管裂口或者創(chuàng)面，并激活血小板，達(dá)到止血的目的。目前，對(duì)于可吸收性膠原蛋白類創(chuàng)面止血材料，因膠原蛋白來源于動(dòng)物皮、筋腱等，對(duì)人體而言屬于一種異源物，可引起過敏等不良反應(yīng)，表現(xiàn)為發(fā)熱、嗜酸粒細(xì)胞增多、引起傷口的感染;止血速度較慢，對(duì)血小板等止血成分的牽拉能力和創(chuàng)面修復(fù)能力均不好。此外，異源型動(dòng)物膠原蛋白還存在一些潛在的動(dòng)物攜帶病原的風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]鈣離子是人體內(nèi)最重要的宏量元素之一，廣泛分布于體內(nèi)各組織器官之中，維系著所有細(xì)胞的正常生理功能。鈣離子不僅參與了肌肉收縮、骨骼形成、神經(jīng)傳導(dǎo)，還有一個(gè)非常重要的作用就鈣離子參與了血液凝固和能夠促進(jìn)創(chuàng)傷面的修復(fù)。凝血過程主要分為三個(gè)階段:凝血酶原激活物的形成、凝血酶原的激活和纖維蛋白的形成。作為凝血因子IV的鈣離子，參與了上述凝血過程的三個(gè)階段。研究表明，鈣離子能從血液中“捕獲”并活化一種關(guān)鍵凝血蛋白質(zhì)一凝血酶，必須在一定濃度的鈣離子和纖維原蛋白存在時(shí)凝血過程才能很好地實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種富集鈣、鋅、銅、鐵元素，并且無潛在病毒隱患和良好的生物相容性以及優(yōu)異的創(chuàng)面止血修復(fù)效果的類人膠原蛋白止血敷料。
[0005]本發(fā)明另一目的是提供上述類人膠原蛋白止血敷料的制備方法。
[0006]本發(fā)明的具體過程如下:
一種類人膠原蛋白止血敷料，其采取以下制備方法得到:在以基因工程菌高密度發(fā)酵的人源型類人膠原蛋白分別螯合鈣、鋅、鐵、銅離子制備的螯合型重組類人膠原蛋白的水溶液中，加入交聯(lián)劑賴氨酰氧化酶進(jìn)行酶法交聯(lián)、陳化、冷凍和超低溫冷凍處理后，進(jìn)行真空冷凍干燥，Co60照射滅菌，獲得最終的可吸收性類人膠原蛋白止血敷料。
[0007]所述螯合鈣型、螯合鋅型、螯合鐵型、螯合銅型的重組類人膠原蛋白的質(zhì)量比為:(500-600): (10-15): (10-20): (1-5)，總膠原蛋白溶液質(zhì)量體積比濃度為5?20%。
[0008]賴氨酰氧化酶質(zhì)量體積比濃度為0.01-0.5%。
[0009]交聯(lián)反應(yīng)溫度為20?45°C，具體可為20°C、25°C、37°C或45°C等;反應(yīng)時(shí)間為5?48h，具體可為5h、10h、24h或48h等。
[0010]上述制備得到的類人膠原蛋白止血敷料的吸水率為3400%，凝血速率可達(dá)51 s。
[0011]本發(fā)明所述的交聯(lián)后樣品需進(jìn)行超低溫冷凍和冷凍干燥處理，并通過Co60照射滅菌方可使用。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
(1)本發(fā)明所涉及的膠原蛋白為基因工程菌高密度發(fā)酵的人源型膠原蛋白，具有優(yōu)異的生物相容性、促細(xì)胞生長、無動(dòng)物病毒隱患的特點(diǎn)，以這樣蛋白改性的螯合鈣、鋅、鐵、銅元素的膠原蛋白不僅同樣保留了原膠原蛋白基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)增加了離子輔助功效，大大提升了(術(shù)后)創(chuàng)傷面的高止血效果和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的功效；
(2)本發(fā)明所涉及的交聯(lián)劑是存在于哺乳動(dòng)物中的銅依賴性氨基酸氧化酶，源于細(xì)胞分泌的賴氨酸氧化酶原在胞外被剪切加工而成的，能夠催化細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如膠原蛋白和彈性蛋白)中賴氨酸殘基的ε_(tái)氨基氧化去氨基形成賴氨酸-乙醛，和相鄰的分子的三螺旋區(qū)域(Hyl-Gly-His-Arg)中的一個(gè)高度保守的賴氨酰胺氧化酶結(jié)合位點(diǎn)上羥賴氨酸的反ε-氨基生成希夫堿(醛亞胺)，從而實(shí)現(xiàn)膠原蛋白和彈性蛋白的可溶性單體轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定性較強(qiáng)的不溶性纖維。該交聯(lián)劑的使用不僅僅是對(duì)膠原蛋白分子的作用，還能夠合成細(xì)胞外基質(zhì)，影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞趨化，促進(jìn)創(chuàng)傷面的組織再生，故其單體在交聯(lián)后的殘存無需去除；
(3)本發(fā)明制備方法原料易得，成本低，合成工藝簡單易實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，工藝放大容易且重現(xiàn)性能好。本發(fā)明所制備的新型止血敷料在醫(yī)用生物材料與組織工程等相關(guān)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013]圖1為實(shí)施例1制備的新型止血敷料的樣品圖；
