【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及免疫誘導(dǎo)劑的制造方法。更具體而言，本發(fā)明涉及在其外殼中內(nèi)包抗原的含病毒樣粒子的免疫誘導(dǎo)劑的制造方法。

背景技術(shù)：

已知使用病毒樣粒子(viruslikeparticle)誘導(dǎo)細(xì)胞障礙性t細(xì)胞(ctl)可治療病毒性疾病或癌。

例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2014-0286978號(hào)中記載，通過免疫向sv40的vp1的環(huán)區(qū)域?qū)隿tl表位、使其表達(dá)而得到的病毒樣粒子而可誘導(dǎo)ctl表位特異性的ctl。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】

但是，在美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2014-0286978號(hào)中，由于必須要求表位整合入vp1的特定區(qū)域，只能使用表位公知的抗原。

【解決課題的技術(shù)方案】

本發(fā)明人經(jīng)銳意探討而發(fā)現(xiàn)，使用在其外殼中內(nèi)包抗原的病毒樣粒子也可誘導(dǎo)生物體的免疫反應(yīng)，從而完成本發(fā)明。

即，本發(fā)明提供含病毒樣粒子的免疫誘導(dǎo)劑，所述病毒樣粒子含病毒來(lái)源的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，所述外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成所述病毒樣粒子的外殼，所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)內(nèi)包于所述外殼內(nèi)，誘導(dǎo)生物體對(duì)所述抗原的免疫作用。

另外，本發(fā)明提供誘導(dǎo)生物體對(duì)抗原的免疫作用的含病毒樣粒子的免疫誘導(dǎo)劑的制造方法，其包括通過混合病毒來(lái)源的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，調(diào)制病毒樣粒子的工序，所述外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成所述病毒樣粒子的外殼，所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)內(nèi)包于所述外殼內(nèi)。

【發(fā)明效果】

本發(fā)明提供無(wú)論表位公知還是未知，可誘導(dǎo)對(duì)特定的抗原的生物體的免疫反應(yīng)的免疫誘導(dǎo)劑。

【附圖說(shuō)明】

【圖1】是病毒樣粒子的一例的模式圖。

【圖2a】是顯示在自被重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞純化而得到的vlp中存在vp2-m1及wtvp1的sds-page的照片。

【圖2b】是顯示形成vp2-m1/wtsv40vp1vlp的電子顯微鏡照片。

【圖2c】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被施用自昆蟲細(xì)胞純化的vp2-m1/wtsv40vp1vlp。

【圖3】是pm01載體的載體圖譜。

【圖4a】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被腹腔內(nèi)施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶蛹磨碎液(磷酸緩沖液酯)。

【圖4b】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被腹腔內(nèi)施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶蛹磨碎液(tris緩沖液基)。

【圖4c】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被腹腔內(nèi)施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的加熱處理蠶蛹磨碎液(磷酸緩沖液酯)。

【圖4d】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被腹腔內(nèi)施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的加熱處理蠶蛹磨碎液(tris緩沖液基)。

【圖5】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被經(jīng)鼻施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶蛹磨碎液(磷酸緩沖液酯)。

【圖6a】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被經(jīng)口施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶蛹磨碎液(磷酸緩沖液酯)。

【圖6b】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被經(jīng)口施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶蛹磨碎液(tris緩沖液基)。

【圖6c】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被經(jīng)口施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的加熱處理蠶蛹磨碎液(tris緩沖液基)。

【圖7】是顯示對(duì)從小鼠的脾臟得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的ics解析的結(jié)果的圖，其中所述小鼠被注腸施用含vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶蛹磨碎液(磷酸緩沖液酯)。

【圖8a】是顯示腹腔內(nèi)施用vp2-ova/wtsv40vp1vlp的小鼠的血清中的抗ova抗體產(chǎn)生測(cè)定的結(jié)果的圖。

【圖8b】是顯示經(jīng)鼻施用vp2-ova/wtsv40vp1vlp的小鼠的血清中的抗ova抗體產(chǎn)生測(cè)定的結(jié)果的圖。

【實(shí)施方式】

本實(shí)施方式的免疫誘導(dǎo)劑包含含有病毒來(lái)源的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的病毒樣粒子。

病毒樣粒子，如在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域公知一樣，是指通常無(wú)病毒基因組的結(jié)構(gòu)體。后述的外殼蛋白質(zhì)及殼內(nèi)肽可使用病毒來(lái)源的蛋白質(zhì)。

本實(shí)施方式的免疫誘導(dǎo)劑中所含的病毒樣粒子的一例的模式圖示于圖1。此模式圖所表示的病毒樣粒子有由外殼蛋白質(zhì)vp1構(gòu)成的外殼。外殼中內(nèi)包有融合了抗原的vp2。vp1、vp2均來(lái)源于sv40。

成為外殼蛋白質(zhì)及殼內(nèi)肽的來(lái)源的病毒的種類只要有至少1種外殼蛋白質(zhì)和至少1種殼內(nèi)肽，就不特別限定。作為病毒的種類，可舉出例如多瘤病毒屬病毒(含sv40(猿猴病毒40)、jc病毒、bk病毒等)、屬于乳頭瘤病毒科的病毒(含α、β、γ及μ乳頭瘤病毒屬病毒等)、屬于有尾噬菌體目管狀病毒科的病毒(含hk97病毒等)、屬于呼腸病毒科的病毒(含稻萎縮病毒(rdv)、藍(lán)舌病毒等)及屬于蕃茄叢矮病毒科的病毒(含番茄叢矮病毒(tbsv)等)等。病毒優(yōu)選為多瘤病毒屬的病毒，更優(yōu)選為sv40、jc病毒、bk病毒等，特別優(yōu)選為sv40。外殼蛋白質(zhì)和殼內(nèi)肽優(yōu)選來(lái)源于相同的病毒。

多瘤病毒屬(genus：polyomavirus)是指由國(guó)際病毒分類委員會(huì)(internationalcommitteeontaxonomyofviruses：ictv)于2014年公示的病毒分類中的一屬。

病毒分類中頻繁發(fā)生分類的再編或命名等的改變。從而，即使將來(lái)由ictv或以其為準(zhǔn)的學(xué)術(shù)的權(quán)威機(jī)關(guān)的分類而分類再編或命名等改變，只要是與2014年的ictv分類中的屬于多瘤病毒屬的各病毒分類于相同的屬(genus)的病毒，就包含在本說(shuō)明書中所說(shuō)的多瘤病毒屬病毒中。

另外，本領(lǐng)域中由于頻頻發(fā)現(xiàn)新種的病毒，在將來(lái)由ictv或以其為準(zhǔn)的學(xué)術(shù)權(quán)威機(jī)關(guān)公示的病毒分類中，屬于現(xiàn)在的多瘤病毒屬或與其相當(dāng)?shù)姆诸惤M的新種的病毒也包含在本說(shuō)明書中所說(shuō)的多瘤病毒屬病毒中。

多瘤病毒屬以外以上所舉的病毒的目(order)、科(family)、屬名等也基于2014年公示的ictv分類。對(duì)于這些的定義也應(yīng)與對(duì)多瘤病毒屬所述的相同。

