本申請(qǐng)為2011年3月21日提交的、發(fā)明名稱(chēng)為“對(duì)于穩(wěn)定含有蛋白質(zhì)的制劑有用的組合物和方法”的pct申請(qǐng)pct/us2011/029206的分案申請(qǐng)，所述pct申請(qǐng)進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的日期為2012年9月24日，申請(qǐng)?zhí)枮?01180018192.3。

相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)是基于37cfr1.53(b)(1)提交的非臨時(shí)申請(qǐng)，基于35usc119(e)要求于2010年3月22日提交的臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/316326的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過(guò)引用整合到本文中。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及非表面活性劑化合物(包括例如聚氧乙烯(poe)山梨聚糖和聚乙二醇(peg))用于穩(wěn)定含有蛋白質(zhì)的制劑和用于防止此類(lèi)制劑中的蛋白質(zhì)聚集的用途。

發(fā)明背景

當(dāng)需要蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定劑以保護(hù)蛋白質(zhì)免受振蕩、攪拌、剪切作用和凍融，或在界面上的靜止?fàn)顟B(tài)而造成的變性時(shí)，通常使用非離子去垢劑(即，表面活性劑)(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,183,746)。作為示例的是在許多含有蛋白質(zhì)的產(chǎn)品中聚山梨酸酯的用途。例如，聚山梨酸酯20和80(20和80)用于生物治療性產(chǎn)品的制劑中，用于防止表面吸附和作為抵抗蛋白質(zhì)聚集的穩(wěn)定劑(kerwin,j.pharm.sci.97(8):2924-2936(2008))。聚山梨酸酯是兩親性的、非離子型表面活性劑，由聚氧乙烯(poe)山梨聚糖的脂肪酸酯組成，聚山梨酸酯20是聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯，而聚山梨酸酯80是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯。

然而不幸的是，聚山梨酸酯可以通過(guò)氧化或水解進(jìn)行降解。當(dāng)聚山梨酸酯分子降解時(shí)，產(chǎn)生多種降解副產(chǎn)物，包括例如脂肪酸、poe山梨聚糖、peg、peg酯和烷基酸。聚山梨酸酯降解的這類(lèi)副產(chǎn)物中的某些(包括游離的脂肪酸)可以導(dǎo)致含有蛋白質(zhì)的制劑中增加的濁度和蛋白質(zhì)聚集。因此，雖然聚山梨酸酯通常作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑使用，但隨時(shí)間從聚山梨酸酯降解中釋放的脂肪酸和其他降解副產(chǎn)物可以不利地影響聚山梨酸酯在含有蛋白質(zhì)的制劑中表現(xiàn)出的保護(hù)效果。

因此，需要對(duì)于防止蛋白質(zhì)在含有蛋白質(zhì)的水性制劑中聚集的有用的額外的組合物。

發(fā)明概述

本發(fā)明基于這樣的新發(fā)現(xiàn)，即，以某些濃度存在于水性制劑中的聚氧乙烯(poe)山梨聚糖和聚乙二醇(peg)對(duì)于穩(wěn)定含有蛋白質(zhì)或含有肽的制劑，和對(duì)于防止蛋白質(zhì)在此類(lèi)制劑中的聚集是有用的。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含抗體或其他蛋白質(zhì)或肽，和poe山梨聚糖的物質(zhì)組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚氧乙烯山梨聚糖以從約20ppm至約100,000ppm的濃度存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含抗體或其他蛋白質(zhì)或肽和poe山梨聚糖的物質(zhì)組合物不合非離子型表面活性劑，例如，不含聚山梨酸酯。任選地，物質(zhì)組合物還可以不含凍干保護(hù)劑(lyoprotectant)，例如糖、游離氨基酸及其變體等。在某些實(shí)施方案中，物質(zhì)組合物可以是水性的或固體的形式。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含抗體或其他蛋白質(zhì)或肽和聚乙二醇的物質(zhì)組合物。在某些實(shí)施方案中，聚乙二醇在所述物質(zhì)組合物中以低于約10,000ppm的濃度存在，優(yōu)選在約20ppm至約10,000ppm之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，物質(zhì)組合物任選地包含至少一種poe山梨聚糖，所述poe山梨聚糖任選地以從約20ppm至約100,000ppm的濃度存在于所述物質(zhì)組合物中。物質(zhì)組合物還可以任選地不含非離子型表面活性劑，例如，不含聚山梨酸酯。任選地，物質(zhì)組合物還可以不合凍干保護(hù)劑(lyoprotectant)，例如糖、游離氨基酸及其變體等。在某些實(shí)施方案中，物質(zhì)組合物可以是水性的或固體的形式。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含裝有任何本文描述的物質(zhì)組合物的容器的制品。

在另一個(gè)方面，提供了用于制備含有抗體(或其他蛋白質(zhì)或肽)的穩(wěn)定組合物方法，通過(guò)共同混合抗體或其他蛋白質(zhì)與poe山梨聚糖或peg。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及增加抗體或其他蛋白質(zhì)或肽在水性制劑中的穩(wěn)定性的方法，包括混合抗體或其他蛋白質(zhì)或肽與起穩(wěn)定作用的量的poe山梨聚糖，其中poe山梨聚糖增加抗體或其他蛋白質(zhì)或肽的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，poe山梨聚糖以從約20ppm至約100,000ppm的濃度存在，可任選地不含非離子型表面活性劑(例如，不含聚山梨酸酯)，或凍干保護(hù)劑，例如糖、游離氨基酸及其變體等。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及增加抗體或其他蛋白質(zhì)或肽在水性制劑中的穩(wěn)定性的方法，包括混合抗體或其他蛋白質(zhì)或肽與起穩(wěn)定作用的量的聚乙二醇，其中聚乙二醇增加抗體或其他蛋白質(zhì)或肽的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇以低于約10,000ppm，優(yōu)選地在約20ppm至約10,000ppm之間的濃度存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，物質(zhì)組合物任選地包含至少一種poe山梨聚糖，所述poe山梨聚糖可任選地以從約20ppm至約100,000ppm的濃度存在，并且可以任選地不合非離子型表面活性劑(例如，不含聚山梨酸酯)，或凍干保護(hù)劑，例如糖、游離氨基酸及其變體等。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及防止或降低抗體或其他蛋白質(zhì)或肽在水性制劑中聚集的方法，包括混合抗體或其他蛋白質(zhì)或肽與poe山梨聚糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，poe山梨聚糖以從約20ppm至約100,000ppm的濃度存在。水性制劑任選地不含非離子型表面活性劑(例如，不含聚山梨酸酯)，或凍干保護(hù)劑，例如糖、游離氫基酸及其變體等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其他蛋白質(zhì)的聚集是由攪拌水性溶液誘導(dǎo)的。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及防止或降低抗體或其他蛋白質(zhì)或肽在水性制劑中聚集的方法，包括混合抗體或其他蛋白質(zhì)或肽與聚乙二醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇以低于約10,000ppm，優(yōu)選地在約20ppm至約10,000ppm之間的濃度存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水性制劑任選地包含至少一種poe山梨聚糖，所述poe山梨聚糖任選地以從約20ppm至約100,000ppm的濃度存在，并且可以任選地不含非離子型表面活性劑(例如，不含聚山梨酸酯)，或凍干保護(hù)劑，例如糖、游離氫基酸及其變體等。另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其他蛋白質(zhì)的聚集是由攪拌水性溶液誘導(dǎo)的。

在從重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或其他污染性蛋白質(zhì)中純化蛋白質(zhì)、肽或抗體的方法中，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及這樣的改良，所述改良包括在純化過(guò)程中向蛋白質(zhì)、肽或抗體添加poe山梨聚糖或聚乙二醇。

本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)在包含自我聚集型抗體或其他蛋白質(zhì)或肽的水性溶液中混合至少一種poe山梨聚糖或聚乙二醇，然后濃縮所述水性溶液，來(lái)制造另外的自我聚集型抗體或其他蛋白質(zhì)或肽的非聚集型水性溶液的方法。

根據(jù)下文詳細(xì)的說(shuō)明和實(shí)例，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的，但所述說(shuō)明和實(shí)例不應(yīng)被視為限制。本申請(qǐng)全文引用的所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利和公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容都明確的通過(guò)引用整合到本文中。

附圖簡(jiǎn)介

圖1顯示了從抗il13抗體與多種添加物組合的濁度分析中獲得的結(jié)果，所述添加物包括聚山梨酸酯20(ps)、月桂酸(la)或poe山梨聚糖20(poe)。

圖2顯示了從抗il13抗體與多種添加物組合的蛋白質(zhì)濃度分析中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖3顯示了從抗ige抗體與多種添加物組合的蛋白質(zhì)濃度分析中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖4顯示了從抗il13抗體與多種添加物組合的濁度分析中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖5顯示了從抗ige抗體與多種添加物組合的濁度分析中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖6顯示了從抗il13抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析(大于2μm的顆粒)中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖7顯示了從抗ige抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析(大于2μm的顆粒)中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖8顯示了從抗il13抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析(大于10μm的顆粒)中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖9顯示了從抗ige抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析(大于10μm的顆粒)中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖10顯示了從抗il13抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析(大于50μm的顆粒)中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

圖11顯示了從抗ige抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析(大于50μm的顆粒)中獲得的結(jié)果，所述添加物包括poe山梨聚糖20、peg1000或peg6000，都具有多種濃度。

優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述

通過(guò)參考下列對(duì)具體實(shí)施方案和本文囊括的實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明，可以更容易地理解本發(fā)明。

除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然任何與本文所述相似或等價(jià)的方法和材料也可用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，但本文描述了優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物都通過(guò)引用以其整體整合到本文中。

抗體和其他蛋白質(zhì)的聚集主要是由疏水性相互作用導(dǎo)致的，最終導(dǎo)致變性。當(dāng)部分或完全未折疊的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)暴露在水中時(shí)，由于通常包埋著的疏水性?xún)?nèi)部現(xiàn)在暴露在親水性的水性環(huán)境中，導(dǎo)致熱力學(xué)不利的情況。因此，來(lái)自圍繞疏水區(qū)的結(jié)構(gòu)性水分子的熵減少驅(qū)使變性的蛋白質(zhì)聚集，聚集主要通過(guò)已暴露的疏水區(qū)。因此，也危及了蛋白質(zhì)的溶解度。在一些情況下，蛋白質(zhì)亞基可在某些條件下發(fā)生自我關(guān)聯(lián)(不論是天然的或錯(cuò)誤的折疊)，這可能導(dǎo)致沉淀和活性喪失。

