本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種pH響應(yīng)性肽基水凝膠及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水凝膠是由親水性三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與大量水構(gòu)成的獨特分散體系，能夠在水中溶脹而不溶解。它是一類非常重要的生物材料，在組織工程、藥物運輸、細胞粘附和生物傳感器等醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。智能水凝膠是一類能對外界刺激(例如溫度、酸度、溶劑、鹽濃度與光等)作出響應(yīng)的水凝膠。人體內(nèi)的不同部位包括病灶部位有著不同的酸度環(huán)境，pH已成為一種重要的生理刺激因素。pH響應(yīng)性的智能水凝膠藥物緩釋體系可增加藥物(如蛋白分子、化療藥物和抗生素等)的生物利用度，并減少毒副作用。

肽是由一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基縮合形成的兩性化合物，涉及生物體內(nèi)多種功能活性物質(zhì)。因具有獨特的生物活性及其結(jié)構(gòu)和功能上的多樣性和可調(diào)性，基于肽分子的水凝膠體系日益受到關(guān)注。肽分子具有合成快速簡潔、易于分子組裝及良好的生物相容性等優(yōu)點，已成為重要的自組裝構(gòu)筑單元，為生物材料的研發(fā)和制備提供了新的分子基礎(chǔ)?；陔姆肿拥闹悄芩z更是展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明的肽基水凝膠對酸、堿緩沖溶液均具有響應(yīng)性；其制備方法簡單、易操作。

本發(fā)明所提供的具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠，由生物肽、蛋白質(zhì)與交聯(lián)劑反應(yīng)制備得到。

所述生物肽為苯丙氨酸的二聚體，即二苯丙氨酸。

所述蛋白質(zhì)可為血紅蛋白、牛血清蛋白、人血清蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶中的一種。

所述交聯(lián)劑可為脂肪族二醛或含有二醛結(jié)構(gòu)的聚合物。

所述脂肪族二醛具體可為戊二醛或丁二醛；所述含有二醛結(jié)構(gòu)的聚合物具體可為氧化海藻酸鈉或氧化肝素。

生物肽、蛋白質(zhì)與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為1：2-50：1-10，具體可為1:4:2.65。

本發(fā)明所提供的具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠可緩釋蛋白質(zhì)分子。

本發(fā)明所提供的具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠的pH刺激條件為酸性條件下pH4.0-6.0，具體可為4.9；堿性條件下pH7.4-8.5，具體可為8.1。

本發(fā)明還提供了上述肽基水凝膠的制備方法，包括如下步驟：將生物肽溶液與交聯(lián)劑溶液及蛋白質(zhì)溶液混合，靜置后即得到所述具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠。

上述制備方法中，溶解所述生物肽的溶劑可為六氟異丙醇和/或二甲基亞砜；

所述生物肽溶液的濃度可為100mg/mL～250mg/mL，具體可為200mg/mL；

溶解所述蛋白質(zhì)的溶劑可為水和/或磷酸緩沖溶液；

所述蛋白質(zhì)溶液的濃度可為4mg/mL～70mg/mL，具體可為4mg/mL、16mg/mL、30mg/mL、60mg/mL；

溶解所述交聯(lián)劑的溶劑可選自水、乙醇和甲醇中的至少一種；

所述交聯(lián)劑溶液的質(zhì)量百分濃度可為0～25％，且不包括零，具體可為0.4％～0.12％、0.13％～0.30％、0.31％～0.50％；

所述靜置的時間可為12～48h，具體可為12～20h、22～30h或32～48h。

所述靜置的溫度可為0℃～40℃，具體可為4℃～10℃，15℃～26℃，28℃～40℃。

本發(fā)明還提供了上述具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠作為藥物釋放載體材料的應(yīng)用以及上述具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠在制備具有生物相容性的藥物載體材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠中，蛋白質(zhì)白既作為成膠因子，又作為具有生物活性的基元可以部分釋放出來(例如血紅蛋白，它自身就具有運載氧氣的作用)。另外一些抗癌藥物也可以通過物理封裝或是化學(xué)封裝的方法包載在其中。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明提供的制備水凝膠的方法，操作簡單。

