本發(fā)明涉及一種天然植物單體新的藥理作用，具體的涉及山奈酚在制備預(yù)防和治療視網(wǎng)膜損傷性疾病的保健品或新藥中的應(yīng)用，為眼科相關(guān)疾病的預(yù)防和臨床治療開拓新的方法和思路。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，為感覺層視網(wǎng)膜的外層細(xì)胞提供營養(yǎng)、吞噬和消化光感受器細(xì)胞外節(jié)盤膜，維持新陳代謝等重要功能。RPE與脈絡(luò)膜最內(nèi)層的玻璃膜(Bruch膜)粘連極緊密，與脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層共同組成一個統(tǒng)一的功能單位，即RPE-玻璃膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體，對維持光感受器微環(huán)境有重要作用。RPE細(xì)胞的損傷可引起該復(fù)合體的損害，進(jìn)一步引起很多眼底病的發(fā)生，如年齡相關(guān)性黃斑變性，視網(wǎng)膜色素變性和各種脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變等。

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種隨著年齡增長發(fā)病率逐漸升高的眼部退行性病變，能造成進(jìn)行性的、不可逆的中心視力喪失。在發(fā)達(dá)國家中，AMD己經(jīng)成為老齡人口視力喪失的主要原因，大型的流行病學(xué)調(diào)查顯示，西方國家43歲以上人群中AMD的患病率為1.7％-15.6％。世界衛(wèi)生組織的調(diào)查報告表明，全球盲人中大約有8.7％為AMD導(dǎo)致的不可逆盲。全世界大約有3000萬AMD患者，每年大約有50萬人因AMD而致盲。在我國，由于老齡化進(jìn)程加快，AMD患者也逐年增多，在部分地區(qū)，50歲以上人群中AMD的患病率可以達(dá)到15.5％以上，而且患病率和致盲率隨年齡增加而增加。隨著社會經(jīng)濟(jì)水平和醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展，白內(nèi)障和角膜病等可逆性致盲性眼病己經(jīng)得到了有效地控制，但是AMD作為一種不可逆的致盲性眼病，其發(fā)病率逐年上升，己經(jīng)成為了一項不可忽視的公共衛(wèi)生問題。

氧化應(yīng)激是多種AMD的危險因素中可能的共同作用機(jī)制。AMD是與年齡相伴隨的疾病，隨著年齡增長，衰老細(xì)胞中產(chǎn)生過多的活性氧產(chǎn)物，造成機(jī)體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡，從而造成組織損傷和功能缺失。環(huán)境因素如紫外線照射增多、吸煙等也是與AMD相關(guān)的危險因素，這兩者都己被證明可以造成活性氧的增多，從而造成視網(wǎng)膜組織的氧化應(yīng)激。其他因素如抗氧化維生素攝入不足以及肥胖等也可以造成視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激水平的增加，相關(guān)的臨床試驗結(jié)果則證實了抗氧化維生素與AMD的關(guān)系。綜上所述，氧化應(yīng)激是AMD的重要發(fā)病機(jī)制之一。

AMD是一種退行性改變的致盲疾病，雖然進(jìn)展緩慢，但一旦發(fā)展成滲出型AMD(濕性AMD)則可在短期內(nèi)對視力造成極大的損害。因此，當(dāng)前對滲出型AMD的治療主要是針對脈絡(luò)膜新生血管(CNV)。視網(wǎng)膜光凝術(shù)是一種最早用于治療AMD的方法，此外還有經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?Transpupillary thermotherapy,TTT)、光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)、手術(shù)治療和近年來成為研究熱點的抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)藥物治療。雖然這些治療均取得一定效果，但黃斑區(qū)位置特殊，多數(shù)治療只能針對已形成的CNV，并且費用昂貴，因此尋找另一種可預(yù)防AMD的發(fā)生、可逆轉(zhuǎn)AMD的發(fā)展、價格經(jīng)濟(jì)和副作用少的新療法變得很必要。