影響溶液中的蛋白質(zhì)聚集的因素一般包括蛋白質(zhì)濃度、ph、溫度、其他賦形劑和機(jī)械脅迫。在純化、配合、生產(chǎn)、儲(chǔ)藏和使用過(guò)程中，一些因素(例如，溫度)比其他因素(例如，機(jī)械脅迫)更易于控制。制劑研究將指定對(duì)ph和賦形劑的恰當(dāng)選擇，所述選擇不誘導(dǎo)聚集和/或?qū)嶋H上幫助防止聚集。蛋白質(zhì)濃度由所需治療劑量指定，并根據(jù)該濃度的多少將決定是否存在更高關(guān)聯(lián)狀態(tài)(二聚體、四聚體等)的可能性，這可以導(dǎo)致溶液中的聚集。在制劑開(kāi)發(fā)過(guò)程中必須進(jìn)行仔細(xì)的研究，以確定何種因素影響蛋白質(zhì)聚集，以及之后可以如何消除或控制這些因素。

需要鑒別用于腸道外的或其他施用中的抗體或其他蛋白質(zhì)的穩(wěn)定溶液制品，該需求可以導(dǎo)致開(kāi)發(fā)用于評(píng)估多種添加物對(duì)物理穩(wěn)定性的影響的測(cè)試方法。基于已知的影響蛋白質(zhì)聚集的因素和對(duì)此類(lèi)應(yīng)用的要求，可以使用涉及攪拌或旋轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)溶液的機(jī)械方法來(lái)評(píng)估物理穩(wěn)定性。用于鑒別多種添加物防止聚集的能力的物理脅迫測(cè)試方法可以涉及暴露于水平面上的振蕩或攪拌，或者距離以nrev/min在垂直面旋轉(zhuǎn)的輪軸xcm的旋轉(zhuǎn)。由聚集導(dǎo)致的濁度通常由視覺(jué)觀察或光散射分析確定為時(shí)間的函數(shù)。備選地，可以通過(guò)hplc測(cè)定，將由于沉淀造成的可溶性蛋白質(zhì)含量的降低定量為時(shí)間的函數(shù)。

本發(fā)明是基于這樣的新發(fā)現(xiàn)，即在液體制劑中存在的某些濃度的聚氧乙烯(poe)山梨聚糖和聚乙二醇(peg)對(duì)于穩(wěn)定含有蛋白質(zhì)的制劑，和用于防止此類(lèi)制劑中的蛋白質(zhì)聚集是有用的。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明描述了包含不論高或低濃度的抗體或其他蛋白質(zhì)以及poe山梨聚糖的物質(zhì)組合物。如本文中使用的，“聚氧乙烯山梨聚糖”或“poe山梨聚糖”指具有下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的非表面活性劑化合物：

其中a+b+c+d優(yōu)選是從約6至約80，更優(yōu)選是從約8至約60，更優(yōu)選是從約10至約40，和更優(yōu)選是從約10至約20。如上述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解化合物(例如本文描述的poe山梨聚糖)的化學(xué)合成導(dǎo)致化合物的一定程度的異源混合物，而非完全同源的制品。由此可見(jiàn)，當(dāng)本文中描述a+b+c+d是例如優(yōu)選從約6至約80時(shí)，應(yīng)理解所述定義是指由其化學(xué)合成獲得的異源混合物的主要組分。

poe山梨聚糖可以單個(gè)地用作抗體或其他蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑，或者可以與其他poe山梨聚糖組合使用，用于穩(wěn)定水性溶液中的抗體或其他蛋白質(zhì)。在濃度范圍廣泛的水性溶液中，poe山梨聚糖可用作抗體或其他蛋白質(zhì)的穩(wěn)定(或抗聚集)劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在含有抗體或其他蛋白質(zhì)的水性制劑中，poe山梨聚糖(如果用作單個(gè)穩(wěn)定劑)或poe山梨聚糖(如果組合使用)能以從約20ppm至約100,000ppm，更優(yōu)選以從100ppm至約50,000ppm，更優(yōu)選以從150ppm至約10,000ppm，更優(yōu)選以從200ppm至約5,000ppm，更優(yōu)選以從200ppm至約1,000ppm的濃度存在。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了包含不論是高濃度或低濃度的抗體或其他蛋白質(zhì)，以及聚乙二醇的物質(zhì)組合物。

如本文中使用的，“聚乙二醇”、“peg”及相似的術(shù)語(yǔ)意在涵蓋聚乙二醇及其多種衍生物，例如甲氧基-peg-胺、二胺-peg等。更具體而言，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“聚乙二醇”或“peg”指具有下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的非表面活性劑化合物：

其中n是從約5至約240，并可以任選地含有一定程度的不飽和。涵蓋在本發(fā)明的用途中的peg可以是支化的或線(xiàn)性的，優(yōu)選線(xiàn)性的。如上述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解化合物(例如本文描述的peg)的化學(xué)合成導(dǎo)致化合物的一定程度的異源混合物，而非完全同源的制品。由此可見(jiàn)，當(dāng)本文中描述n優(yōu)選從約5至240時(shí)，應(yīng)理解所述定義是指由其化學(xué)合成獲得的異源混合物的主要組分。

peg可以單個(gè)地用作抗體或其他蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑，或者可以與其他peg組合使用，用于穩(wěn)定水性溶液中的抗體或其他蛋白質(zhì)。在濃度范圍廣泛的水性溶液中，peg可用作抗體或其他蛋白質(zhì)的穩(wěn)定(或抗聚集)劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在含有抗體或其他蛋白質(zhì)的水性制劑中，peg(如果用作單個(gè)穩(wěn)定劑)或peg(如果組合使用)能以少于約10,000ppm，優(yōu)選從約20ppm至約10,000ppm，更優(yōu)選從約200ppm至約10,000ppm，更優(yōu)選從約200ppm至約5,000ppm，更優(yōu)選從約200ppm至約1,000ppm，更優(yōu)選從約200ppm至約500ppm的濃度存在。

優(yōu)選的peg包括分子量約200至12,000的聚合物，但更高分子量的聚合物也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。peg包括線(xiàn)性和支化的聚合物，星形分子和通過(guò)偶聯(lián)至少兩種不同的peg聚合物以形成更高分子量的聚合物而形成的peg嵌段共聚物，這些都是本領(lǐng)域普遍已知的。

“多肽”或“蛋白質(zhì)”意指這樣的氨基酸序列，所述序列的鏈長(zhǎng)度足以產(chǎn)生更高水平的三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，蛋白質(zhì)不同于“肽”，后者也是基于氨基酸的分子，但不具有此類(lèi)結(jié)構(gòu)。一般地，本文使用的蛋白質(zhì)具有至少約5-20kd，備選地至少約15-20kd，優(yōu)選至少約20kd的分子量。“肽”意指這樣的氨基酸序列，所述序列一般不表現(xiàn)出更高水平的三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)。肽一般具有少于約5kd的分子量。

涵蓋在本文定義內(nèi)的多肽實(shí)例包括哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，例如腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素a鏈；胰島素b鏈；胰島素原；卵泡刺激激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝固因子如因子viiic、因子ix、組織因子和vonwillebrands因子；抗凝固因子如蛋白c；心房鈉尿因子；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原活化因子，例如尿激酶或人尿或組織類(lèi)纖溶酶原活化因子(t-pa)；鈴蟾素；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；rantes(通過(guò)活化調(diào)控的由正常t細(xì)胞表達(dá)分泌)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(mip-1-α)；血清白蛋例如人血清白蛋白；muellerian抑制性物質(zhì)；松弛素a鏈；松弛素b鏈；prorelaxin；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β-內(nèi)酰胺酶；dna酶；ige；細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(ctla)，例如ctla-4；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vegf)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白a或d；類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子例如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、-4、-5，或-6(nt-3、nt-4、nt-5，或nt-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如ngf-β；血小板源性生長(zhǎng)因子(pdgf)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如afgf和bfgf；表皮生長(zhǎng)因子(egf)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-i和ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(腦igf-i)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(igfbp)；cd蛋白，如cd3、cd4、cd8、cd19和cd20；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)性因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)；干擾素如干擾素α、β和γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf、gm-csf和g-csf；白介素(il)，例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如，例如aids包膜的部分；運(yùn)輸?shù)鞍祝粴w巢受體；地址素；調(diào)控蛋白；整聯(lián)蛋白如cd11a、cd11b、cd11c、cd18、icam、vla-4和vcam；腫瘤相關(guān)抗原如ca125(卵巢癌抗原)或her2、her3或her4受體；免疫粘附素；和任意上述列舉的蛋白質(zhì)的片段和/或變體，以及與任意上述列舉的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，包括抗體片段。

配制的蛋白質(zhì)優(yōu)選是基本純的，且理想地是基本同質(zhì)的(即，不含污染蛋白質(zhì))?！盎炯兊摹钡鞍踪|(zhì)意指基于組合物的總重量，包含按重量計(jì)至少約90％，優(yōu)選按重量計(jì)至少約95％的蛋白質(zhì)的組合物。“基本同質(zhì)的”蛋白質(zhì)意指基于組合物的總重量，包含按蛋白質(zhì)重量計(jì)至少約99％的組合物。