(2)本發(fā)明的具有pH響應(yīng)的肽基水凝膠在酸性或堿性緩沖溶液中均可響應(yīng)釋放蛋白質(zhì)分子，且蛋白質(zhì)分子的生物活性依然存在。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1制備的二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠的掃描電鏡圖。

圖2為實施例1制備的二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠的流變學(xué)表征圖。

圖3為實施例1制備的二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠在pH 8.1、pH 4.9的緩沖溶液中轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z。

圖4為實施例1制備的二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠中血紅蛋白分子在pH 8.1、pH4.9的緩沖溶液及超純水中的累積釋放量。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所采用的二苯丙氨酸，即苯丙氨酸的二聚體的英文名為di-L-phenylalanine(Phe-Phe)，購自Sigma公司，貨號為P4126；血紅蛋白，英文名為Hemoglobin,購自Solarbio公司，貨號為H8020；戊二醛，英文名為Glutaraldehyde，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，貨號為30092438。

實施例1、二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠的制備

1)將1mg生物肽二苯丙氨酸溶于5μL六氟異丙醇中，得到生物肽二苯丙氨酸的六氟異丙醇溶液(又稱為溶液a)，濃度為200mg/mL，4℃存放24h以上使其充分溶解；

2)將50μL質(zhì)量濃度為25％的戊二醛溶液(質(zhì)量為53mg)通過超純水稀釋到5mL，得到溶液b，質(zhì)量濃度為0.25％；

3)將4mg血紅蛋白溶于250μL超純水中，得到溶液c；

4)將250μL溶液b(含有戊二醛2.65mg)加入到溶液a中敞口放置10s后，再加入溶液c，混合均勻后靜置12-48h即得到可釋放血紅蛋白分子的水凝膠。

實施例2、實施例1所得二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠的表征

本發(fā)明實施例1制備得到的二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠掃描電鏡表征：將二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠于凍干機中冷凍干燥24小時，取少量樣品通過導(dǎo)電膠固定于樣品臺，通過濺射儀向其表面噴灑Au顆粒后于HITACHI S-4800掃描電鏡顯微鏡下觀察，其加速電壓為10kV；結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，本發(fā)明所得到的水凝膠呈片狀堆積，在每一個片層之上有球狀凸起。

實施例3、實施例1中所得二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠的流變學(xué)表征

二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠的流變學(xué)表征：將水凝膠置于流變儀中，在25℃，掃描頻率0.1-100rad s-¹,扭轉(zhuǎn)張力為0.1％的條件下進行測試；結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，本發(fā)明得到的水凝膠儲能模量是損耗模量的4倍以上，證明其凝膠網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建完善。

實施例4、實施例1所得二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠的在酸堿緩沖溶液中的響應(yīng)性

1)將pH＝4.9的磷酸鹽緩沖溶液250μL加入到二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠中，靜置3h；

2)將pH＝8.1的磷酸鹽緩沖溶液250μL加入到二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠中，靜置3h；

3)將超純水250μL加入到二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠中，靜置3h；結(jié)果如圖3所示；

由圖3可知，在pH＝4.9的磷酸鹽緩沖溶液和pH＝8.1的磷酸鹽緩沖溶液中，二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠會轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z狀態(tài)，而在超純水中無變化。

實施例5、水凝膠中蛋白分子響應(yīng)性釋放

1)對本發(fā)明實施例1所得的二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠蛋白分子的釋放測試。

具體步驟如下：

將緩沖溶液250μL加入到二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠中，置于振蕩器上緩慢震蕩，在規(guī)定的時間點取出100μL上清液，同時加入100μL磷酸緩沖溶液，直至48h，對各時間點取出的上清液進行稀釋，釋放出的蛋白分子的量用UV-Vis光譜測定并結(jié)合蛋白分子的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。

蛋白分子的釋放分別于pH＝4.9、pH＝8.1的緩沖溶液和超純水中進行，其中在超純水中的過程作為對照組。將250μL磷酸緩沖溶液或超純水加入到二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠中，置于振蕩器上緩慢震蕩，在規(guī)定的時間點取出100μL上清液，同時加入100μL磷酸緩沖溶液或超純水，直至48h。

所得結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，二苯丙氨酸-血紅蛋白水凝膠可在酸性或堿性的條件下釋放蛋白分子，而在近中性條件中無蛋白分子釋放。