越來越多研究表明植物提取物對預(yù)防和逆轉(zhuǎn)AMD有顯著效果。在當(dāng)前眾多的植物提取物研究中，學(xué)者們對類胡籮卜素特別是葉黃素和玉米黃質(zhì)尤為關(guān)注。Nidhi等研究證實在日常飲食中多攝取類胡蘿卜素，尤其是葉黃素和玉米黃質(zhì)有助于減低患AMD的風(fēng)險。但這些植物提取物對RPE細(xì)胞損傷的保護(hù)作用弱，有效藥物濃度高，藥效低，因此尋求優(yōu)于葉黃素的更強(qiáng)有效的藥物治療AMD變得十分必要。

山萘酚(Kaempferol)屬于黃酮醇類化合物，主要來源于姜科植物山奈的根莖，并大量存在于水果蔬菜和豆類中(如、西蘭花、卷心菜、甘藍(lán)、豆類、韭菜、番茄、樹莓、草莓和葡萄等)，另外還存在于某些傳統(tǒng)中草藥(例如菊花、覆盆子、菟絲子、黃芪、銀杏等)中。近年來，人們對于山奈酚的抗癌方面做了大量研究，并證實一定濃度山奈酚有誘導(dǎo)肺癌、胃癌、食管癌、肝癌細(xì)胞凋亡的作用。

關(guān)于山奈酚對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的影響國內(nèi)外尚未有相關(guān)報道，山奈酚是否有可能通過減少視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷來延緩AMD的發(fā)生和發(fā)展，還有待于研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過證實山奈酚對于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并通過細(xì)胞凋亡途徑來研究山奈酚保護(hù)作用的分子機(jī)制，為開發(fā)山奈酚未知的生物活性及將來的臨床治療作用提供新的理論支持。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：山奈酚單用或與抗視網(wǎng)膜損傷保護(hù)藥物聯(lián)合在制備預(yù)防和治療視網(wǎng)膜損傷性疾病藥物中的應(yīng)用。

上述的應(yīng)用，所述的視網(wǎng)膜損傷性疾病包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷引起的視網(wǎng)膜損傷性疾病。

上述的應(yīng)用，所述的視網(wǎng)膜損傷性疾病包括氧化應(yīng)激損傷視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞引起的視網(wǎng)膜損傷性疾病。

上述的應(yīng)用，所述的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為ARPE-19。

上述的應(yīng)用，所述的視網(wǎng)膜損傷性疾病包括年齡相關(guān)性黃斑變性疾病、視網(wǎng)膜色素變性疾病和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變疾病。

上述的應(yīng)用，所述的抗視網(wǎng)膜損傷保護(hù)藥物為葉黃素，胡蘿卜素，花青素，槲皮素，枸杞多糖和黃芪多糖。

上述的應(yīng)用，有效劑量20nM-50nM。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過對山奈酚對于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并通過細(xì)胞凋亡途徑來研究山奈酚保護(hù)作用的分子機(jī)制，通過研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚對氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，而對正常的ARPE-19細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性作用，對RPE細(xì)胞損傷的保護(hù)作用更強(qiáng)，而且藥效較高，未來可能成為臨床上治療AMD的一種強(qiáng)有效的藥物。而且可以通過與現(xiàn)有的治療眼部疾病的藥物(如葉黃素，胡蘿卜素，花青素，槲皮素，枸杞多糖，黃芪多糖等)聯(lián)合，達(dá)到治療和預(yù)防RPE細(xì)胞損傷引起的包括年齡相關(guān)性黃斑變性疾病、視網(wǎng)膜色素變性疾病和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變疾病。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的實驗機(jī)理示意圖。

圖2A是不同濃度的過氧化氫(H₂O₂)對ARPE-19細(xì)胞模型建立圖。

圖2B是不同濃度的山奈酚對ARPE-19細(xì)胞毒性圖。

圖2C是不同濃度的山奈酚對氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞存活率的影響圖。

圖2D是不同濃度的葉黃素對氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞存活率的影響圖(陽性藥對照)。

