本申請涉及大黃酸或姜黃素在制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病，和/或降糖的藥物中的應(yīng)用，特別涉及一種藥物組合物和藥物制劑。
背景技術(shù)：
糖尿病發(fā)病率日益攀升，已成為一個公共衛(wèi)生問題，其嚴重的并發(fā)癥之一是糖尿病腎病。糖尿病腎病是一種微血管并發(fā)癥，逐漸發(fā)展的腎臟損害中，可見彌漫性和結(jié)節(jié)性腎小球硬化，以及與這些病理改變相伴隨的水腫、蛋白尿、高血壓等臨床表現(xiàn)，最后直接導(dǎo)致腎功能衰竭。糖尿病患者I型占10％，II型占90％，I型中有約35％發(fā)生糖尿病腎病，而II型中有約25％發(fā)生。糖尿病腎病已成為終末期腎病的(ESRD)的第一位原因。美國透析患者中30％來自糖尿病腎病，接受腎移植約1/5為糖尿病腎病患者。研究顯示，糖尿病合并腎病和尿毒癥的概率較非糖尿病人高效7倍。糖尿病病程10-20年后，約半數(shù)會發(fā)生腎功能衰竭。因此，糖尿病腎病的預(yù)防和治療均應(yīng)得到足夠的重視。
目前臨床用于降糖的化學(xué)藥物，主要效應(yīng)是降低血糖，而對糖尿病重要臟器損傷等并發(fā)癥往往沒有防治作用。目前無特效、能預(yù)防、終止或逆轉(zhuǎn)糖尿病腎臟功能障礙進展的藥物。臨床用于治療糖尿病的化學(xué)藥物在降低血糖之外，并不具備腎臟功能的改善或保護，有些降糖藥物甚至發(fā)生腎損傷作用，例如在腎臟功能出現(xiàn)損害時不宜使用雙胍類及經(jīng)腎臟代謝的藥物，雙胍類降糖藥易誘發(fā)乳酸中毒，并可加重腎功能衰竭時的代謝性酸中毒癥狀；經(jīng)腎代謝的降糖藥，可加重腎臟負擔(dān)，并可造成嚴重的持續(xù)性低血糖。
因此，目前臨床上的治療方法有很大的局限性，不能有效地減緩病情的發(fā)展。研發(fā)預(yù)防和/或治療糖尿病腎病的藥物成為當(dāng)前該領(lǐng)域的重大課題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本申請首次確定了大黃酸和姜黃素均可以用于預(yù)防和/或治療糖尿病腎臟損傷，以及降糖的功效，其中相比于大黃酸，姜黃素能夠取得更好的效果。因此，本申請之一提供了大黃酸或姜黃素在制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病，和/或降糖的藥物中的應(yīng)用。本申請的大黃酸或姜黃素具有降糖和防治糖尿病腎病雙重功效，其具有療效好、毒副作用低、安全、用量小、應(yīng)用方便等優(yōu)點。避免中藥大復(fù)方成分復(fù)雜不清的缺點，同時除去了中藥大復(fù)方中毒性成分，從而減少毒副作用的發(fā)生。
本申請之二提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括大黃酸和姜黃素。
本申請的研究表明，將大黃酸和姜黃素組合可以更好地預(yù)防和/或治療糖尿病腎臟損傷，兩者表現(xiàn)出協(xié)同作用。
進一步地，本申請確定了兩種單體化合物在組合物中的優(yōu)選比例關(guān)系，在一個具體實施方式中，所述大黃酸具有1-5摩爾份，所述姜黃素具有1-5摩爾份。例如，按人體重70kg計算，所述大黃酸具有55mg/70kg-275mg/70kg體重，所述姜黃素具有355mg/70kg-1775mg/70kg體重。
本申請的研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大黃酸和姜黃素與二苯乙烯苷組合時，比其中的任何兩兩組合預(yù)防和/或治療糖尿病腎臟損傷效果更好，表現(xiàn)出最佳協(xié)同作用。因此，在一個具體實施方式中，所述藥物組合物還包括二苯乙烯苷。
進一步地，本申請還確定了二苯乙烯苷在組合物中的比例。因此，在一個具體實施方式中，所述二苯乙烯苷具有1-5摩爾份。例如，按人體重70kg計算，所述二苯乙烯苷具有8mg/70kg-40mg/70kg體重范圍。
在一個具體實施方式中，優(yōu)選所述大黃酸具有1-5摩爾份，所述姜黃素具有4-5摩爾份，所述二苯乙烯苷具有1-5摩爾份。
在一個具體實施方式中，更優(yōu)選所述大黃酸具有1-2摩爾份，所述姜黃素具有5摩爾份，所述二苯乙烯苷具有1-2摩爾份。