在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是抗體?？贵w在本文中是針對(duì)目標(biāo)“抗原”的。優(yōu)選地，抗原是生物學(xué)重要的蛋白質(zhì)，將抗體施用給患疾病或病癥的哺乳動(dòng)物可以在哺乳動(dòng)物中導(dǎo)致治療益處。然而，還考慮針對(duì)非蛋白質(zhì)抗原(例如，腫瘤相關(guān)的糖脂抗原；參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,091，178)的抗體。當(dāng)抗原是蛋白質(zhì)時(shí)，其可以是跨膜分子(例如，受體)或配體，如生長(zhǎng)因子。示例性的抗原包括上述蛋白質(zhì)。本發(fā)明涵蓋的抗體的優(yōu)選的分子靶包括cd多肽，如cd3、cd4、cd8、cdl9、cd20和cd34；her受體家族成員，如egf受體(her1)、her2、her3或her4受體；細(xì)胞粘附分子，如lfa-1、mac1、p150、95、vla-4、icam-1、vcam和av/b3整聯(lián)蛋白(包括其a或b亞基)(例如，抗cd11a、抗cd18或抗cd11b抗體)；生長(zhǎng)因子如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖癥(ob)受體；mpl受體；ctla-4；多肽c等。任選地與其他分子綴合的可溶性抗原或其片段可用作生成抗體的免疫原。對(duì)于跨膜分子，如受體，其片段(例如，受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原。備選地，表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞可用作免疫原。此類(lèi)細(xì)胞可源自天然來(lái)源(例如，癌細(xì)胞系)，或者可以是通過(guò)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。

本文中待純化的抗體實(shí)例包括但不限于：her2抗體，包括曲妥珠單抗(trastuzumab)(carter等人，proc.natl.acad.sci.usa，89：4285-4289(1992)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,725,856)和培妥珠單抗(pertuzumab)(omnitarg^tm)(wo01/00245)；cd20抗體(見(jiàn)下文)；il-8抗體(stjohn等人，chest，103：932(1993)，和國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo95/23865)；vegf或vegf受體抗體，包括人源化和/或親和性成熟的vegf抗體，如人源化vegf抗體hua4.6.1貝伐珠單抗(bevacizumab)和雷珠單抗(ranibizumab)(kim等人，growthfactors，7：53-64(1992)；wo96/30046和1998年10月15日公開(kāi)的國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo98/45331)；psca抗體(wo01/40309)；cd11a抗體，包括依法珠單抗(efalizumab)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,037,454、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,622,700、wo98/23761、stoppa等人，transplantintl.4：3-7(1991)和hourmant等人，transplantation58：377-380(1994))；結(jié)合ige的抗體，包括奧馬珠單抗(omalizumab)(presta等人，j.immunol.151：2623-2632(1993)和國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo95/19181；1998年2月3日公布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,714,338或1992年2月25日公布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,091,313；1993年3月4日公開(kāi)的wo93/04173或1998年6月30日公開(kāi)的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/us98/13410；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,714,338)；cd18抗體(1997年4月22日公布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,622,700，或1997年7月31日公開(kāi)的wo97/26912)；apo-2受體抗體抗體(1998年11月19日公開(kāi)的wo98/51793)；組織因子(tf)抗體(1994年11月9日授權(quán)的歐洲專(zhuān)利號(hào)0420937b1)；α4-α7整聯(lián)蛋白抗體(1998年2月19日公開(kāi)的wo98/06248)；egfr抗體(例如，嵌合的或人源化的225抗體、西妥昔單抗(cetuximab)，如1996年12月19日公開(kāi)的wo96/40210中的)；cd3抗體，如okt3(1985年5月7日公布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,515,893)；cd25或tac抗體，如chi-621和(參見(jiàn)1997年12月2日公布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,693,762)；cd4抗體，如cm-7412抗體(choy等人，arthritisrheum39(1)：52-56(1996))；cd52抗體，例如campath-1h(ilex/berlex)(riechmann等人，nature332：323-337(1988))；fc受體抗體，如針對(duì)fcγri的m22抗體(如graziano等人，j.immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的ri)；癌胚抗原(cea)抗體，如hmn-14(sharkey等人，cancerres.55(23suppl)：5935s-5945s(1995))；針對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的抗體(包括hubre-3、hu-mc3和chl6)(ceriani等人，cancerres.55(23)：5852s-5856s(1995)；和richman等人，cancerres.55(23supp)：5916s-5920s(1995))；結(jié)合結(jié)腸癌細(xì)胞的抗體如c242(litton等人，eurj.immunol.26(1)：l-9(1996))；cd38抗體，例如at13/5(ellis等人，j.immunol.155(2)：925-937(1995))；cd33抗體，如hum195(jurcic等人，cancerres55(23suppl)：5908s-5910s(1995))和cma-676或cdp771；epcam抗體，如17-1a；gpiib/iiia抗體，如阿昔單抗(abciximab)或c7e3fab；rsv抗體，如medi-493；cmv抗體，如；hiv抗體，如pro542；肝炎抗體，如hepb抗體；ca125抗體，包括抗muc16(wo2007/001851；yin，bwt和lloyd，ko，j.biol.chem.276：27371-27375(2001))和ovarex；獨(dú)特型gd3表位抗體bec2；αvβ3抗體(例如，；medimmune)；人腎細(xì)胞癌抗體，如ch-g250；ing-1；抗人17-1an抗體(3622w94)；抗人結(jié)腸直腸腫瘤抗體(a33)；針對(duì)gd3神經(jīng)節(jié)苷脂的抗人黑素瘤抗體r24；抗人鱗狀細(xì)胞癌(sf-25)；人白細(xì)胞抗原(hla)抗體，如smartid10和抗hladr抗體oncolym(lym-1)；cd37抗體，如tru016(trubion)；il-21抗體(zymogenetics/novonordisk)；抗b細(xì)胞抗體(impheron)；b細(xì)胞靶向mab(immunogen/aventis)；1d09c3(morphosys/gpc)；lymphorad131(hgs)；lym-1抗體，如lym-1y-90(usc)或抗lym-1oncolym(usc/peregrine)；lif226(enhancedlifesci.)；baff抗體(例如，wo03/33658)；baff受體抗體(參見(jiàn)例如，wo02/24909)；br3抗體；blys抗體，如貝利木單抗(belimumab)；lymphostat-b^tm；isf154(ucsd/roche/tragen)；gomilixima(idec152；biogenidec)；il-6受體抗體，如atlizumab(actemra^tm；chugai/roche)；il-15抗體，如humax-il-15(genmab/amgen)；趨化因子受體抗體，如ccr2抗體(例如，mln1202；millieneum)；抗補(bǔ)體抗體，如c5抗體(例如，依庫(kù)珠單抗(eculizumab)、5g1.1；alexion)；人免疫球蛋白的口服制劑(例如，igpo；proteintherapeutics)；il-12抗體，如abt-874(cat/abbott)；替奈昔單抗(teneliximab)(bms-224818；bms)；cd40抗體，包括s2c6及其人源化變體(wo00/75348)和tnx100(chiron/tanox)；tnf-α抗體，包括ca2英利昔單抗(infliximab)、cdp571、mak-195、阿達(dá)木單抗(adalimumab)(humira^tm)、聚乙二醇化的tnf-α抗體片段，如cdp-870(celltech)、d2e7(knoll)、抗tnf-α多克隆抗體(例如，passtnf；verigen)；cd22抗體，如ll2或依帕珠單抗(epratuzumab)(；immunomedics)，包括依帕珠單抗y-90和依帕珠單抗i-131，abiogen的cd22抗體(abiogen，意大利)、cmc544(wyeth/celltech)、combotox(utsoutwestern)、bl22(nih)和lymposcantc99(immunomedics)。

cd20抗體的實(shí)例包括：“c2b8”，現(xiàn)在被稱(chēng)為“利妥昔單抗”(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,736,137)；釔-[90]-標(biāo)記的2b8鼠抗體，被稱(chēng)為“y2b8”或“替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)”，可自idecpharmaceuticals，inc.商業(yè)購(gòu)買(mǎi)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,736,137；以atcc登錄號(hào)hb11388于1993年6月22日儲(chǔ)藏的2b8)；鼠igg2a“b1”，也被稱(chēng)為“托西莫單抗(tositumomab)”，任選地用¹³¹i標(biāo)記，生成可自corixa商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的“¹³¹i-b1”或“碘i¹³¹托西莫單抗”抗體(bexxar^tm)(還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,595,721)；鼠單克隆抗體“1f5”(press等人，blood69(2)：584-591(1987))及其包括“框架補(bǔ)丁”在內(nèi)的變體或人源化1f5(wo2003/002607，leung，s.；atcc保藏號(hào)hb-96450)；鼠2h7和嵌合的2h7抗體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,677,180)；人源化2h7(wo2004/056312，lowman等人)；2f2(humax-cd20)，靶向b細(xì)胞的細(xì)胞膜中的cd20分子的完整的人高親和力抗體(genmab，denmark；參見(jiàn)例如glennie和vandewinkel，drugdiscoverytoday8：503-510(2003)和cragg等人，blood101：1045-1052(2003)；wo2004/035607；us2004/0167319)；wo2004/035607和us2004/0167319中示出的人單克隆抗體(teeling等人)；us2004/0093621中描述的具有與fc區(qū)結(jié)合的復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈的抗體(shitara等人)；結(jié)合cd20的單克隆抗體和抗原結(jié)合片段(wo2005/000901，tedder等人)，如hb20-3、hb20-4、hb20-25和mb20-11；cd20結(jié)合分子，如ame系列抗體，例如wo2004/103404和us2005/0025764中示出的ame33抗體(watkins等人，elililly/appliedmolecularevolution，ame)；cd20結(jié)合分子，如us2005/0025764中描述的那些(watkins等人)；a20抗體或其變體，如嵌合的或人源化的a20抗體(分別是ca20、ha20)或immu-106(us2003/0219433，immunomedics)；cd20-結(jié)合抗體，包括表位缺失的leu-16、1h4或2b8，任選地與il-2綴合，如us2005/0069545a1和wo2005/16969(carr等人)；結(jié)合cd22和cd20的雙特異性抗體，例如，hll2xha20(wo2005/14618，chang等人)；可獲得自internationalleukocytetypingworkshop的單克隆抗體l27、g28-2、93-1b3、b-c1或nu-b2(valentine等人，在leukocytetypingiii(mcmichael編著，第440頁(yè)，oxforduniversitypress(1987))中；1h4(haisma等人，blood92：184(1998))；抗cd20auristatine綴合物(seattlegenetics)；抗cd20-il2(emd/biovation/cityofhope)；抗cd20mab療法(epicyte)；抗cd20抗體tru015(trubion)。

術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中包括單克隆抗體(包括具有免疫球蛋白fc區(qū)的全長(zhǎng)抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體、雙抗體和單鏈分子，以及抗體片段(例如，fab、f(ab′)2和fv)。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”(ig)在本文中與“抗體”可互換使用。

