本專利得到國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21402141）和天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(青年項(xiàng)目)（15jcqnjc05400）資助。

本發(fā)明屬于納米超分子材料制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種透明質(zhì)酸酶調(diào)控的超分子納米粒子及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

超分子組裝體系因其在化學(xué)、生物和材料科學(xué)等領(lǐng)域有著諸多的潛在應(yīng)用價(jià)值而受到廣泛的關(guān)注，參見(jiàn)：1）b.-p.jiang,d.-s.guo,y.-c.liu,k.-p.wang,y.liu.acsnano.2014,8,1609?1618；2）y.-x.wang,y.-m.zhang,y.liu.j.am.chem.soc.2015,137,4543?4549。超分子組裝體對(duì)于外界刺激信號(hào)的響應(yīng)是否靈敏是其能否實(shí)現(xiàn)功能應(yīng)用的重要指標(biāo)，參見(jiàn)：1）a.mueller,d.f.o'brien.chem.rev.2002,102,727?757；2）d.m.vriezema,m.c.aragonès,j.a.a.w.elemans,j.j.l.m.cornelissen,a.e.rowan,r.j.m.nolte.chem.rev.2005,105,1445?1489；3）x.guo,f.c.szoka.acc.chem.res.2003,36,335?341。在眾多的外界刺激信號(hào)中，酶響應(yīng)信號(hào)不但是生物相容的，而且具有高的靈敏度和選擇性。此外，許多疾病都與酶的非正常表達(dá)有關(guān)，參見(jiàn)：1）p.k.buamah,a.w.skillen.clin.chem.1985,31,876?877；2）a.f.paszcuk,n.l.m.quint?o,e.s.fernandes,l.juliano,k.chapman,p.andrade-gordon,m.m.campos,n.vergnolle,j.b.calixto.eur.j.pharmacol.2008,581,204?215；3）z.lu,f.wu,x.miao,w.yu.clin.j.med.offic.2008,36,488?490，因而設(shè)計(jì)酶響應(yīng)的超分子組裝體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重大的意義和廣闊的應(yīng)用前景。目前，基于磺化杯芳烴和陽(yáng)離子客體的識(shí)別已經(jīng)成功構(gòu)筑了諸多酶響應(yīng)的超分子組裝體，參見(jiàn)：1）k.wang,d.-s.guo,m.-y.zhao,y.liu.chem.eur.j.2016,22,1475?1483；2）d.-s.guo,k.wang,y.-x.wang,y.liu.j.am.chem.soc.2012,134,10244?10250。然而，基于陰離子識(shí)別的酶響應(yīng)超分子組裝體的構(gòu)筑還鮮有報(bào)道。

透明質(zhì)酸鈉是廣泛存在于人體內(nèi)的生理活性物質(zhì),是由葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖組成的雙糖單位連接而成的一種高分子黏多糖。大量的臨床應(yīng)用結(jié)果表明,透明質(zhì)酸鈉對(duì)治療骨性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病效果明顯、安全，參見(jiàn)：1）t.nonaka,h.kikuchi,t.ikeda,y.okamoto,c.hamanishi,s.tanaka.j.rheumatol.2000,27,997?1004；2）m.goto,t.hanyu,t.yoshio,h.matsuno,m.shimizu,n.murata,s.shiozawa,t.matsubara,s.yamana,t.matsuda.clin.exp.rheumatol.2001,19,377?383。此外，在許多癌細(xì)胞表面，透明質(zhì)酸鈉受體過(guò)度表達(dá)，透明質(zhì)酸酶在癌細(xì)胞降解透明質(zhì)酸鈉的過(guò)程中起到重要作用，參見(jiàn)：1）a.g.bharadwaj,k.rector,m.a.simpson,j.biol.chem.2007,282,20561?20572；2）a.ouhtit,z.y.abdelmageed,m.e.abdraboh,t.f.lioe,m.h.g.raj,am.j.pathol.2007,171,2033?2039。因此，透明質(zhì)酸酶響應(yīng)的超分子組裝體在生物醫(yī)療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

杯吡啶是一類(lèi)富含吡啶陽(yáng)離子的環(huán)狀化合物，具有良好的水溶性以及和陰離子客體鍵合的潛能。該化合物可以以3-溴甲基吡啶為原料簡(jiǎn)便高效的進(jìn)行合成，參見(jiàn)：s.shinoda,m.tadokoro,h.tsukube,r.arakawa.chem.commun.1998,181?182。然而，基于杯吡啶陰離子識(shí)別的超分子組裝體的構(gòu)筑還未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)分析，提供一種透明質(zhì)酸酶調(diào)控的超分子納米粒子及制備方法和應(yīng)用，該超分子納米粒子系基于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉二元超分子組裝的納米粒子，透明質(zhì)酸鈉的存在可以誘導(dǎo)杯吡啶發(fā)生聚集從而形成二元超分子納米粒子；該超分子納米粒子具有很好的穩(wěn)定性，此外，該超分子納米粒子對(duì)透明質(zhì)酸酶具有良好的響應(yīng)性，可應(yīng)用于疏水藥物模型的負(fù)載和可控釋放，因而其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重大的意義和廣闊的應(yīng)用前景。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)內(nèi)容：