本申請之三提供了一種藥物制劑，所述藥物制劑包括如本申請之一所述的藥物組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
在一個具體實施方式中，所述制劑選自片劑、膠囊和沖劑中的至少一種。
在一個具體實施方式中，以在所述藥物制劑中的質(zhì)量百分含量計，大黃酸2.4％-38.4％、姜黃素26.7％-92.5％和二苯乙烯苷4.1％-51.9％。根據(jù)研究數(shù)據(jù)，最佳質(zhì)量百分比為大黃酸11.1％、姜黃素71.1％和二苯乙烯苷17.8％配伍組合。
本申請之四提供了根據(jù)本申請之二所述的藥物組合物，或根據(jù)本申請之三所述的藥物制劑在制備預(yù)防和/或治療糖尿病腎病，和/或降糖的藥物中的應(yīng)用。
在一個具體實施方式中，所述糖尿病選自II型糖尿病。
中醫(yī)學(xué)整體觀念的特點及中藥學(xué)復(fù)方特征，使得中藥在治療神經(jīng)損傷性疾病上具有多靶點的優(yōu)勢，具有很強的可行性。本申請的研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸和姜黃素均表現(xiàn)出降糖和腎臟保護作用。另外，二苯乙烯苷也表現(xiàn)出降糖和腎臟保護作用。但三者的作用機制不同。因此，由這些組分組成的單體復(fù)方制劑在效應(yīng)上可發(fā)揮多靶點神經(jīng)保護機制，對應(yīng)糖尿病腎臟損傷多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑等特點，而干預(yù)其中某一環(huán)節(jié)或途徑單一的治療經(jīng)臨床證實療效較差。另外，單體復(fù)方制劑又可避免中藥大復(fù)方成分復(fù)雜不清的缺點，避免毒性成分，因此單體復(fù)方成分清楚、含量配伍清晰、靶點明確，從而減少毒副作用的發(fā)生。大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷均具有一定的降糖與腎臟保護作用，因此，本申請篩選出了該三種組分，采用優(yōu)選劑量配伍，闡明三種化合物協(xié)同作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與配伍比例。因此，本申請發(fā)掘了一種安全有效且成分明確的新型單體復(fù)方糖尿病腎臟保護藥物。
附圖說明
圖1為單體及復(fù)方組合物對糖耐量的影響。三類單體以及復(fù)方對糖耐量的影響，RGZ作為陽性對照藥物。大黃酸(Rhein)、姜黃素(Curcumin)和二苯乙烯苷(TSG)，三單體組合物(Combination)。n＝8平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，**p<0.01與模型組(T2DM)比較。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例詳述本申請，但本申請并不局限于這些實施例。
如無特別說明，本申請的實施例中的原料均通過商業(yè)途徑購買。
大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
大黃酸購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，純度≥98％。
姜黃素購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，純度≥99％。
二苯乙烯苷購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，純度≥98％。
實施例1
細胞實驗
該實施例主要評價各組分的作用及量效關(guān)系。利用腎小球系膜細胞(EMCs)高糖培養(yǎng)模型，篩選大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷各單組份及其組合物對EMCs增值、IV型膠原和層黏粘蛋白合成的影響。
1.MTT比色法測大鼠腎小球系膜細胞(MCs)增殖
MCs在高糖環(huán)境培養(yǎng)48h時顯著刺激系膜細胞增殖。