基礎(chǔ)的4條鏈的抗體單位是由2條相同的輕鏈(l)和2條相同的重鏈(h)組成的異源四聚體糖蛋白。igm抗體由5個(gè)基礎(chǔ)的異源四聚體單位和被稱(chēng)為j鏈的額外多肽組成，并且含有10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；而iga抗體包括從2-5個(gè)基礎(chǔ)的4條鏈單位，其可以多聚化與j鏈組合形成多價(jià)裝配物。在igg的情況下，4條鏈單位一般是約150,000道爾頓。每條l鏈通過(guò)1個(gè)共價(jià)二硫鍵與h鏈連接，而2條h鏈通過(guò)一個(gè)或多個(gè)(取決于h鏈的同種型)二硫鍵彼此連接。每條h和l鏈也具有規(guī)律間隔的鏈內(nèi)二硫橋。每條h鏈在n端具有可變結(jié)構(gòu)域(vh)，對(duì)于α和γ鏈而言，vh后有3個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(ch)，而對(duì)于μ和ε同種型而言，vh后有4個(gè)ch結(jié)構(gòu)域。每條l鏈在n端具有可變結(jié)構(gòu)域(vl)，在其另一端后有恒定結(jié)構(gòu)域。vl與vh配對(duì)，而cl與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)配對(duì)。特定的氨基酸殘基被認(rèn)為在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成接觸面。成對(duì)的vh和vl一起形成單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于不同類(lèi)的抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見(jiàn)例如basicandclinicalimmunology，第8版，danielp.sties，abbai.terr和tristramg.parsolw(編著)，appleton&lange，norwalk，conn.，1994，第71頁(yè)和第6章。

基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的l鏈都可歸入2個(gè)明確不同類(lèi)型中的一種，稱(chēng)為κ和λ。取決于其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch)的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同類(lèi)或同種型。存在5類(lèi)免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，分別具有名為α、δ、ε、γ和μ的重鏈?；赾h序列和功能中的相對(duì)細(xì)微的差異，γ和α類(lèi)進(jìn)一步分為亞類(lèi)，例如，人表達(dá)下列亞類(lèi)：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。

術(shù)語(yǔ)“可變的“指這樣的事實(shí)，即可變結(jié)構(gòu)域的某些片段的序列在抗體之間顯著不同。v結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合，定義特定抗體與其特定抗原的特異性。然而，可變性并非均勻地分布在整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的范圍中。相反，v區(qū)由約15-30個(gè)氨基酸殘基的、被稱(chēng)為框架區(qū)(fr)的相對(duì)不變的幾段序列組成，其被每個(gè)長(zhǎng)度約9-12個(gè)氨基酸殘基的、被稱(chēng)為“高變區(qū)”或有時(shí)被稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)”(cdr)的極度可變的較短區(qū)域分隔開(kāi)。每個(gè)天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含4個(gè)fr，大部分采用β-片層構(gòu)象，由3個(gè)高變區(qū)連接，形成環(huán)狀連接，在一些情況下形成β-片層結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的高變區(qū)由fr緊密相鄰地結(jié)合在一起，并且與來(lái)自其他鏈的高變區(qū)一起對(duì)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成起作用(參見(jiàn)kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991)。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，例如參與抗體依賴(lài)性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)。

術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”(也被稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)”或cdr)在本文中指免疫球蛋白v區(qū)結(jié)構(gòu)域中的抗體氨基酸殘基(通常是3或4個(gè)具有高度序列可變性的短區(qū)域)，其形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，是抗原特異性的主要決定簇。有至少兩種方法用于鑒別cdr殘基：(1)基于跨物種序列可變性的方法(即，kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstituteofhealth，bethesda，ms1991))；和(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法(chothia，c.等人，j.mol.biol.196：901-917(1987))。但是，兩種殘基鑒別技術(shù)定義重疊的區(qū)域而非相同區(qū)域，可以將它們組合來(lái)定義雜交cdr。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從基本均質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體，即，除可能天然存在的突變和/或可能以少量存在的翻譯后修飾(例如，異構(gòu)化、酰胺化)外，包括相同群體的單種抗體。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單種抗原性位點(diǎn)。此外，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)的(多克隆)抗體制品相反，每種單克隆抗體都針對(duì)抗原上的單種決定簇。除特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于它們是通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)物合成的，不被其他免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體的特征是從基本均質(zhì)的抗體群體中獲得的，而不被視為要求通過(guò)任何特定的方法生產(chǎn)抗體。例如，可以通過(guò)由kohler等人，nature，256：495(1975)首次描述的雜交瘤方法，或者可以通過(guò)重組dna方法(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567)，制備根據(jù)本發(fā)明的待使用的單克隆抗體。還可以使用例如clackson等人，nature，352：624-628(1991)和marks等人，j.mol.biol.，222：581-597(1991)中描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫(kù)中分離“單克隆抗體”。

單克隆抗體在本文中具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)以及此類(lèi)抗體的片段(只要所述片段表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或者屬于特定的抗體類(lèi)型或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與源自另一種物種或者屬于另一種抗體類(lèi)型或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567；morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa，81：6851-6855(1984))。本文中的目標(biāo)嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)化(primitized)”抗體，其包含源自非人靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，舊世界猴子、猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。

“完整的”抗體是這樣的抗體，其包含抗原結(jié)合位點(diǎn)和cl，以及至少包含重鏈結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。

抗體片段包括完整抗體的一部分，優(yōu)選地是完整抗體的抗原結(jié)合和/或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括fab、fab′、f(ab’)2和fv片段；雙抗體；線(xiàn)性抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,641,870，實(shí)施例2；zapata等人，proteineng.8(10)：1057-1062[1995])；從抗體片段形成的單鏈抗體分子和多特異性抗體。

木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生2個(gè)相同的、被稱(chēng)為“fab”片段的抗原結(jié)合片段，和殘余的“fc”片段，該名稱(chēng)反映了易于結(jié)晶的能力。fab片段由完整的l鏈、h鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(vh)和一條重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)組成。對(duì)于抗原結(jié)合而言，每個(gè)fab片段都是單價(jià)的，即，其具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生單個(gè)大的f(ab’)2片段，所述f(ab’)2片段大致對(duì)應(yīng)于2個(gè)由二硫化物連接的、具有不同抗原結(jié)合活性的fab片段，且仍然能夠交聯(lián)抗原。fab′片段不同于fab片段，其在ch1結(jié)構(gòu)域的羧基端具有若干個(gè)額外殘基，包括一個(gè)或多個(gè)來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。fab′-sh在本文中是這樣的fab′的名稱(chēng)，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有游離的巰基。f(ab’)2抗體片段最初被生產(chǎn)為之間具有鉸鏈半胱氨酸的fab′片段對(duì)?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。

fc片段包含由二硫化物結(jié)合在一起的兩條h鏈的羧基端部分。抗體的效應(yīng)子功能是由fc區(qū)的序列決定的，該區(qū)域也被可見(jiàn)于某些細(xì)胞類(lèi)型上的fc受體(fcr)識(shí)別。

“fv”是含有完全的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該片段由緊密的、非共價(jià)關(guān)聯(lián)的一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊發(fā)出了6個(gè)高變環(huán)(來(lái)自h鏈和l鏈各3個(gè)環(huán))，提供了用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基，并且賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或者進(jìn)包括抗原特異性的3個(gè)cdr的一半fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，雖然比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和力低。

“單鏈fv”，也縮寫(xiě)為“sfv”或“scfv”，是包含連接成單條多肽鏈的vh和vl抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sfv多肽進(jìn)一步包含在vh和vl結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，所述多肽接頭使sfv能夠形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sfv的綜述，參見(jiàn)pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore編著，springer-verlag，newyork，第269-315頁(yè)(1994)。

術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指通過(guò)構(gòu)建在vh和vl結(jié)構(gòu)域之間具有短接頭(約5-10個(gè)殘基)的sfv片段(參見(jiàn)前述章節(jié))制備的小抗體片段，如此使得形成鏈間而非鏈內(nèi)的v結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而獲得二價(jià)片段，即，具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性的雙抗體是兩個(gè)“交換”sfv片段的異二聚體，其中兩個(gè)抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。雙抗體詳細(xì)描述在例如ep404,097；wo93/11161；hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448(1993)中。

“特異性結(jié)合”特定多肽或特定多肽上的表位或?qū)τ谔囟ǘ嚯幕蛱囟ǘ嚯纳系谋砦弧疤禺愋浴钡目贵w是這樣的抗體，所述抗體結(jié)合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本不結(jié)合任何其他多肽或多肽表位。

術(shù)語(yǔ)“固相”描述了本發(fā)明的抗體可以附著的非水性基質(zhì)。涵蓋在本文中的固相的實(shí)例包括部分地或完全地由玻璃(例如，可控孔度的玻璃)、多糖(例如，瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷形成的固相。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)上下文，固相可以包含測(cè)定平板的孔；在其他情況下，其是純化柱(例如，親和層析柱)。該術(shù)語(yǔ)也包括分散顆粒的不連續(xù)固相，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,275,149中描述的那些。

非人(例如，鼠)抗體的“人源化”形式是大部分是人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如fv、fab、fab′、f(ab’)2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。大部分情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自受體的高變區(qū)(也是cdr)的殘基被來(lái)自具有所需的特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(如，小鼠、大鼠或兔)的高變區(qū)的殘基取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的fv框架區(qū)(fr)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，本文中使用的“人源化抗體”還包含既不存在于受體抗體也不存在于供體抗體中的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善和優(yōu)化抗體性能。人源化抗體任選地還包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。關(guān)于其他細(xì)節(jié)，參見(jiàn)jones等人，nature，321：522-525(1986)；reichmann等人，nature，332：323-329(1988)；和presta，curr.op.struct.biol.，2：593-596(1992)。