本發(fā)明公開(kāi)了一種透明質(zhì)酸酶調(diào)控的超分子納米粒子，其構(gòu)筑單元以杯吡啶為主體，以透明質(zhì)酸鈉為客體，通過(guò)主?客體包結(jié)配位相互作用構(gòu)筑超分子納米粒子；所述的超分子納米粒子的粒徑約為70nm；杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉的濃度分別為0.10mmol/l和1.40μmol/l。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種所述透明質(zhì)酸酶調(diào)控的超分子納米粒子的制備方法，將杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉分別溶解于水中，得到杯吡啶溶液和透明質(zhì)酸鈉溶液，將杯吡啶溶液逐滴加入到透明質(zhì)酸鈉溶液中，均勻混合后得到超分子納米粒子溶液目標(biāo)物，其中，超分子納米粒子溶液的ph值為6，杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉的濃度分別為0.10mmol/l和1.40μmol/l。

本發(fā)明更進(jìn)一步公開(kāi)對(duì)透明質(zhì)酸酶調(diào)控的超分子納米粒子解聚的制備方法：

將透明質(zhì)酸酶加入超分子納米粒子溶液中，控制溫度為37℃，作用21分鐘，即可使超分子納米粒子溶液中的超分子納米粒子幾乎完全解聚，其中透明質(zhì)酸酶在超分子納米粒子溶液中的濃度為1u/ml-10u/ml。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了透明質(zhì)酸酶調(diào)控的超分子納米粒子在疏水藥物模型負(fù)載和可控釋放方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：疏水藥物模型尼羅紅可以負(fù)載到上述超分子納米粒子中，在負(fù)載有疏水藥物模型的超分子納米粒子中加入透明質(zhì)酸酶，可使負(fù)載有疏水藥物模型的超分子納米粒子幾乎完全解聚，并全部釋放所負(fù)載的疏水藥物模型。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：基于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉二元超分子組裝構(gòu)筑的納米粒子，制備方法簡(jiǎn)便，主、客體原料用量少；該超分子納米粒子具有很好的穩(wěn)定性，對(duì)透明質(zhì)酸酶具有良好的響應(yīng)性，可應(yīng)用于疏水藥物模型的負(fù)載和可控釋放，因而其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重大的意義和廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為杯吡啶在水溶液中在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨其濃度變化的實(shí)驗(yàn)圖；

圖2為透明質(zhì)酸鈉在水溶液中在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨其濃度變化的實(shí)驗(yàn)圖；

圖3為在固定透明質(zhì)酸鈉的濃度為0.52μmol/l的水溶液中逐漸加入杯吡啶，體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨杯吡啶濃度變化的實(shí)驗(yàn)圖；

圖4為在固定杯吡啶的濃度為0.10mmol/l的水溶液中逐漸加入透明質(zhì)酸鈉，體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨透明質(zhì)酸鈉濃度變化的實(shí)驗(yàn)圖；

圖5為固定杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉的濃度分別為0.10mmol/l和1.40μmol/l時(shí)，該水溶液在700nm波長(zhǎng)處的透光率隨體系ph變化的實(shí)驗(yàn)圖；

圖6為杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉二元超分子組裝的納米粒子的高分辨透射電子顯微鏡圖像；

圖7為杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉二元超分子組裝的納米粒子的掃描電子顯微鏡圖像；

圖8為固定杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉的濃度分別為0.10mmol/l和1.40μmol/l時(shí)，該水溶液在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)圖；

圖9為往在最佳條件下構(gòu)筑的杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子體系中加入透明質(zhì)酸酶后（加入后透明質(zhì)酸酶的濃度分別為1u/ml，3u/ml和10u/ml），體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)圖；

圖10為往在最佳條件下構(gòu)筑的杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子體系中加入透明質(zhì)酸酶21分鐘后的高分辨透射電子顯微鏡圖像；

圖11為往在最佳條件下構(gòu)筑的杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子體系中加入透明質(zhì)酸酶21分鐘后的掃描電子顯微鏡圖像；

圖12為往在最佳條件下構(gòu)筑的杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子體系中加入透明質(zhì)酸酶和失活的透明質(zhì)酸酶后（加入后透明質(zhì)酸酶和失活的透明質(zhì)酸酶的濃度均為10u/ml），體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)圖；