外殼蛋白質(zhì)是指，構(gòu)成病毒樣粒子的外殼，并且構(gòu)成的外殼可內(nèi)包抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。其中，“外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成病毒樣粒子的外殼”是指外殼基本上由外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成。即，外殼可僅由外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成，或者也可在維持外殼的結(jié)構(gòu)的范圍內(nèi)由外殼蛋白質(zhì)及能與該外殼蛋白質(zhì)結(jié)合的肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成。例如，野生型sv40病毒的外殼由集合72個(gè)vp1五聚體單位而構(gòu)成，在構(gòu)成的外殼的內(nèi)側(cè)vp2及vp3作為襯里結(jié)合，但sv40的vp1，即使無(wú)vp2或vp3，也可僅由其構(gòu)成外殼。即，在本實(shí)施方式中，外殼蛋白質(zhì)，如sv40vp1一樣，是指可基本上僅由它們構(gòu)成外殼的蛋白質(zhì)。外殼蛋白質(zhì)可為至少含病毒來(lái)源的全長(zhǎng)氨基酸序列中對(duì)于外殼形成最低限必須的氨基酸序列的肽或蛋白質(zhì)，但優(yōu)選為有全長(zhǎng)氨基酸序列的蛋白質(zhì)。作為這樣的外殼蛋白質(zhì)，可舉出例如屬于多瘤病毒屬、乳頭瘤病毒科、有尾噬菌體目管狀病毒科、呼腸病毒科及蕃茄叢矮病毒科的病毒的外殼蛋白質(zhì)、更具體而言作為多瘤病毒屬病毒的sv40(猿猴病毒40)或jc病毒等的vp1、屬于乳頭瘤病毒科的病毒的l1、稻萎縮病毒(rdv)的p8等。作為至少含對(duì)于外殼形成最低限必須的氨基酸序列的肽或蛋白質(zhì)，可舉出例如番茄叢矮病毒(tbsv)來(lái)源的形成β-環(huán)結(jié)構(gòu)的24聚體的肽等。外殼蛋白質(zhì)更優(yōu)選為多瘤病毒屬病毒的外殼蛋白質(zhì)、再優(yōu)選為sv40、jc病毒、bk病毒等的外殼蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選為sv40vp1。外殼蛋白質(zhì)可為1種以上。

再者，如sv40的vp2或vp3一樣，雖然其是在野生型病毒中構(gòu)成其外殼的成員，但僅由它們無(wú)法構(gòu)成外殼的蛋白質(zhì)，在本實(shí)施方式中，可包含在以下說(shuō)明的“殼內(nèi)肽”中。但是，這不是指含如sv40的vp2或vp3一樣的“殼內(nèi)肽”的其他物質(zhì)從外殼的構(gòu)成要素被排除，這樣的其他物質(zhì)是構(gòu)成外殼的非必須的成員，或者可以任何形式與外殼的形成相關(guān)。

“內(nèi)包”是指抗原結(jié)合蛋白質(zhì)中的至少抗原存在于由外殼蛋白質(zhì)形成的外殼的內(nèi)側(cè)的狀態(tài)。

外殼蛋白質(zhì)沒必要與野生型病毒有完全相同的氨基酸序列，只要對(duì)于外殼形成無(wú)障礙，并且形成的外殼可內(nèi)包抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，也可有氨基酸序列變異。其中，氨基酸序列的變異是指，與野生型的序列比，氨基酸殘基之一或多個(gè)被取代、缺失、或者附加。外殼蛋白質(zhì)可由其自身集合化能而形成外殼，也可由宿主內(nèi)在的因子的作用而形成外殼。外殼蛋白質(zhì)可以單體原本的形式形成外殼，也可形成由多聚體構(gòu)成的外殼形成單位(殼粒)，其再集合而形成外殼。外殼蛋白質(zhì)優(yōu)選為2～10聚體、更優(yōu)選為3～5聚體的殼粒集合50～500個(gè)左右而形成外殼。外殼蛋白質(zhì)可為提?。兓烊坏牡鞍踪|(zhì)而得的，也可為由基因工程學(xué)方法等人工合成的。

外殼的形狀不特別限定。可為球狀，也可為管狀。外殼是，例如，正八面體～正二十面體的略球狀。

當(dāng)外殼由外殼蛋白質(zhì)的單體構(gòu)成時(shí)，構(gòu)成1個(gè)外殼的單體的數(shù)雖不特別限定，但可舉出優(yōu)選為100～1000個(gè)、更優(yōu)選為150～500個(gè)。

當(dāng)外殼由殼粒構(gòu)成時(shí)，構(gòu)成1個(gè)外殼的殼粒的數(shù)優(yōu)選為50～390個(gè)、更優(yōu)選為72～260個(gè)。

外殼的直徑雖不特別限定，但可舉出優(yōu)選為30～300nm、更優(yōu)選為45～200nm。

抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是抗原與殼內(nèi)肽的融合蛋白質(zhì)。抗原結(jié)合蛋白質(zhì)含期望的抗原的氨基酸序列和病毒來(lái)源的殼內(nèi)肽的氨基酸序列。殼內(nèi)肽只要構(gòu)成本實(shí)施方式的病毒樣粒子，就不特別限定。殼內(nèi)肽，在病毒來(lái)源的全長(zhǎng)氨基酸序列之中，至少含對(duì)于構(gòu)成本實(shí)施方式的病毒樣粒子必要的氨基酸序列。殼內(nèi)肽優(yōu)選有全長(zhǎng)氨基酸序列。作為殼內(nèi)肽，可舉出例如sv40(猿猴病毒40)或jc病毒等的vp2及vp3、屬于乳頭瘤病毒科的病毒的l2、rdv的p3等。所述的病毒來(lái)源的全長(zhǎng)氨基酸序列之中，作為至少含對(duì)于構(gòu)成本實(shí)施方式的病毒樣粒子必要的氨基酸序列的肽，可舉出例如由seqidno：8的氨基酸序列構(gòu)成的肽(具體而言由sv40的vp2及vp3上共同的vp1結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的肽)等。更優(yōu)選為，殼內(nèi)肽是有seqidno：9的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，再優(yōu)選為由seqidno：9或11的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)(具體而言，各自sv40的vp3及vp2；核酸序列各自示于seqidno：10及12)。殼內(nèi)肽可為1種以上。

殼內(nèi)肽可有與野生型病毒完全相同的氨基酸序列，只要構(gòu)成本實(shí)施方式的病毒樣粒子，氨基酸序列上也可有變異。殼內(nèi)肽可結(jié)合在外殼蛋白質(zhì)的內(nèi)側(cè)形成外殼的襯里，也可不與外殼蛋白質(zhì)結(jié)合而被外殼中內(nèi)包化，例如如rdv的p3一樣在外殼的內(nèi)側(cè)形成內(nèi)殼。再者，在使用這樣的形成內(nèi)殼的殼內(nèi)肽的實(shí)施方式中，只要存在于外殼內(nèi)，就使用“殼內(nèi)”的用語(yǔ)。另外，當(dāng)殼內(nèi)肽以外的物質(zhì)形成內(nèi)殼時(shí)，無(wú)論殼內(nèi)肽存在于內(nèi)殼內(nèi)及內(nèi)殼外之任一側(cè)，只要?dú)?nèi)肽存在于外殼內(nèi)，就說(shuō)成存在于“殼內(nèi)”。殼內(nèi)肽的一部分也可自外殼露出。在殼內(nèi)肽上也可附加例如用于確認(rèn)抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)的標(biāo)簽、例如flag標(biāo)簽等。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒是多瘤病毒屬sv40。在此實(shí)施方式中，外殼蛋白質(zhì)是vp1，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是vp2及/或vp3與抗原的融合蛋白質(zhì)。vp1被稱為主外殼蛋白質(zhì)、vp2及vp3被稱為次外殼蛋白質(zhì)。當(dāng)使用sv40的vp1以及vp2及/或vp3時(shí)，vp2及vp3結(jié)合在外殼蛋白質(zhì)vp1的內(nèi)側(cè)形成外殼的襯里。一般而言，由于病毒的外殼常被稱為外殼，如sv40的vp2及vp3等一樣與外殼形成相關(guān)的蛋白質(zhì)在廣義上也可被解釋為外殼蛋白質(zhì)。但是，在本實(shí)施方式中，將如sv40的vp1一樣其自體構(gòu)成外殼本身的蛋白質(zhì)稱為“外殼蛋白質(zhì)”。即，一般而言，即使是外殼蛋白質(zhì)或可被稱為外殼蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，有時(shí)也如sv40的vp2及vp3一樣，在本說(shuō)明書中被包含在“殼內(nèi)肽”中。在本實(shí)施方式中，通過使vp2及/或vp3結(jié)合抗原，可在使外殼中內(nèi)包抗原。