“物種依賴(lài)性抗體”，例如，哺乳動(dòng)物抗人ige抗體是這樣的抗體，其對(duì)來(lái)自第一種哺乳動(dòng)物物種的抗原的結(jié)合親和力比對(duì)來(lái)自第二種哺乳動(dòng)物物種的該抗原的同源物的結(jié)合親和力更強(qiáng)。一般而言，物種依賴(lài)性抗體“特異性地結(jié)合”人抗原(即，具有不多于約1x10^-7m、備選地不多于約1x10^-8m、備選地不多于約1x10^-9m的結(jié)合親和力(kd)值)，但對(duì)來(lái)自第二種非人哺乳動(dòng)物物種的抗原同源物的結(jié)合親和力比其與非人抗原的結(jié)合親和力弱至少約50倍，至少約500倍，或者至少約1000倍。物種依賴(lài)性抗體可以是上述多種抗體類(lèi)型中的任一種，但優(yōu)選是人源化抗體或人抗體。

抗體的“效應(yīng)子功能”指歸因于抗體的fc區(qū)(天然序列fc區(qū)或氨基酸序列變體fc區(qū))的生物學(xué)活性，并且隨抗體同種型而改變。抗體的效應(yīng)子功能的實(shí)例包括：c1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴(lài)性的細(xì)胞毒性；fc受體結(jié)合；抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，b細(xì)胞受體)下調(diào)；和b細(xì)胞活化。

“抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或adcc指細(xì)胞毒性的形式，其中分泌的ig結(jié)合到存在于某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷細(xì)胞(nk)、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上的fc受體(fcr)上，使這些細(xì)胞毒性效應(yīng)子細(xì)胞能夠特異性地結(jié)合具有抗原的靶細(xì)胞，并且之后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞?？贵w“武裝”細(xì)胞毒性細(xì)胞，并且是通過(guò)該機(jī)制殺死靶細(xì)胞所必需的。介導(dǎo)adcc的初級(jí)細(xì)胞，nk細(xì)胞，僅表達(dá)fcγriii，而單核細(xì)胞表達(dá)fcγri、fcγrii和fcγriii。ravetch和kinet，annu.rev.immunol.9：457-92(1991)的第464頁(yè)的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的fc表達(dá)。為了評(píng)估目標(biāo)分子的adcc活性，可以實(shí)施體外acdd測(cè)定，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,500,362或5,821,337中描述的。對(duì)于此類(lèi)測(cè)定有用的效應(yīng)子細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(pbmc)和天然殺傷細(xì)胞(nk)。備選地，或額外地，可以在體內(nèi)評(píng)估目標(biāo)分子的adcc活性，例如，在如clynes等人，pnasusa95：652-656(1998)中公布的動(dòng)物模型中。

“fc受體”或“fer”描述了結(jié)合抗體的fc區(qū)的受體。優(yōu)選的fcr是天然序列的人fcr。此外，優(yōu)選的fcr是結(jié)合igg抗體(γ受體)的，并包括fcγri、fcγrii和fcγriii亞類(lèi)的fcr，包括等位變體和備選地這些受體的剪切形式，fcγrii受體包括fcγriia(“活化型受體”)和fcγriib(“抑制型受體”)，具有相似的氨基酸序列，主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中有差別?；罨褪荏wfcγriia在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(itam)。抑制型受體fcγriib在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(itim)(參見(jiàn)，m.daeron，annu.rev.immunol.15：203-234(1997))。ravetch和kinet，annu.rev.immunol.9：457-92(1991)；capel等人，immunomethods4：25-34(1994)；和dehaas等人，j.lab.clin.med.126：330-41(1995)中綜述了fcr。其他fcr，包括待在將來(lái)鑒別的那些，都涵蓋在本文的術(shù)語(yǔ)“fcr”中。術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體fcrn，其負(fù)責(zé)將母體的igg轉(zhuǎn)移到胎兒中。guyer等人，j.immunol.117：587(1976)和kim等人，j.immunol.24：249(1994)。

“人效應(yīng)子細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種fcr并發(fā)揮效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞至少表達(dá)fcriii，并發(fā)揮效應(yīng)子功能。介導(dǎo)adcc的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(pbmc)、天然殺傷細(xì)胞(nk)、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性t細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，其中pbmc和mnk細(xì)胞是優(yōu)選的。效應(yīng)子細(xì)胞可以從天然源(例如血液)分離。

“補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性”或“cdc”指在存在補(bǔ)體的條件下裂解靶細(xì)胞。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化是由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一個(gè)組分(c1q)與結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原的(恰當(dāng)亞類(lèi)的)抗體的結(jié)合而起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體活化，可以實(shí)施例如，如gazzano-santoro等人，j.immunol.methods202：163(1996)中描述的cdc測(cè)定。

當(dāng)使用“分離的”來(lái)描述本文公布的多種多肽和抗體時(shí)，意味著多肽或抗體已經(jīng)從它的生產(chǎn)環(huán)境的組分中鑒別、分離和/或回收。優(yōu)選地，分離的多肽不與來(lái)自它的生產(chǎn)環(huán)境中的所有其他組分相關(guān)聯(lián)。它的生產(chǎn)環(huán)境的污染性組分，例如由重組的轉(zhuǎn)染細(xì)胞造成的污染性組分，是通常干擾多肽的診斷或治療用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽將被純化至(1)通過(guò)使用旋杯式測(cè)序儀足以獲得n端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度，或(2)均質(zhì)(使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染法，在非還原或還原條件下，通過(guò)sds-page)。然而，一般地，分離的多肽或抗體是通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備的。

編碼本文中的多肽和抗體的“分離的”核酸分子是這樣的核酸分子，所述核酸分子是從在它的生產(chǎn)環(huán)境中與其通常相關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子中鑒別和分離的。優(yōu)選地，分離的核酸不與和生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)聯(lián)的所有組分關(guān)聯(lián)。編碼本文中的多肽和抗體的分離的核酸分子處于非其被自然發(fā)現(xiàn)時(shí)的形式或環(huán)境的形式。因此，分離的核酸分子不同于編碼本文中天然存在于細(xì)胞中的的多肽和抗體的核酸。

術(shù)語(yǔ)“控制序列”指在特定的宿主生物體中表達(dá)有效連接的編碼序列所必需的dna序列。適合原核生物的控制序列包括例如啟動(dòng)子，任選地包括操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多聚腺苷酸信號(hào)和增強(qiáng)子。

當(dāng)核酸位于與另一種核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，所述核酸是“有效連接的”。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)的dna作為參與多肽分泌的前蛋白表達(dá)，則其與多肽的dna是有效連接的；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列轉(zhuǎn)錄，則其與編碼序列是有效連接的；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的放置促進(jìn)了翻譯，則它與編碼序列是有效連接的。一般而言，“有效連接的”意味著連接的dna序列是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是連續(xù)且處于閱讀相(readingphase)中的。然而，增強(qiáng)子不必連續(xù)。連接是通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)連接而實(shí)現(xiàn)的。如果不存在此類(lèi)位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。

術(shù)語(yǔ)“已附加表位的”用于本文中指包含與“標(biāo)簽多肽”融合的本文所述多肽或抗體的嵌合多肽。標(biāo)簽多肽具有足夠的殘基來(lái)提供針對(duì)其制備抗體的表位，然而又足夠短使得不干擾與其融合的多肽的活性。優(yōu)選地，標(biāo)簽多肽是相當(dāng)足夠獨(dú)特的，使得抗體基本不與其他表位交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽一般具有至少6個(gè)氨基酸殘基，并且通常在約8和50個(gè)氨基酸殘基之間(優(yōu)選在約10和20個(gè)氨基酸殘基之間)。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”表示這樣的抗體樣分子，所述分子組合了異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包含與抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)不同的(即，“異源的”)、具有所需的結(jié)合特異性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列的融合體。免疫粘附素分子的粘附部分通常是至少包含受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的、連續(xù)的氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列可以獲得自任何免疫球蛋白，如igg-1、igg-2、igg-3或igg-4亞型、iga(包括iga-1和iga-2)、ige、igd或igm。ig融合體優(yōu)選的包括用本文描述的多肽或抗體的結(jié)構(gòu)域替代ig分子內(nèi)的至少一個(gè)可變區(qū)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白融合體包括igg1分子的鉸鏈區(qū)、ch2和ch3，或鉸鏈區(qū)、ch1、ch2和ch3區(qū)。關(guān)于免疫球蛋白融合體的生產(chǎn)，還參見(jiàn)1995年6月7目公布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,428,130。

術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”指這樣的制品，所述制品的形式允許活性成分的生物學(xué)活性生效，并且不含有對(duì)施用制劑的對(duì)象不可接受的毒性的其他組分。

如果在給定的時(shí)間時(shí)抗體的生物學(xué)活性是制備藥物制劑時(shí)表現(xiàn)出的生物學(xué)活性的約10％以?xún)?nèi)(在測(cè)定的誤差內(nèi))，則抗體在藥物制劑中具有“生物學(xué)活性”，這首根據(jù)抗體在體外或體內(nèi)與抗原結(jié)合的能力和所導(dǎo)致的可測(cè)量的生物學(xué)應(yīng)答來(lái)確定的。

“穩(wěn)定的”或“穩(wěn)定化”制劑是這樣的制劑，其中的蛋白質(zhì)在儲(chǔ)藏后基本保留了它的生理學(xué)和/或化學(xué)穩(wěn)定性?？梢栽谶x定的溫度下，測(cè)量選定的時(shí)間段的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，制劑在室溫(～30℃)下或者在40℃下穩(wěn)定至少1個(gè)月，和/或在約2-8℃下穩(wěn)定至少1年，優(yōu)選至少2年。例如，在儲(chǔ)藏過(guò)程中的聚集程度可用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的標(biāo)志。因此，“穩(wěn)定的”制劑可以是這樣的制劑，其中少于約10％，并且優(yōu)選少于約5％的蛋白質(zhì)在制劑中以聚集物的形式存在。用于測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的多種分析技術(shù)是本領(lǐng)域可獲得的，綜述在例如，在peptideandproteindrugdelivery，247-301，vincentlee編著，marceldekker，inc.，newyork，n.y.，pubs.(1991)和jones，a.adv.drugdeliveryrev.10：29-90(1993)中。