MCs培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(購自gibco)中，常規(guī)置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，每周傳代2-3次。MTT法檢測GMCs增殖活性，取對數(shù)期大鼠GMCs，每孔2×104-4×104細胞接種于96孔板上，12h待細胞亞融合后改0.5％的胎牛血清DMEM培養(yǎng)24h使細胞同步化。棄上清，按不同處理分組給藥，每組設(shè)6個復(fù)孔，分別加入大黃酸、姜黃素、二苯乙烯苷1h后，將DMEM中葡萄糖含量增加至30mM，繼續(xù)培養(yǎng)48h，于實驗終止前4h每孔加10μl(5mg/ml)MTT。4h后吸凈上清液，加入100μl DMSO，振蕩10min于酶標(biāo)儀上570nm波長處測OD值。
單體對高糖引起腎臟系膜細胞增殖的影響結(jié)果見表1。從表1中可以看出，系膜細胞在高糖環(huán)境培養(yǎng)48h時顯著刺激系膜細胞增殖，中高劑量的大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷均表現(xiàn)出抑制高糖引起的系膜細胞增殖，并呈劑量依賴性關(guān)系。而陽性對照藥物羅格列酮(RGZ，5μM)和小劑量大黃酸(1μM)對系膜細胞增殖無顯著影響。
2.MCs培養(yǎng)上清中膠原蛋白IV和層黏連蛋白含量測定
MCs在高糖環(huán)境培養(yǎng)48h時顯著引起IV型膠原合成。
細胞處理同上，將MCs細胞按每孔104接種于96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)48h，收集細胞上清，按照試劑盒說明書進行膠原蛋白IV和層黏連蛋白含量的測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的蛋白含量。每組各設(shè)3個復(fù)孔，取各組平均值作為最終結(jié)果，實驗重復(fù)3次。
單體高糖環(huán)境下系膜細胞IV型膠原合成的影響結(jié)果見表1。從表1中可以看出，系膜細胞在高糖環(huán)境培養(yǎng)48h時顯著引起IV型膠原合成，中高劑量的大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷均表現(xiàn)出抑制高糖引起的IV型膠原合成，并呈劑量依賴性關(guān)系。而陽性對照藥物羅格列酮(RGZ，5μM)和小劑量各組對IV型膠原合成無顯著影響。
單體對高糖環(huán)境下系膜細胞層黏連蛋白合成的影響結(jié)果見表1。從表1中可以看出，系膜細胞在高糖環(huán)境培養(yǎng)48h時顯著刺激系膜細胞層黏連蛋白合成，大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷均表現(xiàn)出抑制高糖引起的層黏連蛋白合成增加，并呈劑量依賴性關(guān)系。而陽性對照藥物羅格列酮(RGZ，5μM)和小劑量大黃酸(1μM)對層黏連蛋白合成無顯著影響。
表1三種單體分別對高糖引起腎臟系膜細胞增殖及相關(guān)蛋白表達的影響
n＝6培養(yǎng)皿/組，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，##P<0.01與正常對照組比較；*P<0.05，**P<0.01，與高糖組比較。
3.三種單體間兩兩組合對抑制腎臟系膜細胞增殖作用的考察
根據(jù)上述第1和2小節(jié)的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷在一定劑量時均表現(xiàn)出對高糖引起的腎臟系膜細胞增殖的抑制作用。進一步利用交叉設(shè)計，考察大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷三個單體間兩兩組合及其在不同劑量下的作用。由于三個單體在1μM劑量單獨使用時效果不顯著，故在聯(lián)合使用是分別選擇5μM和25μM兩個劑量進行研究。
