血敷料的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)以實(shí)施例1中獲得的類人膠原蛋白止血敷料為材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0020](I)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
浸提液的制備方法:必須保證無菌操作，本實(shí)驗(yàn)的所有操作均在生物安全柜內(nèi)完成。按照類人膠原蛋白止血敷料厚度大于3_，試樣表面積/浸提介質(zhì)=3cm2/ml的要求進(jìn)行浸提液的制備。選取實(shí)施例1中制備的類人膠原蛋白止血敷料為原材料，取15cm2敷料使用5ml的RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%的小牛血清)，在37°C的生化培養(yǎng)箱中恒溫浸泡72h 土 2h制備敷料的浸提液。以1:1的比例將制得的浸提液與原RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行混合，制得50%濃度浸提液。
[0021 ] 5mg/ml MTT溶液的配制:準(zhǔn)確稱取10mg的MTT溶于20ml的PBS中，完全溶解以后用
0.22μπι的濾膜過濾除菌，分裝以后用錫箔紙包住置于-20°C冰箱避光保存?zhèn)溆谩?br>[0022]在37°C，C02濃度為5.0%的條件下培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞。細(xì)胞傳代后把BHK-21細(xì)胞以
0.25%的胰蛋白酶(用孔徑為0.22μπι的膜過濾)溶液進(jìn)行消化，以3 X 14 cells/ml的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100yL。將接有細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，并以每8個孔為一組平行樣，分別向每孔加入50%和100%濃度的蛋白敷料的浸提液ΙΟΟμΙ。
[0023]當(dāng)培養(yǎng)到2d、4d和7d時，每孔分別加入濃度為5mg/ml的MTT溶液20μ1，孵育4h后吸去上層培養(yǎng)液，迅速加入150μ1 DMSO，快速振蕩5min以570nm作為檢測波長，同時以630nm為參考檢測波長，利用酶標(biāo)儀測定每個孔的吸光度值。實(shí)驗(yàn)中使用完全培養(yǎng)基作為空白對照。以細(xì)胞的相對增殖率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白組吸光度值X 100%，計算出不同濃度的材料浸提液中BHK-21細(xì)胞的相對增殖率。
[0024]檢測結(jié)果表明富集鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白止血敷料的細(xì)胞毒性評價為I級。
[0025](2)細(xì)胞形貌的分析
類人膠原蛋白止血敷料對細(xì)胞形態(tài)的影響可以通過熒光染色來觀察。首先是將生長較好的BHK-21細(xì)胞制備成細(xì)胞懸浮液，其濃度為9 X 13個/mL，于48孔板中加ImL的細(xì)胞懸浮液，待24h后，加入樣品溶液進(jìn)行，培養(yǎng)48h后，加入CDFA熒光染料，使其在培養(yǎng)液中的最終濃度為1ygAiUCO2培養(yǎng)箱中孵育30min中，吸取上清，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形貌，圖3為新型止血敷料浸提液培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞24h的細(xì)胞形貌熒光圖。
[0026]實(shí)施例6富集鈣、鋅、鐵、銅型的類人膠原蛋白止血敷料的術(shù)后止血應(yīng)用
以實(shí)驗(yàn)兔為動物模型，以實(shí)施例1中獲得的類人膠原蛋白止血敷料為材料，采用2.5%戊巴比妥鈉溶液2ml耳緣靜脈注射麻醉，逐層開腹，暴露肝臟，在肝葉上用手術(shù)刀片做1.0cm X
1.0cm的創(chuàng)面，在創(chuàng)面形成過程中滲血用紗布吸取，然后迅速用準(zhǔn)備好的面積為1.5cm X1.5cm類人膠原蛋白止血敷料膜敷壓創(chuàng)面，記錄完全止血時間為51秒，觀察止血敷料在創(chuàng)面的粘附情況并對肝臟表面進(jìn)行拍照，如圖4所示。對實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行傷口縫合包扎，飼養(yǎng)4周后處死，解剖觀察原肝臟創(chuàng)傷部位，發(fā)現(xiàn)止血敷料已經(jīng)完全降解，肝臟表面無明顯炎癥跡象和增生物出現(xiàn)，如圖5照片所示。