增加含有蛋白質(zhì)的制劑的“穩(wěn)定性”指降低(相比未處理過(guò)的含蛋白質(zhì)的制劑)或防止制劑中形成蛋白質(zhì)聚集物。

術(shù)語(yǔ)“水性溶液”指這樣的溶液，其中水是溶解基質(zhì)或溶劑。當(dāng)物質(zhì)溶解在液體中時(shí)，混合物被稱(chēng)為溶液。溶解的物質(zhì)是溶質(zhì)，實(shí)施溶解的液體是溶劑(在此情況下是水)。

術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化試劑”或“穩(wěn)定劑”在本文中是向溶液和混合物或懸浮液或組合物或治療性組合物中添加的，以維持其處于穩(wěn)定或不變狀態(tài)的化學(xué)品或化合物；或者是因?yàn)槠洚a(chǎn)生涉及原子或分子的改變，導(dǎo)致更穩(wěn)定的或不變的狀態(tài)所以使用的化學(xué)品或化合物。

術(shù)語(yǔ)“聚集物”或“聚集”在本文中意指聚攏到一起，或集合成團(tuán)或成整體，例如，如在肽、多肽、抗體或其變體的聚集中。聚集物可以自我聚集，或由于其他因素而聚集，例如聚集劑，沉淀劑、攪拌或其他手段和方法，從而導(dǎo)致肽、多肽、抗體或其變體聚攏到一起。

攪拌誘導(dǎo)的聚集是在含有蛋白質(zhì)的溶液中由攪拌誘導(dǎo)的聚集物形成，其中攪拌是由振蕩或攪動(dòng)引發(fā)的運(yùn)動(dòng)。

“易于聚集”的抗體是被觀察到與其他抗體分子聚集的抗體，尤其是在攪拌的條件下。

“抑制”由攪拌誘導(dǎo)的聚集意指防止、降低或減少由攪拌誘導(dǎo)的聚集的量，是通過(guò)比較在包含至少一種攪拌誘導(dǎo)的聚集的抑制劑的含有蛋白質(zhì)的溶液中存在的聚集物的量，和不包含至少一種攪拌誘導(dǎo)的聚集的抑制劑的含有蛋白質(zhì)的溶液中存在的聚集物的量來(lái)測(cè)量的。

攪拌誘導(dǎo)的聚集的抑制量是抑制攪拌誘導(dǎo)的聚集的量。

可用于本發(fā)明中用于測(cè)量攪拌誘導(dǎo)的聚集的方法包括凝膠電泳、等電聚焦、毛細(xì)管電泳、層析如尺寸排阻層析、離子交換層析和逆向高性能液相層析、肽作圖、寡糖作圖、質(zhì)譜、紫外吸收光譜學(xué)、熒光光譜學(xué)、圓二色光譜學(xué)、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、分析超速離心、動(dòng)態(tài)光散射、蛋白水解和交聯(lián)、濁度測(cè)量、過(guò)濾阻滯測(cè)定、免疫測(cè)定、熒光染料結(jié)合測(cè)定、蛋白質(zhì)染色測(cè)定、顯微術(shù)和通過(guò)elisa或其他結(jié)合測(cè)定檢測(cè)聚集。

“等滲”制劑是具有與人血液基本相同的滲透壓的制劑。等滲制劑一般具有從約250至350mosm的滲透壓。術(shù)語(yǔ)“低滲”描述了具有低于人血液的滲透壓的滲透壓的制劑。相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)“高滲”用于描述具有高于人血液的滲透壓的滲透壓的制劑。例如可以使用蒸汽壓或冰凍型滲壓計(jì)測(cè)量等滲性。由于添加鹽和/或緩沖液的結(jié)果，本發(fā)明的制劑是高滲的。

“重構(gòu)的”制劑是通過(guò)在稀釋劑中溶解凍干的蛋白質(zhì)或抗體制劑使得所述蛋白質(zhì)分散在重構(gòu)的制劑中而制備的制劑。重構(gòu)的制劑適合向待用目標(biāo)蛋白質(zhì)治療的患者施用(例如，腸胃外施用)，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以是適合皮下施用的重構(gòu)的制劑。

“表面活性劑”是可以在固體-固體、固體-液體、液體-液體和液體-氣體的表面發(fā)揮效果的表面活性試劑，因?yàn)樗鼈兊幕瘜W(xué)組成含有親水性和疏水性基團(tuán)。這些材料降低處于空氣-水和/或水固體界面處的稀釋的溶液中的蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)可以吸附在所述界面處并可能聚集。表面活性劑可以結(jié)合到蛋白質(zhì)制劑中的疏水界面上。由于蛋白質(zhì)單層的解折疊和之后的聚集，特別地當(dāng)攪拌時(shí)水表面上的蛋白質(zhì)將聚集。

“表面活性劑”可以使蛋白質(zhì)變性，但也可以使其對(duì)于表面變性穩(wěn)定。一般而言，離子型表面活性劑可以使蛋白質(zhì)變性。然而，即使在相對(duì)高濃度(1％w/v)的條件下，非離子型表面活性劑一般不使蛋白質(zhì)變性。大部分親代可接受的非離子型表面活性劑來(lái)自聚山梨酸酯或聚醚類(lèi)。聚山梨酸酯20和80是上市的蛋白質(zhì)制劑中的當(dāng)代的表面活性劑穩(wěn)定劑。然而，蛋白質(zhì)制劑中使用的其他表面活性劑包括pluronicf-68和“brij”類(lèi)的成員。非離子型表面活性劑可以是基于糖的?；谔堑谋砻婊钚詣┛梢允峭榛擒疹?lèi)。烷基糖苷的一般結(jié)構(gòu)是r1-o-(ch2)x-r，其中r獨(dú)立地是ch3或環(huán)己基(c6h11)，r1獨(dú)立地是葡萄糖或麥芽糖。示例性的烷基糖苷類(lèi)包括這樣的烷基糖苷，其中r1是葡萄糖，r是ch3，并且x是5(n-己基-β-d-吡喃葡萄糖苷)、x是6(n-庚基-β-d-吡喃葡萄糖苷)、x是7(n-辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷)、x是8(n-壬基-β-d-吡喃葡萄糖苷)、x是9(n-癸基-β-d-吡喃葡萄糖苷)和x是11(n-十二烷基-β-d-吡喃葡萄糖苷)。有時(shí)吡喃葡萄糖苷被稱(chēng)為葡萄糖苷。示例性的烷基糖苷類(lèi)還包括這樣的烷基糖苷，其中r1是麥芽糖，r是ch3，并且x是5(n-己基-β-d-吡喃麥芽糖苷)、x是7(n-辛基-β-d-吡喃麥芽糖苷)、x是8(n-壬基-β-d-吡喃麥芽糖苷)、x是9(n-癸基-β-d-吡喃麥芽糖苷)、x是10(n-十一烷基-β-d-吡喃麥芽糖苷)、x是11(n-十二烷基-β-d-吡喃麥芽糖苷)、x是12(n-十三烷基-β-d-吡喃麥芽糖苷)、x是13(n-十四烷基-β-d-吡喃麥芽糖苷)，和x是15(n-十六烷基-β-d-吡喃麥芽糖苷)。有時(shí)吡喃麥芽糖苷被稱(chēng)為麥芽糖苷。示例性的烷基糖苷類(lèi)還包括這樣的烷基糖苷，其中r1是葡萄糖，x是3，并且r是環(huán)己基(3-環(huán)己基-1-丙基-β-d-葡萄糖苷)；其中r1是麥芽糖，x是4，和r是環(huán)己基(4-環(huán)己基-1-丁基-β-d-麥芽糖苷)。

“可藥用的酸”包括在配制的濃度和方式下無(wú)毒的無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸。例如，合適的無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、高氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亞磺酸、磺胺酸、磷酸、碳酸等。合適的有機(jī)酸包括直鏈和支鏈的烷烴的、芳香烴的、環(huán)烴的、脂環(huán)族的、芳香脂肪族的、雜環(huán)的、飽和的、不飽和的、單、二和三羧酸，包括例如甲酸、乙酸、2-羥基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、t-丁基乙酸、氨基苯甲酸、丙酸、2-羥基丙酸、2-氧基丙酸、丙二酸、環(huán)戊基丙酸、環(huán)戊基丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、抗壞血酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、硬脂酸、粘康酸、苦杏仁酸、琥珀酸、撲酸(embonicacid)、反丁烯二酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、丙二酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙醇酸、葡萄糖酸、葡糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥珀酸、水楊酸、鄰苯二甲酸、palmoic、palmeic、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-二乙磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、對(duì)甲基苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環(huán)[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧基、葡庚糖酸、4，4′-亞甲基雙-3-(羥基-2-烯-1-羧酸)、羥基萘甲酸。

“可藥用的堿”包括在配制的濃度和方式下無(wú)毒的無(wú)機(jī)堿和有機(jī)堿。例如，合適的堿包括從形成無(wú)機(jī)堿的金屬所形成的堿，例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅、錳、鋁、n-甲基葡糖胺、嗎啉、哌啶，以及有機(jī)無(wú)毒堿包括伯胺、仲銨和叔胺、取代胺、環(huán)胺和堿性離子交換樹(shù)脂(例如，n(r′)4⁺【其中r′獨(dú)立地是h或c1-4烷基，例如銨、tris)】，例如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、trimethamine、二環(huán)己胺、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡堿、普魯卡因、，hydrabamine、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤類(lèi)、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺樹(shù)脂等。特別優(yōu)選的有機(jī)無(wú)毒堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、trimethamine，雙環(huán)己胺、膽堿和咖啡堿。

可用于本發(fā)明的其他可藥用的酸和堿包括源自氨基酸(例如組氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸和天冬酰胺)的酸和堿。

“可藥用的”緩沖液和鹽包括源自上述酸和堿的酸和堿加成鹽的。特定的緩沖液和/或鹽包括組氨酸、琥珀酸鹽和乙酸鹽。

“凍干保護(hù)劑”是這樣的分子，當(dāng)所述分子與目標(biāo)蛋白組合時(shí)，顯著防止或降低蛋白質(zhì)在凍干和后續(xù)儲(chǔ)藏時(shí)的物理化學(xué)不穩(wěn)定性。示例性的凍干保護(hù)劑包括糖及其相應(yīng)的糖醇；氨基酸，例如谷氨酸一鈉或組氨酸；甲胺，例如甜菜堿；易溶鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三羥的或更高分子量的糖醇，例如甘油、葡聚糖、赤蘚糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；；及其組合。其他示例性的凍干保護(hù)劑包括丙三醇和明膠，以及糖類(lèi)蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇糖。還原性糖的實(shí)例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原性糖的實(shí)例包括選自糖醇和其他直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原性糖苷。優(yōu)選的糖醇是單糖苷，尤其是通過(guò)還原二糖(例如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖)獲得的化合物。糖苷的側(cè)鏈基團(tuán)可以是葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇的其他實(shí)例是葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優(yōu)選的凍干保護(hù)劑是非還原性糖海藻糖或蔗糖。