圖2為實(shí)施例1制備的新型止血敷料的SEM圖；
圖3為實(shí)施例5中的新型止血敷料的細(xì)胞培養(yǎng)熒光圖；
圖4為實(shí)施例6中的新型止血敷料的止血效果圖；
圖5為實(shí)施例6中的新型止血敷料的止血4周后效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法;所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0015]實(shí)施例1富含鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白止血敷料的制備
按照質(zhì)量比為100:2:2:1，分別稱取適量的螯合鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白適量，溶于適量的去離子水中，配制成濃度為10% (w/v)的膠原蛋白溶液100 ml;在攪拌下向上述蛋白溶液中加入0.05%(w/v)的交聯(lián)劑賴氨酸氧化酶2mL，混勻后倒入模具，在25°C下保溫24h，再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱中冷凍2?4h;將超低溫冷凍的樣品迅速移入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)中，真空冷凍干燥24?48h，取出封裝，Co60照射滅菌，獲得可降解人源型膠原蛋白止血敷料。制備的新型止血敷料的外觀照片如圖1所示，其微觀結(jié)構(gòu)的SEM圖見圖2所示，該止血敷料的吸水率約為3400%。
[0016]實(shí)施例2富含鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白止血敷料的制備
按照質(zhì)量比為100:3:4:1，分別稱取適量的螯合鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白適量，溶于適量的去離子水中，配制成濃度為5%(w/v)的膠原蛋白溶液200 ml;在攪拌下向上述蛋白溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的交聯(lián)劑賴氨酸氧化酶0.4ml，混勻后倒入模具，在20°C下保溫48h，再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱中冷凍2?4h;將超低溫冷凍的樣品迅速移入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)中，真空冷凍干燥24?48h，取出封裝，Co60照射滅菌，獲得可降解人源型膠原蛋白止血敷料。
[0017]實(shí)施例3富含鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白止血敷料的制備
按照質(zhì)量比為400:10:10:1，分別稱取適量的螯合鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白適量，溶于適量的去離子水中，配制成濃度為15%(w/v)的膠原蛋白溶液200ml ；在攪拌下向上述蛋白溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%(w/v)的交聯(lián)劑賴氨酸氧化酶6mL，混勾后倒入模具，在45°C下保溫5h，再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱中冷凍2?4h;將超低溫冷凍的樣品迅速移入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)中，真空冷凍干燥24?48h，取出封裝，Co60照射滅菌，獲得可降解人源型膠原蛋白止血敷料。
[0018]實(shí)施例4富含鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白止血敷料的制備
按照質(zhì)量比為100:2:4:1，分別稱取適量的螯合鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白適量，溶于適量的去離子水中，配制成濃度為20%(w/v)的膠原蛋白溶液10ml ；在攪拌下向上述蛋白溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的交聯(lián)劑賴氨酸氧化酶1mL，混勻后倒入模具，在37°C下保溫101!，再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱中冷凍2?4h;將超低溫冷凍的樣品迅速移入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)中，真空冷凍干燥24?48h，取出封裝，Co60照射滅菌，獲得可降解人源型膠原蛋白止血敷料。
[0019]實(shí)施例5富集鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白止