抗原的種類不特別限定，可例示多肽、糖鏈、核酸、脂質(zhì)等。但是，在本說(shuō)明書中，外殼蛋白質(zhì)及殼內(nèi)肽不包括在“抗原”中。在這些中，優(yōu)選多肽。作為抗原使用多肽時(shí)，可以基因工程學(xué)方式容易地生產(chǎn)含抗原和殼內(nèi)肽的融合蛋白質(zhì)。另外，作為抗原，優(yōu)選使用病原體來(lái)源的多肽。病原體來(lái)源的多肽可為全長(zhǎng)多肽，也可為含僅一部分的序列的多肽。例如，可舉出流感病毒的ha、na、m1、m2、np、ns1、ns2、pa、pb1、pb2、pb1-f2等，hiv的gag、pol、env、tat、nef、rev等，c型肝炎病毒(hcv)的e1、e2、core、ns2、ns3、ns4、ns5等，屬于乳頭瘤病毒科的病毒的e6、e7等，作為對(duì)于癌細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)的melan-a/mart-1、gp100、magea3、mage-a10、cea、her2/new、ny-e50-1、wt-1、htert等。在這些之中，優(yōu)選流感病毒的m1、np、ns1、pa、pb1、pb2、作為對(duì)癌細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)的her2/new、wt-1、mage-a3等。

抗原與殼內(nèi)肽結(jié)合至內(nèi)包在病毒樣粒子的外殼內(nèi)。以往、已知將抗原表位整合到在外殼蛋白質(zhì)形成外殼之時(shí)露出到所述外殼的外側(cè)的所述外殼蛋白質(zhì)中的部分的病毒樣粒子(具體而言，將表位整合到sv40vp1的de環(huán)或hi環(huán)的病毒樣粒子)(美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2014-0286978號(hào))。此時(shí)，如果整合的抗原表位的氨基酸長(zhǎng)過長(zhǎng)，則由于外殼結(jié)構(gòu)可破壞或有將表位整合到外殼蛋白質(zhì)的特定區(qū)域的必要等，所以現(xiàn)實(shí)中表位短(5～15個(gè)氨基酸左右)、并且只能使用其序列公知的抗原。一方面，在本實(shí)施方式中，由于在外殼中內(nèi)包抗原，與以往的將表位整合到外殼結(jié)構(gòu)中的方法比較，內(nèi)包有更長(zhǎng)的氨基酸長(zhǎng)的抗原變得可能，還可使用全長(zhǎng)的抗原。而且，能無(wú)需對(duì)抗原加佐劑地進(jìn)行免疫誘導(dǎo)。這是本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)的觀點(diǎn)。

抗原的尺寸只要可被外殼中內(nèi)包，就不特別限定?？乖某叽鐑?yōu)選為200～600氨基酸長(zhǎng)。

融合抗原和殼內(nèi)肽的方法不特別限定，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法、例如基因重組技術(shù)等?？乖蜌?nèi)肽可經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的1種以上的接頭、例如ggggs接頭融合。

本實(shí)施方式的免疫誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)針對(duì)被病毒樣粒子的外殼中內(nèi)包的抗原的生物體的免疫作用。其中，“誘導(dǎo)免疫作用”是指通過誘導(dǎo)抗體或細(xì)胞傷害性t細(xì)胞，活化生物體的免疫。例如，可舉出疾病(癌等)的發(fā)癥前或病原體(病毒等)的感染前對(duì)生物體施用而增強(qiáng)產(chǎn)生抗體的作用及/或誘導(dǎo)記憶ctl的作用，通過預(yù)防將來(lái)的疾病(作為預(yù)防疫苗使用)、向有疾病(癌、感染癥等)的生物體施用，誘導(dǎo)生物體的細(xì)胞傷害性t細(xì)胞(ctl)，治療疾病(為了免疫療法使用)等。

免疫誘導(dǎo)劑可作為病毒性疾病的預(yù)防或治療用疫苗或各種癌的預(yù)防或治療用疫苗使用。具體而言，免疫誘導(dǎo)劑可作為疾病、例如感染癥(流感、免疫缺陷綜合征、c型肝炎等)、癌(子宮頸癌、咽頭乳頭瘤等)、疣贅(尋常性疣贅、包含體疣贅、扁平疣贅等)、hpv關(guān)聯(lián)表皮樣囊腫、疣贅狀表皮發(fā)育異常癥、尖圭濕疣、鮑恩樣丘疹癥等的預(yù)防或治療用疫苗使用。

在免疫誘導(dǎo)劑中，病毒樣粒子可與本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的藥品添加物一同制劑化。作為這樣的藥品添加物，雖不限定，但可舉出賦形劑、潤(rùn)滑劑、結(jié)合劑、崩解劑、包被劑、膠囊基劑、塑化劑、著色劑、溶劑、穩(wěn)定劑、保存劑、緩沖劑、無(wú)痛化劑、基劑、乳化劑及懸浮化劑、此外矯味劑、甜味劑、吸附劑、溶解輔助劑、ph調(diào)節(jié)劑、增粘劑、張度劑、分散劑、防腐劑、濕潤(rùn)劑、著香劑、抗氧化劑等。

作為賦形劑，雖不限定，但可舉出例如甘露糖醇、白糖、葡萄糖、玉米淀粉、結(jié)晶纖維素、磷酸氫鈣等。

作為潤(rùn)滑劑，雖不限定，但可舉出例如硬脂酸鎂、滑石、膠體氧化硅等。

作為結(jié)合劑，雖不限定，但可舉出例如阿拉伯膠、羥丙基纖維素(hpc)、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、甲基纖維素(mc)、聚維酮(pvp)、聚乙烯基醇(pva)等。

作為崩解劑，雖不限定，但可舉出例如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯(lián)聚維酮、羧甲基淀粉鈉等。

作為包被劑，雖不限定，但可舉出白糖、滑石等的糖衣用包被劑、羧甲基乙基纖維素等的腸溶性包被劑、聚乙烯基乙縮醛二乙基氨基乙酸酯等的胃溶性包被劑等。

作為膠囊基劑，雖不限定，但可舉出明膠等。

作為塑化劑，雖不限定，但可舉出三醋汀、中鏈脂肪酸三甘油酯等。

作為著色劑，雖不限定，但可舉出食用焦油染料、色淀染料、三氧化二鐵等。

作為溶劑，雖不限定，但可舉出注射用水、滅菌純化水等的水性溶劑、植物油(含橄欖油、大豆油、芝麻油等)等的非水性溶劑等。

作為穩(wěn)定劑，雖不限定，但可舉出氮、二氧化碳等的惰性氣體、edta等的鰲合劑、l-抗壞血酸等的還原物質(zhì)等。

作為保存劑，雖不限定，但可舉出對(duì)羥基安息香酸酯、氯丁醇等。

作為緩沖劑，雖不限定，但可舉出檸檬酸、醋酸、磷酸等的鈉鹽等。

作為無(wú)痛化劑，雖不限定，但可舉出芐基醇、普魯卡因鹽酸鹽、葡萄糖等。

作為基劑，雖不限定，但可舉出可可脂、明膠等的栓劑用基劑及流動(dòng)石蠟、巴西棕櫚蠟等的軟膏用基劑等。

作為乳化劑，雖不限定，但可舉出阿拉伯膠、聚山梨酯、月桂基硫酸鈉等。

作為懸浮化劑，雖不限定，但可舉出阿拉伯膠、藻酸鈉、黃蓍膠、單硬脂酸鋁等。

免疫誘導(dǎo)劑由于其自身就有充分的免疫誘導(dǎo)效果，可不含佐劑，但也可含佐劑。當(dāng)免疫誘導(dǎo)劑含佐劑時(shí)，作為使用的佐劑，可舉出氫氧化鋁凝膠、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、百日咳菌佐劑、聚(i,c)、cpg-dna等。

免疫誘導(dǎo)劑可為固體制劑、半固體制劑、液狀制劑、注射劑、栓劑、此外本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的制劑形態(tài)的任何。作為具體的劑形，雖不限定，但可舉出例如片劑、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、錠劑、注射劑、液劑、酏劑、糖漿劑、檸檬水劑、栓劑、軟膏劑、懸浮劑、乳劑、搽劑、洗劑、經(jīng)皮吸收型制劑、貼附劑、泥敷劑、氣溶膠劑等。

液狀制劑通過，例如，自表達(dá)病毒樣粒子的宿主細(xì)胞提取病毒樣粒子，根據(jù)需要用適宜的溶劑稀釋而調(diào)制。

懸浮劑通過，例如，將表達(dá)病毒樣粒子的宿主細(xì)胞均化而得到的勻漿物純化，根據(jù)需要提取、純化、由溶劑稀釋等而調(diào)制。具體而言，當(dāng)以蠶等的鱗翅目昆蟲個(gè)體作為宿主時(shí)，可將表達(dá)病毒樣粒子的個(gè)體摩碎，粗純化而調(diào)制。