以“凍干保護(hù)的量”將凍干保護(hù)劑加入到預(yù)凍干的制劑中，這意味著，在存在凍干保護(hù)量的凍干保護(hù)劑的條件下凍干蛋白質(zhì)后，在凍干和儲(chǔ)藏時(shí)，蛋白質(zhì)基本保持了它的物理化學(xué)穩(wěn)定性。

“可藥用的糖”是這樣的分子，當(dāng)其與目標(biāo)蛋白組合時(shí)，顯著防止或降低蛋白質(zhì)在儲(chǔ)藏時(shí)的物理化學(xué)不穩(wěn)定性。當(dāng)打算將制劑凍干并然后重構(gòu)時(shí)，“可藥用的糖”也被稱(chēng)為“凍干保護(hù)劑”。示例性的糖及其相應(yīng)的糖醇包括：氨基酸，例如谷氨酸鈉或組氨酸；甲胺，例如甜菜堿；易溶鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三羥的或更高分子量的糖醇，例如甘油、葡聚糖、赤蘚糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；；及其組合。其他示例性的凍干保護(hù)劑包括丙三醇和明膠，以及糖類(lèi)蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇糖。還原性糖的實(shí)例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原性糖的實(shí)例包括選自糖醇和其他直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原性糖苷。優(yōu)選的糖醇是單糖苷，尤其是通過(guò)還原二糖(例如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖)獲得的化合物。糖苷的側(cè)鏈基團(tuán)可以是葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇的其他實(shí)例是葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優(yōu)選的凍干保護(hù)劑是非還原性糖海藻糖或蔗糖。

以“保護(hù)量”將可藥用的糖加入到(例如，預(yù)凍干)制劑中，意味著在儲(chǔ)藏過(guò)程中(例如，重構(gòu)和儲(chǔ)藏后)，蛋白質(zhì)基本保持了它的物理化學(xué)穩(wěn)定性。

本文中的目標(biāo)“稀釋劑”是可藥用的(對(duì)于施用給人是安全無(wú)毒的)，并且對(duì)于制備液體制劑(例如凍干后重構(gòu)的制劑)是有用的。示例性的稀釋劑包括無(wú)菌水、注射用抑菌水(bwfi)、ph緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖的鹽水)、無(wú)菌鹽溶液、ringer溶液或葡萄糖[溶液。在備選的實(shí)施方案中，稀釋劑可包括鹽的水性溶液和/或緩沖液。

“防腐劑”是能夠添加到本文的制劑中以降低細(xì)菌活性的化合物。例如，添加防腐劑可以促進(jìn)多次使用(多劑量)制劑的生產(chǎn)。潛在的防腐劑的實(shí)例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲銨、氯化苯甲烷銨(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基是長(zhǎng)鏈化合物)和苯索氯銨。其他類(lèi)型的防腐劑包括芳香醇，例如苯酚、丁醇和苯甲醇，烷基對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯、兒茶酚、雷瑣酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚。本文中最優(yōu)選的防腐劑是苯甲醇。

“治療”指療法性治療和預(yù)防性或防止性措施。需要治療的包括已患疾病的，以及需要防止病癥的。

用于治療目的的“哺乳動(dòng)物”指任何分類(lèi)為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包括人，馴養(yǎng)的和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園、體育運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，如狗、馬、兔、牛、豬、倉(cāng)鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓等。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。

“病癥”是受益于用蛋白質(zhì)治療的任何病況。包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些誘使哺乳動(dòng)物患所討論的病癥的病理學(xué)病況。本文治療的病癥的非限制性實(shí)例包括癌癥和炎癥。

“治療有效量”是產(chǎn)生對(duì)特定的病癥的可測(cè)量的改善或防止特定的病癥至少所需的最低濃度。已知蛋白質(zhì)的治療有效量是本領(lǐng)域普遍已知的，而后文發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的治療有效量可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如普通醫(yī)生)普遍已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。

按本文所述配制的抗體(包括與毒素綴合的抗體)和其他蛋白質(zhì)的制備方法是本領(lǐng)域普遍已知的，詳細(xì)描述在例如wo2007/001851中。

可以按照本發(fā)明以水性或凍干的形式配制抗體和其他蛋白質(zhì)，所述凍干的形式能夠重構(gòu)為水性的形式。

本文描述的制劑可以制備為重構(gòu)的凍干制劑。將本文描述的蛋白質(zhì)或抗體凍干，然后重構(gòu)以生產(chǎn)本發(fā)明的液體制劑。在該特別的實(shí)施方案中，在如上所述制備目標(biāo)蛋白后，生產(chǎn)了“預(yù)凍干的”制劑?？紤]所需的劑量體積、施用模式等，測(cè)定存在于預(yù)凍干的制劑中的蛋白質(zhì)的量。例如，完整抗體的起始濃度可以是從約2mg/ml至約50mg/ml，優(yōu)選從約5mg/ml至約40mg/ml并且最優(yōu)選從約20-30mg/ml。

待配制的蛋白質(zhì)一般存在于溶液中。例如，在本發(fā)明的液體制劑中，蛋白質(zhì)可以存在于ph從約4-8，并且優(yōu)選約5-7的ph緩沖溶液中。緩沖液濃度可以是從約1mm至約20mm，備選地從約3mm至約15mm，取決于例如緩沖液和制劑的(例如，重構(gòu)制劑的)所需的滲漲度(tonicity)。示例性的緩沖液和/或鹽是可藥用的，并且可以由合適的酸、堿及其鹽產(chǎn)生，例如在“可藥用的”酸、堿或緩沖液下定義的那些。

在一個(gè)實(shí)施方案中，向預(yù)凍干的制劑中添加凍干保護(hù)劑。預(yù)凍干的制劑中的凍干保護(hù)劑的量一般使重構(gòu)后所獲得的制劑是等滲的。然而，高滲的重構(gòu)制劑也可能是合適的。此外，凍干保護(hù)劑的量不能太低，使得在凍干時(shí)發(fā)生不可接受的量的蛋白質(zhì)降解/聚集。然而，在預(yù)凍干制劑中的示例性?xún)龈杀Ｗo(hù)劑濃度是從約10mm至約400mm，備選地從約30mm至約300mm，備選地從約50mm至約100mm。示例性的凍干保護(hù)劑包括糖和糖醇，例如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇。然而，在特定環(huán)境下，某些凍干保護(hù)劑也可以對(duì)增加制劑的粘度有作用。因此，需要小心選擇特定的凍干保護(hù)劑，其使該效果最小化或中和該效果。在上文的“凍干保護(hù)劑”的定義中描述了其他的凍干保護(hù)劑，其在本文中也被稱(chēng)為“可藥用的糖”。

對(duì)于每種特定的蛋白質(zhì)或抗體和凍干保護(hù)劑的組合而言，蛋白質(zhì)與凍干保護(hù)劑的比例可以變化。在選擇抗體作為蛋白質(zhì)和糖(例如，蔗糖或海藻糖)作為凍干保護(hù)劑，用于生成具有高蛋白質(zhì)濃度的等滲重構(gòu)的制劑的情況下，凍干保護(hù)劑與抗體的摩爾比可以是從約100至約1500摩爾凍干保護(hù)劑比1摩爾抗體，和優(yōu)選地從約200至約1000摩爾凍干保護(hù)劑比1摩爾抗體，例如從約200至約600摩爾凍干保護(hù)劑比1摩爾抗體。

凍干保護(hù)劑(例如，蔗糖或海藻糖)和增量劑(例如，甘露糖醇或甘油)的混合物可用于制備預(yù)凍干制劑。增量劑可以允許生產(chǎn)均勻的凍干餅，其中不含過(guò)多的孔穴等。其他可藥用的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，例如remington′spharmaceuticalsciences第16版，osol，a.編著(1980)中所述，也可以包括在預(yù)凍干的制劑(和/或凍干的制劑和/或重構(gòu)的制劑)中，只要它們不對(duì)制劑的所需特征產(chǎn)生不利影響?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所使用的劑量和濃度下對(duì)受體是無(wú)毒的，包括：其他緩沖劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑如edta；金屬?gòu)?fù)合物(例如，zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；可生物降解的聚合物，如聚酯；和/或成鹽的抗衡離子，例如鈉。

本文中的制劑還可以含有多于一種的、治療特別指征所必需的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地具有對(duì)其他蛋白質(zhì)沒(méi)有不利影響的互補(bǔ)活性的蛋白質(zhì)。例如，在單個(gè)制劑中提供結(jié)合所需的靶(例如，受體或抗原)的兩種或多種抗體是理想的。此類(lèi)蛋白質(zhì)以對(duì)預(yù)期目的有效的量合適地組合存在。

體內(nèi)施用所使用的制劑必需是無(wú)菌的。可以通過(guò)在凍干和重構(gòu)之前或之后無(wú)菌濾膜過(guò)濾，來(lái)方便的實(shí)現(xiàn)。備選地，可以通過(guò)例如將除蛋白質(zhì)以外的成分在約120℃高壓滅菌約30分鐘，實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)混合物的滅菌。