圖3A是流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂誘導(dǎo)的APRE-19細(xì)凋亡的影響圖。

圖3B是流式細(xì)胞術(shù)檢測的各實驗組ARPE-19細(xì)胞凋亡率(％)圖。

圖4A是山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂氧化應(yīng)激損傷的各實驗組ARPE-19細(xì)胞的ROS活性檢測圖。

圖4B是山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂氧化應(yīng)激損傷的各實驗組ARPE-19細(xì)胞的SOD活性檢測圖。

圖5A是山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞的Bax mRNA表達(dá)水平。

圖5B是山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞的Bcl-2 mRNA表達(dá)水平。

圖5C是山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞的Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。

圖6A是Western blot檢測各實驗組細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)圖。

圖6B是山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)水平。

圖6C是山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)水平。

圖6D是山奈酚(20nM，50nM)對H₂O₂氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞的Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

具體實施方式

實施例

(一)H₂O₂誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19損傷模型(H₂O₂模型組)的建立

ARPE-19細(xì)胞傳代培養(yǎng)，按照2×10⁵cell/ml滴板，100ul/孔。24h后不同濃度H₂O₂(0mM，0.5mM，1mM，1.5mM，2mM)分別作用ARPE-19細(xì)胞24h。呈色：每孔加MTT溶液20ul，繼續(xù)孵育2-4h。比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以不同濃度H₂O₂為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。MTT法檢測細(xì)胞存活率在50％左右時的H₂O₂濃度做為氧化損傷模型的造模濃度。

由圖2A可見，當(dāng)H₂O₂濃度在1mM時細(xì)胞存活率為57.4％，所以1mM H₂O₂確定為后續(xù)實驗的氧化損傷模型的造模濃度。

(二)山奈酚對ARPE-19細(xì)胞的毒性作用

方法：ARPE-19細(xì)胞傳代培養(yǎng)，按照1×10⁵cell/ml滴板，100ul/孔。24h后將不同濃度(1nM，5nM，10nM，20nM，50nM)的山奈酚分別作用于ARPE-19細(xì)胞，每組6復(fù)孔以保證實驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，24h后，采用MTT檢測方法觀察ARPE-19細(xì)胞的相對細(xì)胞活力(cell viability)，結(jié)果如圖2B所示。

由圖2B可見，各實驗組ARPE-19細(xì)胞的相對細(xì)胞活力(cell viability)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明1-50nM濃度的山奈酚對ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞沒有表現(xiàn)出毒性作用。

(三)山奈酚對氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞的抗凋亡作用

方法：實驗分3組：正常對照組，H₂O₂模型組，山奈酚藥物組/葉黃素藥物組。ARPE-19細(xì)胞傳代培養(yǎng)，按照2×10⁵cell/ml滴板，100ul/孔培養(yǎng)24h后，1mM H₂O₂作用H₂O₂模型組，山奈酚藥物組/葉黃素藥物組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)基，山奈酚藥物組分別加入不同濃度(1nM、5nM、10nM、20nM、50nM和100nM)山奈酚；葉黃素藥物組分別加入不同濃度(1μM、5μM、10μM、20μM、50μM和100μM)葉黃素，24h后進(jìn)行MTT檢測。

MTT檢測結(jié)果如圖2C和圖2D所示，各實驗組細(xì)胞相對細(xì)胞活力，結(jié)果顯示H₂O₂模型組低于對照組(P＜0.01)。20nM和50nM的山奈酚保護(hù)組高于H₂O₂模型組(P＜0.01)，說明H₂O₂能夠誘導(dǎo)ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，而山奈酚具有保護(hù)H₂O₂誘導(dǎo)的ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷的作用，并且與葉黃素陽性藥相比其抗凋亡保護(hù)作用更強(qiáng)，用藥濃度更低。