免疫誘導(dǎo)劑的施用途徑雖不特別限定，但可舉出例如經(jīng)口施用、經(jīng)粘膜施用(例如經(jīng)鼻施用、鼻內(nèi)施用、口腔施用及注腸施用等)、非經(jīng)口施用(例如腹腔內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、向組織的間隙的空間注射等)、經(jīng)皮施用等。即，本實(shí)施方式的免疫誘導(dǎo)劑不僅可由負(fù)擔(dān)大的注射等施用，還可由經(jīng)口攝取、點(diǎn)鼻藥施用、灌腸等負(fù)擔(dān)少的施用。例如，可通過將免疫誘導(dǎo)劑混入動(dòng)物的餌而作為動(dòng)物用疫苗使用。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)抗原的種類、施用對(duì)象的動(dòng)物種、施用對(duì)象的癥狀、年齡、體重、施用形態(tài)等適宜確定免疫誘導(dǎo)劑的施用量及施用次數(shù)，通常為0.01μg～100mg、優(yōu)選為0.1μg～50mg、更優(yōu)選為1.0μg～10mg，優(yōu)選將其數(shù)天～數(shù)月1次施用。

免疫誘導(dǎo)劑可以生物體、更具體而言人或人以外的動(dòng)物(人以外哺乳類、鳥類、爬行類等)作為施用對(duì)象。作為人以外的動(dòng)物，可舉出例如，牛、馬、豬、雞、狗、貓、小鼠、大鼠、兔、猴等。

本實(shí)施方式的免疫誘導(dǎo)劑從免疫誘導(dǎo)的觀點(diǎn)是含有藥理學(xué)有效的量的病毒樣粒子的醫(yī)藥組合物。病毒樣粒子可在施用時(shí)發(fā)生醫(yī)學(xué)上可容許的副作用，但優(yōu)選對(duì)于施用對(duì)象的動(dòng)物無(wú)病原性，不發(fā)生副作用。

本實(shí)施方式的免疫誘導(dǎo)劑可通過根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法調(diào)制病毒樣粒子，根據(jù)需要與醫(yī)藥上容許的賦形劑等混合而制劑化來(lái)制造。

病毒樣粒子的調(diào)制，例如，可通過混合病毒來(lái)源的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行。混合條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜設(shè)定。通過混合外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)被由外殼蛋白質(zhì)形成的外殼中內(nèi)包化。

在調(diào)制病毒樣粒子之前，可通過將編碼外殼蛋白質(zhì)的dna和編碼抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的dna轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，在所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述外殼蛋白質(zhì)和所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，由此取得所述外殼蛋白質(zhì)和所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的取得可由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法、例如基因重組等進(jìn)行。

宿主細(xì)胞只要對(duì)病毒樣粒子的形成無(wú)障礙，就不特別限定。宿主細(xì)胞選自例如昆蟲細(xì)胞(含如蠶一樣的昆蟲個(gè)體)、大腸桿菌、酵母、植物。宿主細(xì)胞優(yōu)選為昆蟲細(xì)胞、更優(yōu)選為鱗翅目昆蟲個(gè)體、再優(yōu)選為蠶。

當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外殼蛋白質(zhì)及抗原結(jié)合蛋白質(zhì)時(shí)，病毒樣粒子也可通過在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)接觸而調(diào)制?；蛘?，也可在對(duì)宿主細(xì)胞的均化、純化、提取等的制造過程中形成病毒樣粒子。

在宿主細(xì)胞內(nèi)形成的病毒樣粒子可根據(jù)需要回收?；厥辗椒m不特別限定，但可由本領(lǐng)域技術(shù)人員主要根據(jù)宿主細(xì)胞的種類而適宜選擇。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞或大腸桿菌細(xì)胞等時(shí)可由超聲波處理等的細(xì)胞溶解等、當(dāng)宿主細(xì)胞是鱗翅目昆蟲的蛹時(shí)可由磨碎等溶出病毒樣粒子，使用離心分離后回收上清的方法。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，首先向昆蟲細(xì)胞或昆蟲個(gè)體感染整合了編碼外殼蛋白質(zhì)的dna及編碼抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的dna的桿狀病毒。接下來(lái)，將昆蟲細(xì)胞或昆蟲個(gè)體超聲波處理或磨碎，其后離心分離或過濾而回收上清，由此可取得病毒樣粒子。或者，也可代替整合了編碼外殼蛋白質(zhì)的dna及編碼抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的dna的桿狀病毒而向宿主細(xì)胞感染整合了編碼外殼蛋白質(zhì)的dna的第1桿狀病毒及整合了編碼抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的dna的第2桿狀病毒。

病毒樣粒子可根據(jù)需要純化。作為純化方法，不特別限定，可舉出例如密度梯度離心分離、層析法等的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法等。

病毒樣粒子可根據(jù)需要加熱處理。作為加熱方法，不特別限定，可舉出例如將作為宿主細(xì)胞的蠶蛹在沸騰水中溫育的方法等。

制劑化可通過由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如將病毒樣粒子和適宜的藥品添加物混合，成型為期望的劑形，根據(jù)需要包被來(lái)進(jìn)行。

具體而言，將劑形作為固體制劑、例如片劑時(shí)，可通過例如將病毒樣粒子和適宜的賦形劑、結(jié)合劑及/或崩解劑混合，添加適宜的潤(rùn)滑劑而進(jìn)一步混合，將混合物打錠，根據(jù)需要包被等而制劑化。

當(dāng)將劑形作為注射劑或液狀制劑時(shí)，可通過例如將病毒樣粒子分散于適宜的溶劑，根據(jù)需要過濾或滅菌處理，填充到指定的容器等而制劑化。

將劑形作為軟膏劑時(shí)，例如，可通過將適宜的軟膏用基劑在附帶加溫裝置的混合機(jī)中溶融，停止加溫，低速混合至固化為軟膏狀，在馬上要固化前加病毒樣粒子，填充到指定的容器等而制劑化。

將劑形作為栓劑時(shí)，可通過例如將病毒樣粒子與預(yù)先低溫融解的適宜的栓劑用基劑混合，注到模板而冷卻而固化等來(lái)制劑化。

別的實(shí)施方式涉及用于誘導(dǎo)生物體的免疫作用的病毒樣粒子。更具體而言，涉及含病毒來(lái)源的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的，用于誘導(dǎo)生物體對(duì)所述抗原的免疫作用的病毒樣粒子，所述外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成所述病毒樣粒子的外殼，所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)內(nèi)包于所述外殼內(nèi)。

病毒樣粒子、病毒、外殼蛋白質(zhì)、外殼、抗原結(jié)合蛋白質(zhì)、抗原等如上所述。

本實(shí)施方式的病毒樣粒子可通過施用于生物體誘導(dǎo)生物體對(duì)被其外殼中內(nèi)包的抗原的免疫作用而作為病毒性疾病的預(yù)防或治療用疫苗或各種癌的預(yù)防或治療用疫苗使用。從而，所述的病毒樣粒子可作為疾病、例如感染癥(流感、hiv、c型肝炎等)、癌(子宮頸癌、咽頭乳頭瘤等)、疣贅(尋常性疣贅、包含體疣贅、扁平疣贅等)、hpv關(guān)聯(lián)表皮樣囊腫、疣贅狀表皮發(fā)育異常癥、尖圭濕疣、鮑恩樣丘疹癥等的預(yù)防或治療用疫苗使用。

從而，別的實(shí)施方式也可稱為涉及用于治療疾病的病毒樣粒子。更具體而言，本實(shí)施方式涉及含病毒來(lái)源的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的，用于治療疾病的病毒樣粒子，所述外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成所述病毒樣粒子的外殼，所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)內(nèi)包于所述外殼內(nèi)。