圖13為尼羅紅水溶液中的尼羅紅和負(fù)載于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子中的尼羅紅在550nm波長(zhǎng)處的吸光度隨時(shí)間變化值（5分鐘時(shí)的吸光度減去10分鐘時(shí)的吸光度）的對(duì)比圖；

圖14為尼羅紅水溶液中的尼羅紅和加入透明質(zhì)酸酶后（加入后透明質(zhì)酸酶的濃度為10u/ml）負(fù)載于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子中的尼羅紅在550nm波長(zhǎng)處的吸光度隨時(shí)間變化的對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定。其中透明質(zhì)酸鈉購(gòu)自華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，分子量為77kda；透明質(zhì)酸酶（來(lái)源于牛睪丸）購(gòu)自sigma–aldrich公司；杯吡啶是以3-溴甲基吡啶為原料簡(jiǎn)便高效的進(jìn)行合成的，參見(jiàn)：s.shinoda,m.tadokoro,h.tsukube,r.arakawa.chem.commun.1998,181?182。

實(shí)施例1：

一種透明質(zhì)酸酶調(diào)控的超分子納米粒子，其特征在于：構(gòu)筑單元以杯吡啶為主體，以透明質(zhì)酸鈉為客體，通過(guò)主?客體包結(jié)配位相互作用構(gòu)筑超分子納米粒子。其制備方法如下：

（一）濃度、ph條件選擇

（1）圖1為杯吡啶在水溶液中在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨其濃度變化的實(shí)驗(yàn)圖，如圖1所示，杯吡啶自身在水溶液中在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨其濃度增加并不發(fā)生變化，表明杯吡啶自身在水溶液中不具有臨界聚集濃度，杯吡啶自身在水溶液中不能自聚集。圖2為透明質(zhì)酸鈉在水溶液中在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨其濃度變化的實(shí)驗(yàn)圖，如圖2所示，透明質(zhì)酸鈉自身在水溶液中在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨其濃度增加而逐漸下降，表明透明質(zhì)酸鈉自身在水溶液可以發(fā)生自聚集，由變化的拐點(diǎn)可以得到其臨界聚集濃度為120μmol/l；圖3為在固定透明質(zhì)酸鈉的濃度為0.52μmol/l的水溶液中（此濃度遠(yuǎn)低于透明質(zhì)酸鈉的臨界聚集濃度，因而透明質(zhì)酸鈉在該濃度下以單體存在，不發(fā)生聚集）逐漸加入杯吡啶，體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨杯吡啶濃度變化的實(shí)驗(yàn)圖，如圖3所示，隨著杯吡啶的加入，體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率先不變，后下降，表明透明質(zhì)酸鈉的存在可以誘導(dǎo)杯吡啶在水溶液中發(fā)生聚集，由變化的拐點(diǎn)可以得到在固定透明質(zhì)酸鈉的濃度為0.52μmol/l時(shí)，杯吡啶的臨界聚集濃度為31μmol/l。

（2）圖4為在固定杯吡啶的濃度為0.10mmol/l的水溶液中逐漸加入透明質(zhì)酸鈉，體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨透明質(zhì)酸鈉濃度變化的實(shí)驗(yàn)圖，如圖4所示，隨著透明質(zhì)酸鈉的加入，體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率先下降，后上升，由變化的拐點(diǎn)可以得到杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉在溶液中形成聚集體的最佳混合濃度分別為0.10mmol/l和1.40μmol/l。

（3）圖5為固定杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉的濃度分別為0.10mmol/l和1.40μmol/l時(shí)，該水溶液在700nm波長(zhǎng)處的透光率隨體系ph變化的實(shí)驗(yàn)圖，如圖5所示，隨著體系ph值的變化，體系在700nm波長(zhǎng)處的透光率先下降，后上升，由變化的拐點(diǎn)可以得到杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉在溶液中形成聚集體的最佳ph值為6。

（二）制備方法

（1）將杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉分別溶解于水中，得到杯吡啶溶液和透明質(zhì)酸鈉溶液，將杯吡啶溶液逐滴加入到透明質(zhì)酸鈉溶液中，均勻混合后得到超分子納米粒子溶液目標(biāo)物，其中，超分子納米粒子溶液的ph值為6，杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉的濃度分別為0.10mmol/l和1.40μmol/l。圖6為杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉二元超分子組裝的納米粒子的高分辨透射電子顯微鏡圖像；圖7為杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉二元超分子組裝的納米粒子的掃描電子顯微鏡圖像，如圖6、7所示，該超分子納米粒子的形貌為實(shí)心球形，粒徑約為70nm。