大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷在5μM和25μM兩個劑量均有較好療效，因此，先考察在三種單體在這兩個劑量下兩兩組合的效應(yīng)。測定方法同第1小節(jié)。結(jié)果見表2。從表2可以看出，其中任何兩藥聯(lián)合應(yīng)用，均表現(xiàn)出比單體更強的抑制系膜細胞增殖作用，即三種單體兩兩之間表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。
表2.三種單體間的兩兩組合對抑制腎臟系膜細胞增殖作用(OD值％)
注：n＝6培養(yǎng)皿/組，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，**p<0.01與正常比較；#p<0.05,##p<0.01與高糖模型比較。
4.三種單體在不同劑量下的組合對抑制腎臟系膜細胞增殖作用的考察
結(jié)合上述第3小節(jié)三種單體間的兩兩組合的效果，進一步考察三個單體的聯(lián)合使用，劑量分別考察大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷均在5μM和25μM濃度下的作用。根據(jù)三因素兩水平設(shè)計，共分為以下8種組合：
組合1：大黃酸(5μM)+姜黃素(5μM)+二苯乙烯苷(5μM)；
組合2：大黃酸(5μM)+姜黃素(5μM)+二苯乙烯苷(25μM)；
組合3：大黃酸(5μM)+姜黃素(25μM)+二苯乙烯苷(5μM)；
組合4：大黃酸(5μM)+姜黃素(25μM)+二苯乙烯苷(25μM)；
組合5：大黃酸(25μM)+姜黃素(5μM)+二苯乙烯苷(5μM)；
組合6：大黃酸(25μM)+姜黃素(5μM)+二苯乙烯苷(25μM)；
組合7：大黃酸(25μM)+姜黃素(25μM)+二苯乙烯苷(5μM)；
組合8：大黃酸(25μM)+姜黃素(25μM)+二苯乙烯苷(25μM)。
對上述8種組合物考察對腎系膜細胞增殖抑制作用，結(jié)果見表3。由表3可見，三個單體組合均具有較好的抑制系膜細胞增殖作用。相比較而言，組合中當(dāng)姜黃素濃度較高(25μM)時，即組合3、組合4、組合7和組合8對細胞增殖抑制作用較顯著，但這4組間效應(yīng)無明顯差異，并且大黃酸(5μM)與二苯乙烯苷(5μM)濃度較低。據(jù)此，在效應(yīng)可以保證的前提下，三個藥物組合的摩爾濃度比例可以按照組合3的比例設(shè)定，大黃酸(5μM)+姜黃素(25μM)+二苯乙烯苷(5μM)，摩爾濃度比例為大黃酸：姜黃素：二苯乙烯苷＝1:5:1。在大鼠整體實驗中，藥物給藥劑量按照這一比例進一步驗證評價。
表3兩類單體成分抑制腎臟系膜細胞增殖的協(xié)同作用(OD值％)
注：n＝6培養(yǎng)皿/組，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，##p<0.01與正常比較；**p<0.01與高糖模組比較；&p<0.05與組合1、組合2、組合5或組合6比較。
實施例2
大鼠實驗
鏈脲佐菌(STZ)誘導(dǎo)II型糖尿病大鼠模型
SD(Spraque-Dawley)雄性大鼠，10周齡左右，體重252±23g，隨機分為：正常對照組和糖尿病待造模組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型組大鼠喂以高糖、高脂飼料(其中含10.0％豬油、20.0％蔗糖、2.5％膽固醇、1.0％膽酸鹽、66.5％常規(guī)飼料)4周，誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗。第5周，各實驗組大鼠禁食不禁水12h后，鏈脲佐菌(STZ)腹腔注射30mg/kg，正常對照組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。注射1周后，各組大鼠禁食不禁水12h后斷尾取血，測空腹血糖(Fasting Blood Glucose，F(xiàn)BG)。FBG＞16.7mmol/L視為造模成功。治療組每日給予單體及復(fù)方制劑灌胃給藥4周(每日2次，于AM9:00和PM5:00各灌胃1次)，陽性對照選擇羅格列酮(3mg/kg，RGZ)灌胃1次/天，陰性對照組和模型組給予等體積的生理鹽水，每日2次，連續(xù)4周，實驗組同時給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。考察單體及單體復(fù)方的降糖與腎保護作用。