病毒樣粒子、病毒、外殼蛋白質(zhì)、外殼、抗原結(jié)合蛋白質(zhì)、抗原、疾病等如上所述。

另外，別的實(shí)施方式涉及誘導(dǎo)生物體的免疫作用的方法，其包括向生物體施用含病毒樣粒子的免疫誘導(dǎo)劑。更具體而言，本實(shí)施方式涉及誘導(dǎo)生物體的免疫作用的方法，其包括向生物體施用含病毒樣粒子的免疫誘導(dǎo)劑，所述病毒樣粒子含病毒來(lái)源的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，所述外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成所述病毒樣粒子的外殼，所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)內(nèi)包于所述外殼內(nèi)，誘導(dǎo)生物體對(duì)所述抗原的免疫作用。

病毒樣粒子、病毒、外殼蛋白質(zhì)、外殼、抗原結(jié)合蛋白質(zhì)、抗原、免疫誘導(dǎo)劑及其施用方法、生物體等如上所述。

另外，別的實(shí)施方式可涉及預(yù)防或治療疾病的方法，其包括向生物體施用含病毒樣粒子的免疫誘導(dǎo)劑。更具體而言，本實(shí)施方式涉及預(yù)防或治療疾病的方法，其包括向生物體施用含病毒樣粒子的免疫誘導(dǎo)劑，所述病毒樣粒子含病毒來(lái)源的外殼蛋白質(zhì)和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，所述外殼蛋白質(zhì)構(gòu)成所述病毒樣粒子的外殼，所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)內(nèi)包于所述外殼內(nèi)，誘導(dǎo)生物體對(duì)所述抗原的免疫作用。

病毒樣粒子、病毒、外殼蛋白質(zhì)、外殼、抗原結(jié)合蛋白質(zhì)、抗原、免疫誘導(dǎo)劑及其施用方法、生物體、疾病等如上所述。

另外，別的實(shí)施方式涉及免疫誘導(dǎo)劑用于誘導(dǎo)生物體對(duì)抗原的免疫作用的用途。

病毒樣粒子、病毒、外殼蛋白質(zhì)、外殼、抗原結(jié)合蛋白質(zhì)、抗原、免疫誘導(dǎo)劑及其施用方法、生物體、疾病等如上所述。

另外，別的實(shí)施方式涉及病毒樣粒子用于制造免疫誘導(dǎo)劑的用途。

病毒樣粒子、病毒、外殼蛋白質(zhì)、外殼、抗原結(jié)合蛋白質(zhì)、抗原、免疫誘導(dǎo)劑及其施用方法、生物體、疾病等如上所述。

以下，由實(shí)施例詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。

【實(shí)施例】

【實(shí)施例1：內(nèi)包vp2-m1的sv40vp1vlp的調(diào)制及經(jīng)其免疫導(dǎo)致的fmp:58-66表位特異性的細(xì)胞傷害性t細(xì)胞的誘導(dǎo)】

【表達(dá)野生型(wt：wildtype)猿猴病毒40(sv40)vp1的桿狀病毒的制作】

將wtsv40vp1基因(seqidno：1；氨基酸序列示于seqidno：2)插入pfastbac1質(zhì)粒(invitrogen)的sali位點(diǎn)及kpni位點(diǎn)。用得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化保持桿狀病毒基因組的大腸桿菌dh10bac(invitrogen)，調(diào)制整合了vp1的重組桿狀病毒基因組。用重組桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染sf-9細(xì)胞。在三天后回收其上清，作為含重組桿狀病毒的溶液。通過用此溶液的一部分再次感染sf-9細(xì)胞(invitrogen)，使重組桿狀病毒滴度升高。將其作為重組桿狀病毒的濃儲(chǔ)溶液。

【表達(dá)vp2融合m1蛋白質(zhì)的桿狀病毒的制作】

向編碼wtsv40vp2的氨基末端(n末端：aminoterminus)的密碼子的上游附加flag標(biāo)簽的編碼序列(seqidno：13)，再向其上游導(dǎo)入bamhi位點(diǎn)。另外，除wtsv40vp2的終止密碼子之外導(dǎo)入ecori位點(diǎn)。將得到的多核苷酸經(jīng)pfastbac1質(zhì)粒的bamhi位點(diǎn)、及ecori位點(diǎn)插入，制作含wtsv40vp2基因的質(zhì)粒。向編碼m1蛋白質(zhì)的n末端的密碼子的上游導(dǎo)入ggggsggggsggggs接頭(seqidno：3；核酸序列示于seqidno：14)的編碼序列，再向其上游導(dǎo)入ecori位點(diǎn)。另外，向m1蛋白質(zhì)編碼序列的下游附加終止密碼子，再向其下游導(dǎo)入sali位點(diǎn)。將得到的多核苷酸經(jīng)含所述的wtsv40vp2基因的質(zhì)粒的ecori位點(diǎn)、及sali位點(diǎn)導(dǎo)入，制作了在vp2編碼序列的下游保持融合m1編碼序列的基因的質(zhì)粒。

用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化保持桿狀病毒基因組的大腸桿菌dh10bac(invitrogen)，調(diào)制表達(dá)在wtsv40vp2上融合m1的蛋白質(zhì)vp2-m1(seqidno：4；核酸序列示于seqidno：5)的重組桿狀病毒基因組。將這些重組桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染到sf-9細(xì)胞。三天后回收其上清，作為含重組桿狀病毒的溶液。

通過使在上述得到的溶液的一部分再感染sf-9細(xì)胞，使重組桿狀病毒滴度升高。將其作為重組桿狀病毒的濃儲(chǔ)溶液。

【含vp2-m1的wtsv40vp1vlp的調(diào)制】

使整合了wtsv40vp1的重組桿狀病毒(m.o.i.(感染復(fù)數(shù))＝0.05～0.2)和整合了vp2-m1的桿狀病毒(m.o.i.＝0.015～0.06)，共感染接種了3×10⁷個(gè)sf-9細(xì)胞的15cm培養(yǎng)皿中(wtsv40vp1:vp2-m1＝1:0.3的感染比率(基于m.o.i.))。將其制成共計(jì)10個(gè)。感染3天后，回收接種到這10個(gè)皿的共計(jì)3×10⁸個(gè)sf-9細(xì)胞。用pbs(-)清洗后，使細(xì)胞再懸浮于10ml的vp1超聲波處理用緩沖液(20mmtris-hcl(ph7.9),1％(w/vol)脫氧膽酸)。其后，為了抑制內(nèi)在性的蛋白酶活性，加2mm苯甲基磺酰氟(最終濃度2μm)、及糜蛋白酶抑制素(最終濃度1μg/ml)、抑肽酶(最終濃度1μg/ml)、亮抑酶肽(最終濃度1μg/ml)、抗蛋白酶素(最終濃度1μg/ml)、胃酶抑素(最終濃度1μg/ml)，超聲波破碎。其后，以15,000rpm、于4℃離心分離5分鐘而分成上清和沉淀，將上清作為裂解物溶液。

向每個(gè)ultra-clear離心分離用管(14x89mm,beckmancoulter)以密度從高到低的順序覆蓋1.5ml的氯化銫密度梯度離心分離用的20％cscl溶液(20mmtris-hcl(ph7.9),20％(w/vol)氯化銫),30％cscl溶液(20mmtris-hcl(ph7.9),30％(w/vol)氯化銫),40％cscl溶液(20mmtris-hcl(ph7.9),40％(w/vol)氯化銫),50％cscl溶液(20mmtris-hcl(ph7.9),50％(w/vol)氯化銫)。進(jìn)而，再覆蓋包含含有vp2-m1的wtsv40vp1的裂解物溶液5ml。其后，以35,000rpm,3小時(shí),于4℃超離心分離(sw41tirotor,beckman)。