(四)利用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行定量分析

檢測方法為：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化、離心，制成單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞密度為1×10⁴/mL接種在6孔板中，2ml/孔，置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育24h。待細(xì)胞融合至80％時，把細(xì)胞分正常對照組，H₂O₂模型組，20nM山奈酚+H₂O₂模型組，50nM山奈酚+H₂O₂模型組共4組，每組設(shè)3個復(fù)孔。吸走原來的培養(yǎng)基，H₂O₂模型組，20nM山奈酚+H₂O₂模型組，50nM山奈酚+H₂O₂模型組分別加入含濃度為1mM的H₂O₂的培養(yǎng)基，正常組僅予以更換完全培養(yǎng)基，置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸除原培養(yǎng)基，往山奈酚干預(yù)組加入含有藥物濃度為20nM和50nM山奈酚的培養(yǎng)基，正常組和H₂O₂模型組繼續(xù)予更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育24h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書操作，將各組細(xì)胞消化離心，用1.5ml EP管收集，每管加入200μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞液，每管加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI吹打混勻，室溫下避光反應(yīng)15min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，記錄結(jié)果，結(jié)果如圖3A和圖3B。

由圖3A和圖3B可見，各實驗組細(xì)胞凋亡率，正常對照組為5.26±0.25％，H2O2模型組為61.97±1.68％，山奈酚(20/50nM)保護(hù)組分別為46.63±2.74％和28.5±1.09％。說明山奈酚具有保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的抗凋亡作用。

(五)活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)變化情況

本實驗通過DCHF-1和WST-1法對細(xì)胞內(nèi)的ROS和SOD的表達(dá)進(jìn)行檢測。當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時，活性氧(ROS)的產(chǎn)生超出了體內(nèi)清除的界限，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，造成組織損傷。超氧化物歧化酶(SOD)是細(xì)胞中重要的抗氧化酶，它能清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，超氧化物歧化酶(SOD)活性水平能反映細(xì)胞抗氧化能力。因此，SOD、ROS水平可以反映體內(nèi)氧自由基的活性，間接反映細(xì)胞氧化損傷程度。

方法：實驗分4組：正常對照組，H₂O₂模型組，20nM山奈酚+H₂O₂模型組，50nM山奈酚+H₂O₂模型組，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，南京建成生物工程研究所-超氧化物歧化酶(SOD)測試盒。南京建成生物工程研究所-活性氧(ROS)測試盒。結(jié)果如圖4A和圖4B。

ROS和SOD檢測結(jié)果顯示：如圖4A和圖4B可見，與對照組比較，H₂O₂模型組細(xì)胞的ROS水平明顯增高，SOD水平下降，而山奈酚保護(hù)組的ROS水平與H₂O₂模型組相比明顯降低(P<0.01)，SOD水平明顯升高(P<0.01)。

(六)通過RT-PCR檢測每個實驗組細(xì)胞的Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達(dá)水平。

檢測方法為：參照zhang et al方法

1.收集各實驗組細(xì)胞樣品：實驗分4組：正常對照組，H₂O₂模型組，20nM山奈酚+H₂O₂模型組，50nM山奈酚+H₂O₂模型組。

2.進(jìn)行總RNA提?。焊鲗嶒灲M細(xì)胞用1ml Trizol吹起，劇烈振蕩1min，室溫作用5min。加入200ul氯仿，劇烈振蕩數(shù)秒，室溫作用5min。4℃12000r/min離心15min，吸上層水相加入500ul異丙醇混勻后4℃放置20min。4℃12000r/min離心15min，棄上清加入1ml乙醇洗滌一次。4℃8000r/min離心5min，棄上清晾干后加入20ul無菌水得到RNA，并測定RNA濃度。

3.cDNA合成：RNA：5ug/reaction；Primer[oligo(dT)₁₅]：0.5ug/reaction；Nuclease-Free Water，上述混合物共5ul，70℃作用5min后，置于冰上作用5min，瞬離10s。加入dNTP：1ul；5×Reactin Buffer 4ul；MgCl₂：1.5ul；Recombinant Rnase Ribonuclease Inhibitor：0.5ul；Reverse Transcriptase：1ul；加入Nuclease-Free Water至20ul。25℃作用5min后42℃保溫1h，70℃作用15min。合成好的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.引物設(shè)計與合成：