1.單體復(fù)方組合的動物藥效學(xué)考察
根據(jù)實施例1的細胞模型實驗，結(jié)合大黃酸的分子量284.22、姜黃素的分子量368.39和二苯乙烯苷的分子量406.38，在假定三者生物利用度相同的情況下，依據(jù)分子量與細胞學(xué)實驗中最佳有效濃度比例，設(shè)計三個單體摩爾比即大黃酸：姜黃素：二苯乙烯苷＝1:5:1，確定三類單體給藥劑量為大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg，單體組合劑量為45mg/kg。整體實驗進一步比較三個單體及組合物對糖尿病大鼠腎臟功能的保護作用，藥物均為灌胃口服給藥，每日上午AM9:00和下午PM5:00各灌胃1次。陽性對照選擇羅格列酮(3mg/kg，RGZ)，灌胃給藥每日1次，陰性對照給予等體積生理鹽水，每日灌胃每日上下午各1次。
(1)對STZ誘導(dǎo)II型糖尿病大鼠體重的影響
首先制作II型糖尿病(T2DM)模型大鼠。STZ腹腔注射1周后，各組大鼠禁食不禁水12h后斷尾取血，測空腹血糖(Fasting Blood Glucose，F(xiàn)BG)>16.7mmol/L視為造模成功。連續(xù)給藥治療4周后，模型對照組大鼠體質(zhì)量減輕，狀態(tài)萎靡，活動減少；而大黃酸(5mg/kg)，姜黃素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及單體組合物(45mg/kg，即大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干預(yù)后大鼠體質(zhì)量有不同程度增加，其中單體組合物治療3-4周后體重增加最為顯著，陽性對照RGZ組體重也顯著增加(表4)。
表4各組大鼠體重變化情況(均數(shù)±SEM)
n＝8，**p<0.01與對照組比較；#p<0.0，##p<0.01與T2DM模型組比較；$p<0.05與組合物組比較。
(2)對STZ誘導(dǎo)II型糖尿病大鼠血糖及糖耐量的影響
空腹血糖采用自動血糖儀和穩(wěn)豪型血糖試紙檢測，以mmol/L表示。糖耐量實驗：模型干預(yù)組給予各單體與復(fù)方治療4周，模型對照組給予與體質(zhì)量相應(yīng)體積的生理鹽水，陽性對照藥物為羅格列酮(3mg/kg RGZ)。糖耐量實驗當(dāng)天，各組動物禁食3-5小時，測定給葡萄糖前(即0時)血糖值，15-20分鐘后各組經(jīng)口給予葡萄糖2.0g/kg體重，測定給葡萄糖后各組0.5，2.0小時的血糖值。連續(xù)給藥治療4周后，模型對照組大鼠血糖無明顯變化，而大黃酸(5mg/kg)，姜黃素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及單體組合物(45mg/kg，即大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干預(yù)后大鼠血糖均顯著降低，單體組合治療組降糖作用比各單體作用更強，顯示出協(xié)同作用，組合物組降糖作用與陽性對照RGZ組作用相當(dāng)(表5)。
表5.各時間點SD大鼠空腹血糖(FBG)的變化情況(均數(shù)±SEM)
n＝8，**p<0.01與對照組比較；#p<0.05，##p<0.01與T2DM模型組比較；$p<0.05，$$p<0.01與組合物組比較。
在4周治療結(jié)束時進行大鼠口服糖耐量實驗(OGTT)。模型組大鼠的OGTT中各時間點的血糖值均顯著高于正常組，表明大鼠糖耐量異常。而大黃酸(5mg/kg)，姜黃素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及單體組合物(45mg/kg，即大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干預(yù)后，大鼠血糖各時間點均顯著降低，單體組合物治療組降糖作用與陽性對照RGZ作用相當(dāng)，并顯著強于各單體(圖1)。
(3)單體復(fù)方組合對糖尿病模型大鼠腎臟功能的影響