[0027]總之，除過鈣元素外，還有許多微量元素如鐵、鋅、銅、錳、鉻、砸、鉬、鈷、氟等，它們也與人的生存和健康息息相關(guān)，對人的生命起至關(guān)重要的作用，如果它們的攝入過量、不足、不平衡或缺乏都會不同程度地引起人體生理的異?；虬l(fā)生疾病。其中與創(chuàng)傷愈合有關(guān)的微量元素主要有鋅、鐵、銅。鋅極易與血楽中一些低分子量化合物結(jié)合，由腎濾過而排出，當(dāng)?shù)鞍讖哪蛑衼G失時，鋅也可隨之丟失。因此，在創(chuàng)傷或手術(shù)后，或多或少有一段時間處于低鋅狀態(tài)，補(bǔ)鋅是十分必要的。鐵和抗壞血酸在一起，對傷口愈合也是必需的。鐵的丟失主要原因是創(chuàng)傷失血，血紅蛋白分解及組織溶解滲出。鐵是人體造血的重要原料，但必須依靠銅元素的幫忙。銅在人體內(nèi)的含量僅次于鐵和鋅，以金屬酶的形式存在于體內(nèi)，位于酶的活性部位。銅被吸收后，合成血漿銅藍(lán)蛋白和各種銅酶，參與血紅素和細(xì)胞色素的合成。銅藍(lán)蛋白可以維護(hù)正常的造血機(jī)能，促進(jìn)鐵的吸收和運(yùn)輸，促進(jìn)血紅素和血紅蛋白的合成。本專利發(fā)明人合理利用人體必需元素鈣、鋅、銅、鐵等的特殊生理作用，制備得到的類人膠原蛋白止血敷料可充分提高止血效果和促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種類人膠原蛋白止血敷料，其特征在于采取以下制備方法得到:在以基因工程菌高密度發(fā)酵的人源型類人膠原蛋白分別螯合鈣、鋅、鐵、銅離子制備的螯合型重組類人膠原蛋白的水溶液中，加入交聯(lián)劑賴氨酰氧化酶進(jìn)行酶法交聯(lián)、陳化、冷凍和超低溫冷凍處理后，進(jìn)行真空冷凍干燥，Co60照射滅菌，獲得最終的可吸收性類人膠原蛋白止血敷料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類人膠原蛋白止血敷料，其特征在于:所述螯合鈣型、螯合鋅型、螯合鐵型、螯合銅型的重組類人膠原蛋白的質(zhì)量比為:(500?600): (10-15): (10-20):(1-5)，總膠原蛋白溶液質(zhì)量體積比濃度為5?20%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類人膠原蛋白止血敷料，其特征在于:賴氨酰氧化酶質(zhì)量體積比濃度為0.01?0.5%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類人膠原蛋白止血敷料，其特征在于:交聯(lián)反應(yīng)溫度為20?45?C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類人膠原蛋白止血敷料，其特征在于:交聯(lián)反應(yīng)時間為5?48h。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類人膠原蛋白止血敷料，其特征在于:所述類人膠原蛋白止血敷料的吸水率為3400%，凝血速率可達(dá)51 s。7.權(quán)利要求1所述類人膠原蛋白止血敷料的制備方法，其特征在于包括以下步驟:在以基因工程菌高密度發(fā)酵的人源型類人膠原蛋白分別螯合鈣、鋅、鐵、銅離子制備的螯合型重組類人膠原蛋白的水溶液中，加入交聯(lián)劑賴氨酰氧化酶進(jìn)行酶法交聯(lián)、陳化、冷凍和超低溫冷凍處理后，進(jìn)行真空冷凍干燥，Co60照射滅菌，獲得最終的可吸收性類人膠原蛋白止血敷料。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的類人膠原蛋白止血敷料的制備方法，其特征在于:所述螯合鈣型、螯合鋅型、螯合鐵型、螯合銅型的重組類人膠原蛋白的質(zhì)量比為:(500?600):(10?15):(10?20): (I?5)，總膠原蛋白溶液質(zhì)量體積比濃度為5?20%。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的類人膠原蛋白止血敷料的制備方法，其特征在于:賴氨酰氧化酶質(zhì)量體積比濃度為0.01-0.5%。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的類人膠原蛋白止血敷料的制備方法，其特征在于:交聯(lián)反應(yīng)溫度為20?45°C，反應(yīng)時間為5?48h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有良好生物相容性的可吸收的富集鈣、鋅、銅、鐵的新型的類人膠原蛋白止血敷料及其制備方法。該制備方法是利用高密度發(fā)酵制備的人源型類人膠原蛋白分別螯合鈣、鋅、銅、鐵四種離子的改性蛋白為原料，利用哺乳動物體內(nèi)存在的賴氨酰氧化酶為交聯(lián)劑，通過低溫交聯(lián)反應(yīng)和冷凍干燥工藝過程，獲得了可用于創(chuàng)傷和術(shù)后止血的新型膠原蛋白止血敷料。本發(fā)明制備方法原料易得，成本低，合成工藝簡單易實(shí)現(xiàn)，工藝放大容易且重現(xiàn)性好；本發(fā)明制備的類人膠原蛋白止血敷料無動物源病毒隱患，止血效果顯著，可用作各類創(chuàng)面止血和術(shù)后止血，以及生物醫(yī)學(xué)組織工程等相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用。
【IPC分類】A61L26/00
【公開號】CN105536043
【申請?zhí)枴緾N201610073664
【發(fā)明人】范代娣, 米鈺, 鄭曉燕, 馬沛, 惠俊峰
【申請人】西北大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年2月3日