Bcl-2：Sense 5’-AGAGGTCACGGGGGCTAAT-3’

Antisense 5’-CCAGGTAACAAAACCCCACA-3’；

Bax：Sense 5’-CAAGACCAGGGTGGTTGG-3’

Antisense 5’-CACTCCGCCACAAAGAT-3’；

Caspase-3：Sense 5’-TGTGGCATTGAGACAGAC-3’

Antisense 5’-CATGGCACAAAGCGACTG-3’；

β-actin：Sense 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；

Antisense 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’

5.PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：10μl SYBR Mix；0.4μl sense and reverse primer(10μM)；1μl diluted cDNA；8.2μl nuclease-free water。

擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置：95℃2min；95℃15s；60℃1min(40個循環(huán))。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，最后利用數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

RT-PCR結(jié)果顯示，如圖5B的Bcl-2mRNA表達(dá)水平，H₂O₂模型組低于正常對照組，而山奈酚保護(hù)組高于H₂O₂模型組(P＜0.01)，如圖5A的Bax mRNA和如圖5C的Caspase-3mRNA表達(dá)水平，H₂O₂模型組高于正常對照組，而山奈酚保護(hù)組低于H₂O₂模型組(P＜0.01)，說明山奈酚保護(hù)H₂O₂誘導(dǎo)的ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷時，上調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，下調(diào)Bax和Caspase-3基因的表達(dá)。

(七)通過Western blot檢測每個實驗組細(xì)胞的Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

檢測方法為：參照zhang et al方法

(一)蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)胞按照實驗?zāi)康倪M(jìn)行培養(yǎng)及建模、給藥，然后收集細(xì)胞利用細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，并通過BCA法檢測蛋白濃度。

(二)電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。

(三)電轉(zhuǎn)移：

1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡。

2、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液(TTB)中10min。

3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡，接通電源，恒流200mA，轉(zhuǎn)移2h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡。

(四)免疫反應(yīng)：

1、用TTBS洗膜，5min×3次。

2、加入封閉液，平穩(wěn)搖動，室溫2h。

3、棄封閉液，用TTBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗(按合適稀釋比例用TTBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部)，4℃放置12h以上。

5、棄一抗用TTBS分別洗膜，5min×3次。

6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用TTBS稀釋)，平穩(wěn)搖動，室溫2h。

7、棄二抗，用TTBS洗膜，5min×3次。

8、加入ECL顯色液，移入暗室進(jìn)行曝光顯色。

實驗分4組：正常對照組，H₂O₂模型組，20nM山奈酚+H₂O₂模型組，50nM山奈酚+H₂O₂模型組，結(jié)果如圖6A-圖6D。

Western blot結(jié)果顯示，如圖6A-圖6D所示，Bcl-2蛋白表達(dá)水平H₂O₂模型組低于正常對照組，而山奈酚保護(hù)組高于H₂O₂模型組(P＜0.01)，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平H₂O₂模型組高于正常對照組，而山奈酚保護(hù)組低于H₂O₂模型組(P＜0.01)；說明山奈酚保護(hù)H₂O₂誘導(dǎo)的ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷時，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)。

綜上可以得出，

1、山奈酚對氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，而對正常的ARPE-19細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性作用。并且與陽性對照藥物葉黃素相比其抗凋亡作用更強(qiáng)而且藥物有效濃度更低，從而說明山奈酚對RPE細(xì)胞損傷的保護(hù)作用更強(qiáng)，而且藥效較高，未來可能成為臨床上治療AMD的一種強(qiáng)有效的藥物。

2、山奈酚對H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷ARPE-19人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有抗凋亡保護(hù)作用，其可能通過增強(qiáng)Bcl-2基因和蛋白表達(dá)以及抑制Caspase-3的基因和蛋白發(fā)揮保護(hù)作用。