連續(xù)給藥治療4周后，留取T2DM模型大鼠血液與尿液，用Beckman全自動生化檢測儀檢測血漿肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)水平。模型組大鼠血漿肌酐與尿素氮水平是顯著升高，大黃酸(5mg/kg)，姜黃素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及單體組合物(45mg/kg，即大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干預(yù)后血漿肌酐與尿素氮水平顯著降低，而陽性對照RGZ明顯降低尿素氮水平，但對血漿肌酐水平無顯著影響，單體組合物(45mg/kg)治療組保護腎臟作用最強，提示單體協(xié)同作用顯著(表6)。
表6.各處理組對大鼠腎臟功能的影響(均數(shù)±SEM)
n＝8，**p<0.01與對照組比較；#p<0.05，##p<0.01與T2DM模型組比較；$p<0.05，$$p<0.01與組合物組比較。
2.單體復(fù)方組合物藥理作用機制研究
為闡明大黃酸，姜黃素和二苯乙烯苷單體組合物減輕糖尿病模型大鼠腎臟損傷的機制，對影響腎臟纖維化信號因子和氧化損傷指標(biāo)進行研究。
(1)對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1(SGK1)與TGF-β1蛋白表達的影響
SGK1參與多種細胞信號傳導(dǎo)通路和細胞磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的一個功能交匯點，參與細胞增殖與細胞凋亡等過程，從而促進間質(zhì)纖維化。TGF-β1也能誘導(dǎo)SGK1在組織和細胞中的表達，二者水平的異常增加，可協(xié)同促進腎臟間質(zhì)纖維化。
模型大鼠連續(xù)藥物干預(yù)4周后取腎皮質(zhì)進行蛋白質(zhì)Western blot。
迅速取出腎臟，取腎皮質(zhì)組織用PBS漂洗后，加入預(yù)冷的RIPA裂解液(含適量蛋白酶抑制劑cocktail和1mM PMSF)，于冰上用超聲波細胞粉碎機勻漿5次(25Hz，3s/次，間隔5s)，最終液體至清亮。4℃，12000rpm離心20min，收集上清液于新的1.5ml離心管中；取少量上清用BCA法蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定上樣體積；剩余上清中加入1/4體積的5×上樣緩沖液沸水煮8min，使蛋白變性。采用SDS-PAGE分離蛋白，先后配制9％分離膠和3％濃縮膠，待凝膠后，加入500ml電泳緩沖液(含1.51g Tris，7.4g甘氨酸，0.5g SDS)；取蛋白樣品各30μg經(jīng)加樣孔上樣，先80V電泳0.5h，然后調(diào)至120V繼續(xù)電泳約1.5h，待溴酚藍到達分離膠底部時，即停止電泳；PVDF膜用甲醇預(yù)處理2min，加入1L轉(zhuǎn)移緩沖液(含200ml甲醇，14.4g甘氨酸，3.03g Tris)，將凝膠和PVDF膜以“黑膠白膜”的朝向放置，恒壓100V，轉(zhuǎn)移2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，按照蛋白marker裁剪所需的目的蛋白條帶，置于5％脫脂奶粉中封閉，室溫緩慢搖動2-4h；PBST漂洗多余奶粉后，將條帶封入塑料袋中，加入用PBST稀釋的一抗，置于4℃孵育過夜；次日取出塑料袋，室溫復(fù)溫0.5h，然后PBST洗膜3次，每次10min，再將條帶封入用PBST稀釋的二抗中，室溫孵育2h；PBST漂洗3次后，再用PBS漂洗10min，將ECL發(fā)光液A和B按1:1混合后，均勻滴加到膜上，迅速置于發(fā)光儀內(nèi)曝光，照相。抗血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1(SGK1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)抗體購自美國Millipore公司。
模型組大鼠腎皮質(zhì)SGK1與TGF-β1表達顯著增加，大黃酸(5mg/kg)，姜黃素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及單體組合物(45mg/kg，即大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干預(yù)后SGK1與TGF-β1表達水平顯著降低，而陽性對照RGZ對TGF-β1表達水平無顯著影響，只顯著降低SGK1表達水平。單體組合(45mg/kg)治療組抑制SGK1與TGF-β1表達作用最強，提示單體組合可發(fā)揮協(xié)同抑制腎間質(zhì)纖維化(表7)。