超離心分離后，將呈現(xiàn)在中央的白色條帶用23g,1ml的terumo注射器(0.60x32mm、terumo)回收。將此級(jí)分與37％cscl溶液(20mmtris-hcl(ph7.9),37％(w/vol)氯化銫)混合，移到ultra-clear離心分離用管(11x60mm,beckmancoulter)。其后，以50,000rpm、于4℃超離心分離20小時(shí)(sw60tirotor,beckman)。超離心分離后，將呈現(xiàn)在中央的白色條帶用23g,1ml的terumo注射器(0.60x32mm、terumo)回收。將此級(jí)分用pbs(-)的溶劑透析(slide-a-lyzerminidialysisunits,3,500mwco,thermoscientific)，將該級(jí)分以15,000rpm,于4℃離心分離5分鐘。將上清回收純化而作為含vp2-m1的wtsv40vp1vlp級(jí)分。將此級(jí)分用sds-page展開后，進(jìn)行cbb染色。結(jié)果得知，確實(shí)vp2-m1來(lái)源的條帶和wtsv40vp1vlp來(lái)源的條帶這2條被純化(圖2a)。另外，用電子顯微鏡觀察含在此級(jí)分中的內(nèi)包vp2-m1的wtsv40vp1vlp(vp2-m1/wtsv40vp1vlp)樣品。結(jié)果，可確認(rèn)由wtsv40vp1形成的vlp(圖2b)。提示在此vlp內(nèi)部?jī)?nèi)包有vp2-m1。

【vp2-m1/wtsv40vp1vlp的免疫】

以下的實(shí)驗(yàn)以c57bl/6作為背景，使用表達(dá)在hla-a*0201和h-2db的嵌合體上再融合人的β2m的基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(以下，hhd小鼠)。此小鼠由于敲除了小鼠的β2m及h-2db，從而認(rèn)為小鼠來(lái)源的i型mhc不露出到細(xì)胞表面。

對(duì)8周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠以腹腔內(nèi)的途徑免疫所述的100μl的vp2-m1/wtsv40vp1vlp(500μg/ml)。在免疫中，使用插入27號(hào)的針的1ml的注射器(微注射器、注射針附帶注射器、胰島素用、terumo,ss-10m2713)。或者，對(duì)實(shí)施全身麻醉的8周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠以點(diǎn)鼻施用的經(jīng)鼻途徑投入40μl的vp2-m1/wtsv40vp1vlp(500μg/ml)。

投入后1周后，回收免疫的小鼠的脾臟。用下述的方法調(diào)制淋巴細(xì)胞，進(jìn)行下述的細(xì)胞內(nèi)染色(ics)解析。

【來(lái)自小鼠的脾臟的淋巴細(xì)胞的調(diào)制】

從免疫的小鼠摘出脾臟，置于放入5ml的rpmi-1640培養(yǎng)基的皿。使用鑷子將脾臟在培養(yǎng)基內(nèi)良好解離，將含溶出到培養(yǎng)基中的淋巴細(xì)胞的溶液移到15ml管中。再一次、將皿用5ml的rpmi-1640培養(yǎng)基清洗。將上清加到所述的15ml管中，總量設(shè)為10ml。立即將沉積在15ml管的底的組織片段留下，將上清再移到新的15ml管中。其后，于室溫、以1,200rpm離心分離5分鐘，得到含淋巴細(xì)胞的沉淀。除去上清，將沉淀疏解。其后，為了除去紅細(xì)胞，邊加250μl的nh4cl-三溶液邊混合。其后，快速加10ml的rpmi-1640培養(yǎng)基，于室溫、以1,2000rpm離心分離5分鐘，得到含淋巴細(xì)胞的沉淀。除去上清，將沉淀疏解。其后，再加10ml的rpmi-1640培養(yǎng)基。盡可能不吸變性的紅細(xì)胞而用移液器將含淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基移到新的15ml管中。其后，再于室溫、以1,200rpm離心分離5分鐘。除去上清之后，將沉淀疏解。再一次用10ml的rpmi-1640培養(yǎng)基懸浮，于室溫、以1,200rpm離心分離5分鐘。除去上清，最后用2ml的混入10％fcs的rpmi-1640培養(yǎng)基懸浮。為了數(shù)淋巴細(xì)胞而向490μl的2％醋酸溶液加10μl的所述懸浮溶液。用burker-turk血細(xì)胞計(jì)數(shù)板算出細(xì)胞數(shù)。用混入10％fcs的rpmi-1640培養(yǎng)基稀釋至成1×10⁷細(xì)胞/ml。

【細(xì)胞內(nèi)染色(ics)解析】

對(duì)小鼠免疫后，為了研究在自脾臟回收的淋巴細(xì)胞中存在與m1的ctl表位序列(gilgfvftl)反應(yīng)而誘導(dǎo)的ctl，進(jìn)行ics解析。向96孔圓底板每1孔加5μl用混入10％fcs的rpmi-1640培養(yǎng)基25倍稀釋的bdgolgiplug(商標(biāo))(bd)。向其中再加100μl用混入10％fcs的rpmi-1640培養(yǎng)基稀釋的20μm的m1的ctl表位的肽(gilgfvftl,operon)。作為陰性對(duì)照，加100μl不含肽的混入10％fcs的rpmi-1640培養(yǎng)基。向此孔加100μl上述調(diào)制的淋巴細(xì)胞。其后，于37℃、5％co2溫育5小時(shí)。

溫育后，于4℃、以1,400rpm旋轉(zhuǎn)沉降而除去上清，用渦旋混合器疏解細(xì)胞。其后，每1孔加200μl的facs緩沖液(2％fcs,0.1％疊氮化鈉,1×pbs(-))。再于4℃、以1,400rpm旋轉(zhuǎn)沉降而除去上清，將細(xì)胞疏解。其后，加100μl用facs緩沖液稀釋成5μg/ml的小鼠bdfcblock(商標(biāo))(bdpharmingen)，于4℃溫育10分鐘。

溫育后，于4℃、以1,400rpm旋轉(zhuǎn)沉降而除去上清，將細(xì)胞疏解。其后，每1孔加200μl的facs緩沖液，再于4℃、1,400rpm旋轉(zhuǎn)沉降而除去上清。再一次由facs緩沖液進(jìn)行清洗操作。向疏解的細(xì)胞每1孔加50μl用facs緩沖液稀釋成10μg/ml的fitc大鼠抗-小鼠cd8aclone：53-6.7(bdpharmingen)，于4℃在暗處溫育30分鐘。

溫育后，用200μl的facs緩沖液進(jìn)行2次清洗操作。其后，向疏解的細(xì)胞每1孔加100μl的bdcytofix/cytoperm(商標(biāo))(bdbiosciences)，于4℃在暗處溫育20分鐘。溫育后，代替facs緩沖液而使用200μl的1×bdperm/wash(商標(biāo))(bdbiosciences)，進(jìn)行2次與上述同樣的清洗操作。其后，向疏解的細(xì)胞加50μl用1×bdperm/wash(商標(biāo))稀釋成10μg/ml的pe抗-小鼠ifn-γclone：xmg1.2(biolegend)，于4℃在暗處溫育30分鐘。

溫育后，使用200μl的1×bdperm/wash(商標(biāo))進(jìn)行2次與上述同樣的清洗操作。其后，向疏解的細(xì)胞每1孔加100μl的facs固定緩沖液(1％甲醛,1×facs緩沖液)，于4℃在暗處溫育一晚。

溫育后，向5ml的聚苯乙烯管(bdfalcon,5ml聚苯乙烯圓底管12x75mmstyle)加400μl的facs緩沖液。向其中加用100μl的facs固定緩沖液固定的樣品。其后，用facscan(bd)進(jìn)行斑點(diǎn)印跡解析。在解析中使用cellquest(bd)的軟件。ics的2維解析的結(jié)果示于圖2c。

ics解析的結(jié)果，腹腔內(nèi)(i.p.)途徑的免疫和經(jīng)鼻途徑的免疫均fmp:58-66肽添加依賴性地出現(xiàn)cd8+ifn-γ+t細(xì)胞。因此得知，確實(shí)由vp2-m1/wtsv40vp1vlp免疫而誘導(dǎo)m1蛋白質(zhì)中所含的fmp:58-66表位特異性的細(xì)胞傷害性t細(xì)胞(ctl：細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞)(圖2c)。

這些結(jié)果顯示，將自昆蟲細(xì)胞純化的vp2-m1/wtsv40vp1vlp經(jīng)腹腔內(nèi)途徑或經(jīng)鼻施用給hhd小鼠，則可誘導(dǎo)m1ctl表位特異性ctl。

【實(shí)施例2：通過vp2-m1、及sv40野生型vp1共表達(dá)的蠶蛹磨碎液的免疫(腹腔內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)口、注腸施用)誘導(dǎo)fmp:58-66表位特異性的細(xì)胞傷害性t細(xì)胞的】