（2）圖8為固定杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉的濃度分別為0.10mmol/l和1.40μmol/l時(shí)，該水溶液在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)圖，如圖8所示，該體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率在長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間都不發(fā)生變化，表明該超分子聚集體具有很好的穩(wěn)定性。

（3）圖9為往在最佳條件下構(gòu)筑的杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子體系中加入透明質(zhì)酸酶后（加入后透明質(zhì)酸酶的濃度分別為1u/ml，3u/ml和10u/ml），體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)圖，如圖9所示，該體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間逐漸升高，表明加入透明質(zhì)酸酶后可以使超分子納米粒子逐漸解聚，且加入透明質(zhì)酸酶的濃度越高，體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間的變化速率越快，表明加入透明質(zhì)酸酶的濃度越高，超分子納米粒子解聚的速度越快。

（4）往在最佳條件下構(gòu)筑的杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子體系中加入透明質(zhì)酸酶21分鐘后的高分辨透射電子顯微鏡圖像和掃描電子顯微鏡圖像，如圖10、11所示，也證實(shí)了超分子納米粒子的完全解聚。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)：

圖12為往在最佳條件下構(gòu)筑的杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子體系中加入透明質(zhì)酸酶和失活的透明質(zhì)酸酶后（加入后透明質(zhì)酸酶和失活的透明質(zhì)酸酶的濃度均為10u/ml），控制溫度在37℃，體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)圖，如圖12所示，加入透明質(zhì)酸酶后體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間逐漸升高，表明加入透明質(zhì)酸酶后可以使超分子納米粒子逐漸解聚；而加入失活的透明質(zhì)酸酶后體系在350nm波長(zhǎng)處的透光率隨時(shí)間并不升高，表明加入失活的透明質(zhì)酸酶后并不能使體系中的超分子納米粒子解聚。

該對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明：透明質(zhì)酸酶使杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉組裝的超分子納米粒子解聚的原因是透明質(zhì)酸酶的活性導(dǎo)致的降解造成的，失活的透明質(zhì)酸酶實(shí)現(xiàn)不了該解聚。

實(shí)施例2

一種上述制備的透明質(zhì)酸酶調(diào)控的超分子納米粒子在疏水藥物模型尼羅紅負(fù)載和可控釋放方面的應(yīng)用，方法如下：

（1）將尼羅紅溶解于無(wú)水乙醇中后混合均勻得到溶液，制得尼羅紅乙醇液，所述尼羅紅的濃度為1.00mmol/l；將上述尼羅紅乙醇液溶解于水中，制得尼羅紅水溶液，所述尼羅紅的濃度為5.5μmol/l；將上述尼羅紅乙醇液、杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉溶解于水中后混合均勻，制得負(fù)載尼羅紅的超分子納米粒子，所述尼羅紅、杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉的濃度分別為5.5μmol/l、0.10mmol/l和1.40μmol/l。圖13為尼羅紅水溶液中的尼羅紅和負(fù)載于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子中的尼羅紅在550nm波長(zhǎng)處的吸光度隨時(shí)間變化值（5分鐘時(shí)的吸光度減去10分鐘時(shí)的吸光度）的對(duì)比圖，如圖13所示，尼羅紅水溶液中的尼羅紅在550nm波長(zhǎng)處的吸光度隨時(shí)間下降很大，表明疏水藥物模型尼羅紅在水中不穩(wěn)定，極易析出；而負(fù)載于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子中的尼羅紅在550nm波長(zhǎng)處的吸光度隨時(shí)間變化不大，表明疏水藥物模型尼羅紅穩(wěn)定負(fù)載于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子中。

（2）圖14為尼羅紅水溶液中的尼羅紅和加入透明質(zhì)酸酶后（加入后透明質(zhì)酸酶的濃度為10u/ml）負(fù)載于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子中的尼羅紅在550nm波長(zhǎng)處的吸光度隨時(shí)間變化的對(duì)比圖。如圖14所示，尼羅紅水溶液中的尼羅紅和剛加入透明質(zhì)酸酶后負(fù)載于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子中的尼羅紅因?yàn)樗幍沫h(huán)境不一樣，因而在550nm波長(zhǎng)處的吸光度相差很大；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，尼羅紅水溶液中的尼羅紅和加入透明質(zhì)酸酶后負(fù)載于杯吡啶和透明質(zhì)酸鈉超分子納米粒子中的尼羅紅在550nm波長(zhǎng)處的吸光度相差越來(lái)越小，最后趨于一樣，表明在透明質(zhì)酸酶作用下，隨著超分子納米粒子的解聚，負(fù)載的疏水藥物模型尼羅紅被全部釋放于水中。