表7.各處理組對SGK1與TGF-β1表達的影響(均數(shù)±SEM)
n＝8，**p<0.01與對照組比較；#p<0.05，##p<0.01與T2DM模型組比較；＄p<0.05，$$p<0.01與組合物組比較。
(2)對腎臟氧化損傷的抑制作用
具體實驗步驟請參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書。腎皮質(zhì)組織勻漿，12000rpm離心20min，上清液按照試劑盒，通過分光光度儀用化學(xué)比色法測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平。
T2DM模型大鼠腎臟皮質(zhì)氧化損傷較為顯著。姜黃素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及單體組合物(45mg/kg，即大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)均不同程度減輕T2DM大鼠腎臟皮質(zhì)中氧化損傷產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，增加谷胱甘肽(GSH)和氧化物歧化酶(SOD)水平。大黃酸(5mg/kg)作用較弱。陽性對照RGZ也減輕T2DM大鼠腎臟皮質(zhì)中氧化損傷。單體組合物抗氧化損傷作用最為強大，顯示單體組合的協(xié)同作用(表8)。
表8單體及其組合對T2DM大鼠腎組織抗氧化的影響
n＝8，**p<0.01與對照組比較，#p<0.05，##p<0.01與T2DM模型組比較；$p<0.05，$$p<0.01與組合物組比較。
3.組合物安全性考察
對單體組合物(45mg/kg，即大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)進行急性毒性研究，取禁食12h后大鼠，按體重隨機分為幾個劑量給藥組和水對照組，每組8只。藥物組按25ml/kg大鼠體重灌胃給藥1次，對照組灌胃等體積的生理鹽水。采用Bliss法大鼠灌胃檢測急性毒性未測得LD50，最大負荷劑量2000mg/kg(為大鼠有效劑量45mg/kg的44.4倍)，未見明顯毒副作用。
4.配伍制劑與給藥方法
1.配伍比例與推薦劑量
根據(jù)大鼠實驗結(jié)果，三個單體給藥劑量為大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg，二苯乙烯苷：8mg/kg，以及單體組合物為45mg/kg(即大黃酸：5mg/kg，姜黃素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)，以及大鼠/人(70公斤)體表面積換算，推薦組方臨床單次人用量為500mg/70kg(其中大黃酸：55mg/kg，姜黃素：355mg/kg，二苯乙烯苷90mg)。
2.制劑類型
(1)口服制劑：可為片劑、膠囊，規(guī)格為500mg/片，建議每次1片，每日1-2次。
(2)注射劑：靜脈滴注，每日總量控制在1000mg-2000mg之間。
5.結(jié)論
本發(fā)明利用細胞學(xué)和整體動物研究，發(fā)現(xiàn)大黃酸、姜黃素和二苯乙烯苷配伍組合，具有顯著的協(xié)同作用，并最大程度抑制II型糖尿病大鼠腎臟功能損傷，未見明顯毒副作用。與陽性對照藥物羅格列酮相比，不僅具有降糖作用，還明顯降低腎臟功能損傷，促進腎功能恢復(fù)，具有顯著的優(yōu)勢。其作用機制與降低血糖、增加糖耐量、抑制腎臟間質(zhì)纖維化和氧化損傷有關(guān)。
以上所述，僅是本申請的幾個實施例，并非對本申請做任何形式的限制，雖然本申請以較佳實施例揭示如上，然而并非用以限制本申請，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本申請技術(shù)方案的范圍內(nèi)，利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許的變動或修飾均等同于等效實施案例，均屬于技術(shù)方案范圍內(nèi)。