【共表達(dá)vp2-m1和wtsv40vp1的蠶蛹磨碎液的調(diào)制】

將wtsv40vp1基因片段整合入pm01載體(sysmex株式會(huì)社；在圖3示載體圖譜)的多克隆位點(diǎn)(限制性內(nèi)切酶smai)。將得到的質(zhì)粒構(gòu)建體稱為wtsv40vp1_pm01。

再將vp2-m1基因整合入pm01載體(sysmex株式會(huì)社)的多克隆位點(diǎn)(限制性內(nèi)切酶smai)。將得到的質(zhì)粒構(gòu)建體稱為vp2-m1_pm01。

重組桿狀病毒的制作通過改變maeda等的方法(inverterbratecellsystemandapplications,vol.1,p.167-181,crcpress,bocaraton(1989))而進(jìn)行。具體而言，將所述的質(zhì)粒構(gòu)建體wtsv40vp1_pm01、或者vp2-m1_pm01(各50ng)和直鏈化的cpd桿狀病毒(半胱氨酸蛋白酶缺損病毒株、sysmex)的dna(20ng)使用脂轉(zhuǎn)染試劑(x-tremegene9dnatransfectionreagent：roche公司)共轉(zhuǎn)染到bmn細(xì)胞(maeda,1989)。確認(rèn)感染跡象之后，回收培養(yǎng)上清。由此得到整合wtsv40vp1基因或者vp2-m1的重組桿狀病毒。

向蠶蛹(品種：錦秋鐘和,自上田蠶種公司購(gòu)入蠶卵，由sysmex株式會(huì)社人工飼育至蛹)接種重組桿狀病毒。自病毒接種起6天后回收蛹而于-80℃冷凍。

向5只冷凍的蛹、或者5只自冷凍狀態(tài)起在沸騰水中溫育10分鐘的蛹的每只加25ml的tris緩沖液(20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl,1mmedta,1mmegta,10％(w/v)甘油,1mmdtt,蛋白酶抑制劑混合物(roche公司complete-edta-free))、或者磷酸緩沖液(137mmnacl,2.7mmkcl,8.1mmna2hpo4,1.47mmkh2po4(ph7.4))。使用均漿器(elmex,型式sh-iim,槳式破碎)將蛹破碎而得到懸浮液。通過將此懸浮液用網(wǎng)過濾而除去蛹表皮等的殘?jiān)?，將此濾液作為蠶蛹磨碎液。

【(腹腔內(nèi)施用)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的免疫】

向8周齡的hhd小鼠通過腹腔內(nèi)途徑免疫100μl從使表達(dá)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶調(diào)制的磨碎液(用磷酸緩沖液調(diào)制的蠶蛹磨碎液(圖4a)、用tris緩沖液調(diào)制的蠶蛹磨碎液(圖4b)、用磷酸緩沖液調(diào)制的加熱處理蠶蛹磨碎液(圖4c)、及用tris緩沖液調(diào)制的加熱處理蠶蛹磨碎液(圖4d))。在免疫中使用插27號(hào)針的1ml的注射器(微注射器、注射針附帶注射器、胰島素用、terumo,ss-10m2713)。

投入后1周后，回收免疫的小鼠的脾臟。用實(shí)施例1中記載的方法調(diào)制淋巴細(xì)胞而進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色(ics)解析。

ics解析的結(jié)果，在i.p.免疫中，fmp:58-66肽添加依賴性地確認(rèn)cd8+ifn-γ+t細(xì)胞的出現(xiàn)(圖4a～4d)。從這些結(jié)果得知，通過從使表達(dá)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶蛹調(diào)制的磨碎液的i.p.免疫而誘導(dǎo)m1蛋白質(zhì)中所含的fmp:58-66表位特異性的細(xì)胞傷害性t細(xì)胞(ctl：細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞)。此ctl的誘導(dǎo)與有無(wú)蛹的加熱處理無(wú)關(guān)地，還與調(diào)制中使用的緩沖液的種類(tris緩沖液或磷酸緩沖液)無(wú)關(guān)地被檢測(cè)到。

【(經(jīng)鼻施用)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的免疫】

向?qū)嵤┤砺樽淼?周齡的hhd小鼠以點(diǎn)鼻施用的經(jīng)鼻途徑投入從使表達(dá)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶調(diào)制的磨碎液20μl。自投入起1周后，回收免疫的小鼠的脾臟。用實(shí)施例1中記載的方法調(diào)制淋巴細(xì)胞而進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色(ics，intra-cellularstaining)解析。

ics解析的結(jié)果，在經(jīng)鼻免疫中，以fmp:58-66肽添加依賴性地出現(xiàn)cd8+ifn-γ+t細(xì)胞(圖5)。因此得知，確實(shí)由vp2-m1/wtsv40vp1vlp的經(jīng)鼻免疫誘導(dǎo)了m1蛋白質(zhì)中所含的fmp:58-66表位特異性的細(xì)胞傷害性t細(xì)胞(ctl：細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞)。

【(經(jīng)口施用)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的免疫】

向?qū)嵤┤砺樽淼?周齡的hhd小鼠以經(jīng)口途徑投入使表達(dá)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶磨碎液(用磷酸緩沖液調(diào)制的非加熱蠶蛹磨碎液100μl(圖6a)、用tris緩沖液調(diào)制的非加熱蠶蛹磨碎液100μl(圖6b)、及用tris緩沖液調(diào)制的加熱處理蠶蛹磨碎液100μl(圖6c))。在投入中使用插了經(jīng)口探測(cè)器(經(jīng)口探測(cè)器針小鼠用(a),夏目制造,kn-348)的1ml的注射器(terumo)。自投入起1周后，回收免疫的小鼠的脾臟。用實(shí)施例1中記載的方法調(diào)制淋巴細(xì)胞而進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色(ics)解析。

所述ics解析的結(jié)果，在經(jīng)口免疫中，以fmp:58-66肽添加依賴性地出現(xiàn)cd8+ifn-γ+t細(xì)胞(圖6a～6c)。因此得知，確實(shí)由含進(jìn)行非加熱或加熱處理的vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶磨碎液的經(jīng)口免疫而誘導(dǎo)了m1蛋白質(zhì)中所含的fmp:58-66表位特異性的細(xì)胞傷害性t細(xì)胞(ctl：細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞)。

【(注腸施用)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的免疫】

向?qū)嵤┤砺樽淼?周齡的hhd小鼠以注腸途徑投入100μl、或者200μl的使表達(dá)vp2-m1/wtsv40vp1vlp的蠶磨碎液。在投入中使用插了經(jīng)口探測(cè)器(disposable經(jīng)口探測(cè)器、小鼠用減菌濟(jì)、5200s,fuchigami)的1ml的注射器(terumo)。

自投入起1周后，回收免疫的小鼠的脾臟。用實(shí)施例1中記載的方法調(diào)制淋巴細(xì)胞而進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色(ics)解析。

ics解析的結(jié)果，在注腸免疫中，以fmp:58-66肽添加依賴性地出現(xiàn)cd8+ifn-γ+t細(xì)胞(圖7)。因此得知，確實(shí)由vp2-m1/wtsv40vp1vlp免疫而誘導(dǎo)了m1蛋白質(zhì)中所含的fmp:58-66表位特異性的細(xì)胞傷害性t細(xì)胞(ctl：細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞)。

【實(shí)施例3：由內(nèi)包vp2-卵清蛋白(ovalbmin,ova)的wtsv40vp1vlp的免疫誘導(dǎo)抗ova抗體產(chǎn)生】

【表達(dá)野生型(wt：野生型)猿猴病毒40(sv40)vp1的桿狀病毒的制作】

如實(shí)施例1中記載制作表達(dá)wtsv40vp1的桿狀病毒。

【表達(dá)vp2融合ova蛋白質(zhì)的桿狀病毒的制作】

首先，在編碼wtsv40vp2的氨基末端(n末端：aminoterminus)的密碼子的上游附加flag標(biāo)簽的編碼序列(seqidno：13)而再在其上游導(dǎo)入bamhi位點(diǎn)。另外，除去wtsv40vp2的終止密碼子而導(dǎo)入ecori位點(diǎn)。將得到的多核苷酸經(jīng)pfastbac1質(zhì)粒的bamhi位點(diǎn)、及ecori位點(diǎn)插入，制作含wtsv40vp2基因的質(zhì)粒。向編碼ova蛋白質(zhì)的n末端的密碼子的上游導(dǎo)入ggggsggggsggggs接頭(seqidno：3；核酸序列示于seqidno：14)的編碼序列，再在其上游導(dǎo)入ecori位點(diǎn)。另外，在ova蛋白質(zhì)編碼序列的下游附加終止密碼子，在再其下游導(dǎo)入sali位點(diǎn)。將得到的多核苷酸經(jīng)含所述的wtsv40vp2基因的質(zhì)粒的ecori位點(diǎn)、及sali位點(diǎn)導(dǎo)入，制作保持了在vp2編碼序列的下游融合ova編碼序列的基因的質(zhì)粒。

用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化保持了桿狀病毒基因組的大腸桿菌dh10bac(invitrogen)，調(diào)制表達(dá)在wtsv40vp2上融合ova的蛋白質(zhì)vp2-ova(seqidno：6；核酸序列示于seqidno：7)的重組桿狀病毒基因組。向sf-9細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組桿狀病毒基因組。三天后回收其上清，作為含重組桿狀病毒的溶液。通過用此溶液的一部分再感染sf-9細(xì)胞，升高重組桿狀病毒滴度。將其作為重組桿狀病毒的濃儲(chǔ)溶液。

【含vp2-ova的wtsv40vp1vlp的調(diào)制】

用與實(shí)施例1的“含vp2-m1的wtsv40vp1vlp的調(diào)制”相同的方法調(diào)制含vp2-ova的wtsv40vp1vlp。

【vp2-ova/wtsv40vp1vlp的免疫(腹腔內(nèi)施用、及經(jīng)鼻施用)】

向8周齡的hhd小鼠以腹腔內(nèi)的途徑免疫所述的100μlvp2-ova/wtsv40vp1vlp(500μg/ml)。在免疫中使用插了27號(hào)的針的1ml的注射器(微注射器、注射針附帶注射器、胰島素用、terumo,ss-10m2713)。另外，作為vp2-ova/wtsv40vp1vlp免疫的對(duì)象組，向小鼠的皮下接種100μlova溶液(1mg/ml)。

或者，向?qū)嵤┤砺樽淼?周齡的hhd小鼠以點(diǎn)鼻施用的經(jīng)鼻途徑投入40μlvp2-ova/wtsv40vp1vlp(500μg/ml)。

自免疫起1周后進(jìn)行追加免疫。自初次免疫起2周后對(duì)小鼠進(jìn)行全身麻醉之后，從小鼠心臟回收血液。在得到的血液中誘導(dǎo)血餅形成，回收上清的小鼠血清。

【由免疫誘導(dǎo)的抗體的檢測(cè)(elisa法)】

為了與ova反應(yīng)而確認(rèn)在血清中存在誘導(dǎo)的抗ova抗體，使用如上所述回收的小鼠血清，如以下一樣進(jìn)行抗體檢測(cè)。將ova溶解于tbs(20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl)至成1μg/100μl。將其向96孔板(nuncmaxisorpflat-bottom96wellplate)的各孔各添加100μl。于室溫靜置2小時(shí)、或者于4℃靜置一晚，使ova與板底面結(jié)合。ova固定化后，用tbs-t(20mmtris-hcl(ph8.0),150mmnacl、0.005％(w/v)tween20)清洗板。其后，向各孔各添加300μl的5％(w/v)脫脂乳溶液，于室溫靜置2小時(shí)、或者于4℃靜置一晚。除去脫脂乳溶液之后，用tbs-t清洗各孔。向各50μl各孔添加將如上述得到的小鼠血清用tbs-t稀釋至期望的濃度的溶液而于室溫靜置1小時(shí)。去除小鼠血清溶液，用tbs-t清洗各孔。其后，向各孔添加各100μl用tbs-t稀釋2,000倍的hrp標(biāo)記抗小鼠igg(h+l鏈)(mbl公司)而于室溫靜置1小時(shí)。靜置后，將各孔用tbs-t清洗。根據(jù)試劑盒所附說(shuō)明書向各孔添加tmb過氧化酶eia復(fù)合物底物試劑盒(bio-rad公司)，測(cè)定各孔中存在的hrp標(biāo)記抗小鼠igg(h+l鏈)。再者，測(cè)定是使用imarkmicroplateabsorbancereader(biorad公司)測(cè)定655nm的吸光值。

結(jié)果示于圖8a及圖8b。如圖8a所示，在腹腔內(nèi)施用vp2-ova/sv40wtvp1vlp的小鼠中誘導(dǎo)了抗ova抗體的產(chǎn)生，顯示比單獨(dú)施用ova的小鼠更高的抗體價(jià)。也在經(jīng)鼻施用vp2-ova/sv40wtvp1vlp的小鼠中見到抗ova抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)(圖8b)。這些結(jié)果顯示，可由vp2-ova/sv40wtvp1vlp的腹腔內(nèi)施用或經(jīng)鼻施用而誘導(dǎo)對(duì)于ova特異性的抗體的產(chǎn)生。

?序列表

<110>sysmexcorporation

saitamamedicaluniversity

hiroshihanda

<120>免疫誘導(dǎo)劑的制造方法

<130>15-045cn

<150>jp2015-234206

<151>2015-11-30

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1095

<212>dna

<213>多瘤病毒屬（polyomavirus）sv40

<400>1

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aaggaaccagtgcaagtgccaaagctcgtcataaaaggaggaatagaagttctaggagtt120

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cctgatgaacatcaaaaaggcttaagtaaaagcttagcagctgaaaaacagtttacagat240

gactctccagacaaagaacaactgccttgctacagtgtggctagaattcctttgcctaat300

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aacacagcaaccacagtgcttcttgatgagcagggtgttgggcccttgtgcaaagctgac780

agcttgtatgtttctgctgttgacatttgtgggctgtttaccaacacttctggaacacag840

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ccctacccaatttcctttttgttaagtgacctaattaacaggaggacacagagggtggat960

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gaggagcttcctggggatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccaca1080

actagaatgcagtga1095

<210>2

<211>364

<212>prt

<213>多瘤病毒屬（polyomavirus）sv40

<400>2

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151015

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<213>人工序列

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<210>4

<211>638

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<213>人工序列

<220>

<223>經(jīng)gs接頭與m1融合的vp2蛋白

<400>4

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151015

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glnmetalaglysersergluglnalaalaglualametgluvalala

580585590

serglnalaargglnmetvalglnalametargthrileglythrhis

595600605

proserserseralaglyleulysasnaspleuleugluasnleugln

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<211>1917

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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lyslysarglysleuserargglyserserglnlysthrlysglythr

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serglupheglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglygly

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lysaspserthrargthrglnileasnlysvalvalargpheasplys

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leuproglypheglyaspserileglualaglncysglythrserval

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asnaspvaltyrserpheserleualaserargleutyralagluglu

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arggluleuileasnsertrpvalgluserglnthrasnglyileile

530535540

argasnvalleuglnproserservalaspserglnthralametval

545550555560

leuvalasnalailevalphelysglyleutrpglulysalaphelys

565570575

aspgluaspthrglnalametpropheargvalthrgluglngluser

580585590

lysprovalglnmetmettyrglnileglyleupheargvalalaser

595600605

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610615620

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<213>人工序列

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<213>多瘤病毒屬（polyomavirus）sv40

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proglyvalglnthrphevalhisservalglntyrleuaspproarg

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aaatttgaggctcctggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgccttta540

cttctaggcctgtacggaagtgttacttctgctctaaaagcttatgaagatggccccaac600

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65707580

alaalaleuleuglnthrvalthrglyvalseralavalalaglnval

859095

glytyrargphepheserasptrpasphislysvalserthrvalgly

100105110

leutyrglnglnproglymetalavalaspleutyrargproaspasp

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<220>

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<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gs接頭編碼序列

<400>14

ggtggtggtggaagtggtggtggtggaagtggtggtggtggaagt45