在將蛋白質(zhì)、任選的凍干保護(hù)劑和其他任選的組分一起混合后，將制劑凍干。有多種不同的凍干機(jī)可用于該目的，例如hull50^tm(hull，美國(guó))或gt20^tm(leybold-heraeus，德國(guó))凍干機(jī)。凍干是通過(guò)冷凍制劑，并且隨后在適合初步干燥的溫度下使冰從冰凍內(nèi)含物中升華來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在該條件下，產(chǎn)品溫度低于制劑的共晶點(diǎn)或塌陷溫度。通常，在合適的壓力下(通常是從約50-250mtorr)，初步干燥的貯存溫度(shelftemperature)范圍是從約-30至25℃(條件是產(chǎn)物在初步干燥的過(guò)程中保持冷凍)。制劑、裝有樣品的容器(例如，玻璃瓶)的大小和類(lèi)型，以及液體的體積，將主要決定干燥所需的時(shí)間，所述時(shí)間范圍從若干小時(shí)至若干天(例如，40-60hrs)。任選地，取決于產(chǎn)品中所需的剩余濕度水平，還可以實(shí)施次級(jí)干燥階段。實(shí)施次級(jí)干燥的溫度是在約0-40℃的范圍，主要取決于容器的類(lèi)型和大小，和所使用的蛋白質(zhì)的類(lèi)型。例如，凍干的整個(gè)除水階段的貯存溫度可以是從約15-30℃(例如，約20℃)。次級(jí)干燥所需的時(shí)間和壓力是生產(chǎn)合適的凍干餅的時(shí)間和壓力，取決于例如溫度和其他的參數(shù)。次級(jí)干燥的時(shí)間由產(chǎn)物中所需的剩余濕度水平?jīng)Q定，通常需要至少約5小時(shí)(例如，10-15小時(shí))。壓力可以與初級(jí)干燥步驟過(guò)程中使用的壓力相同。根據(jù)制劑和瓶大小，冷凍干燥條件可以變化。

在向患者施用前，用可藥用的稀釋劑重構(gòu)凍干的制劑，使重構(gòu)的制劑中的蛋白質(zhì)濃度是至少約50mg/ml，例如從約50mg/ml至約400mg/ml，備選地從約80mg/ml至約300mg/ml，備選地從約90mg/ml至約150mg/ml。當(dāng)需要皮下遞送重構(gòu)的制劑時(shí)，重構(gòu)的制劑中的此類(lèi)高蛋白質(zhì)濃度被認(rèn)為是特別有用的。然而，對(duì)于其他施用途徑，例如靜脈內(nèi)施用，重構(gòu)的制劑中較低的蛋白質(zhì)濃度可為理想的(例如，在重構(gòu)的制劑中從約5-50mg/ml，或從約10-40mg/ml蛋白質(zhì))。在某些實(shí)施方案中，重構(gòu)的制劑中的蛋白質(zhì)濃度顯著高于預(yù)凍干的制劑中的蛋白質(zhì)濃度。例如，重構(gòu)的制劑中的蛋白質(zhì)濃度可以是預(yù)凍干的制劑中的濃度的約2-40倍，備選地3-10倍，備選地3-6倍(例如，至少3倍或至少4倍)。

重構(gòu)一般發(fā)生在約25℃的溫度下，以保證充分水合，但需要時(shí)也可以使用其他溫度。重構(gòu)所需的時(shí)間取決于例如稀釋劑的類(lèi)型、賦形劑和蛋白質(zhì)的量。示例性的稀釋劑包括無(wú)菌水、注射用抑菌水(bwf)、ph緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)、無(wú)菌鹽溶液、ringer溶液或葡萄糖溶液。稀釋劑任選地含有防腐劑。示例性的防腐劑如上所述，優(yōu)選的防腐劑是芳香醇，例如苯甲醇或酚醇。所使用的防腐劑的量通過(guò)評(píng)估不同防腐劑濃度與蛋白質(zhì)的相容性和防腐效力測(cè)試來(lái)決定。例如，如果防腐劑是芳香醇(例如，苯甲醇)，它可以以從約0.1-2.0％，并且優(yōu)選地從約0.5-1.5％，但最優(yōu)選地從約1.0-1.2％的量存在。

優(yōu)選的，每小瓶重構(gòu)的制劑具有少于6000個(gè)、大小≥10μm的顆粒。

通過(guò)混合具有所需的純度的活性成分和任選的可藥用的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，制備用于儲(chǔ)藏的治療性制劑(remington′spharmaceuticalsciences，第18版，mackpublishingco.，easton，pa.18042[1990])。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所使用的劑量和濃度下，對(duì)受體是無(wú)毒的，并包括緩沖劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素e、偏亞硫酸氫鈉、防腐劑、isotonicifier、穩(wěn)定劑、金屬?gòu)?fù)合物(例如，zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)，和/或螯合劑，例如edta。

當(dāng)治療劑是抗體片段時(shí)，特異性結(jié)合靶蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最小片段是優(yōu)選的。例如，基于抗體的可變區(qū)序列，可以設(shè)計(jì)保留結(jié)合靶蛋白序列的能力的抗體片段，或者甚至肽分子。此類(lèi)肽可以是化學(xué)合成的和/或通過(guò)重組dna技術(shù)生產(chǎn)的(參見(jiàn)例如，marasco等人，proc.natl.acad.sci.usa90：7889-7893[1993])。

緩沖液用于控制ph在優(yōu)化治療效果的范圍內(nèi)，尤其是當(dāng)穩(wěn)定性是ph依賴(lài)性的情況下。緩沖液優(yōu)選以從約50mm至約250mm的濃度存在。用于本發(fā)明的合適的緩沖劑包括有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸，及其鹽。例如，檸檬酸、磷酸、琥珀酸、酒石酸、延胡索酸、葡萄糖酸、草酸、乳酸、乙酸。此外，緩沖液可以由組氨酸和三甲基胺鹽如tris組成。

添加防腐劑以延緩微生物生長(zhǎng)，通常以從0.2％-1.0％(w/v)的范圍存在。用于本發(fā)明的合適的防腐劑包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲銨、苯甲烴銨鹵化物(例如氯、溴、碘)、苯索氯銨、硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)例如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；兒茶酚、雷瑣酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲苯酚。

存在滲漲度劑，有時(shí)被稱(chēng)為“穩(wěn)定劑”，用于調(diào)節(jié)或維持液體組合物的滲透壓。當(dāng)與大的帶電生物分子(例如蛋白質(zhì)和抗體)使用時(shí)，通常被稱(chēng)為“穩(wěn)定劑”是因?yàn)樗鼈兛梢耘c氨基酸側(cè)鏈的帶電基團(tuán)相互作用，從而減少分子間和分子內(nèi)相互作用的可能性?？紤]其他成分的相對(duì)量，滲漲度劑存在的量可以是按重量計(jì)在0.1％至25％之間的任何量，優(yōu)選1至5％。優(yōu)選的滲漲度劑包括多羥基糖醇，優(yōu)選三羥基或更多的糖醇，例如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。

其他賦形劑包括可用作一種或多種下列物質(zhì)的活性劑：(1)增量劑，(2)溶解性增強(qiáng)劑，(3)穩(wěn)定劑和(4)防止變性或吸附到容器壁上的活性劑。此類(lèi)賦形劑包括：多羥基糖醇(以上枚舉的)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機(jī)糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環(huán)多醇(例如，肌醇)聚乙二醇；含有硫的還原劑，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三糖例如棉子糖；和多糖例如糊精或葡聚糖。

為了體外施用制劑，其必須是無(wú)菌的?？梢酝ㄟ^(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾使制劑無(wú)菌。本文中的治療性組合物一般放在具有無(wú)菌進(jìn)入口的容器中，例如靜脈內(nèi)輸液袋或具有可以用皮下注射針頭穿刺的瓶塞的小瓶。

施用途徑是根據(jù)已知的和可接受的方法的，如，通過(guò)單次或多次大丸劑或以合適的方式在較長(zhǎng)時(shí)間段灌注，例如，通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、損害內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)的途徑注射或灌注、局部施用、吸入、持續(xù)釋放或緩釋的方式。

本文中的制劑還可以含有一種以上的、治療特定指征必需的活性化合物，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性的、不彼此不利地影響的那些化合物。備選地或額外地，組合物可以包含細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)抑制劑。此類(lèi)分子以對(duì)預(yù)期目的有效的量合適地組合存在。

活性成分還可以包載在通過(guò)例如凝聚技術(shù)或界面聚合所制備的微膠囊，例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊和多聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或粗乳劑中。此類(lèi)技術(shù)公布在remington′spharmaceuticalsciences，第18版中，見(jiàn)上文。

可以制備持續(xù)釋放的制品。持續(xù)釋放的制品的合適實(shí)例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為成形制品的形式，例如膜狀或微膠囊狀。持續(xù)釋放的基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸)，或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,773,919)、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如luprondepot^tm(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮氨酰脯氨酸醋酸鹽組成的可注射微球)和聚-d-(-)-3-羥基丁酸。已經(jīng)用人生長(zhǎng)激素(rhgh)、干擾素-(rhifn-)、白介素-2和mnrpg120成功地實(shí)施了重組蛋白的微膠囊化，用于持續(xù)釋放。johnson等人，nat.med.2：795-799(1996)；yasuda等人，biomed.ther.27：1221-1223(1993)；hora等人，bio/technology8：755-758(1990)；cleland，″designandproductionofsingleimmunizationvaccinesusingpolylactidepolyglycolidemicrospheresystems，″invaccinedesign：thesubunitandadjuvantapproach，powell和newman編著(plenumpress：newyork，1995)，第439-462頁(yè)；wo97/03692；wo96/40072；wo96/07399；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,654,010。

由于其生物相容性和廣泛的生物可降解的性質(zhì)，可以使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)聚合物開(kāi)發(fā)這些蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放的制劑。plga的降解產(chǎn)物——乳酸和羥基乙酸，可以在人體內(nèi)快速清除。此外，可以根據(jù)其分子量和組成，從數(shù)月至數(shù)年調(diào)節(jié)該聚合物的可降解性。lewis，″controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer″，在biodegradablepolymersasdrugdeliverysystems(marceldekker；newyork，1990)，m.chasin和r.langer(編著)第1-41頁(yè)。

聚合物(如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸)使得分子能夠在100天的時(shí)間釋放，而某些水凝膠則在較短的時(shí)間段釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)膠囊化的抗體在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存留時(shí)，它們可能由于暴露在37℃的濕度下而變性或聚集，導(dǎo)致喪失生物學(xué)活性，并可能改變免疫原性?？梢愿鶕?jù)所涉及的機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)理性的對(duì)策用于穩(wěn)定化。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)二硫鍵交換而形成分子間s-s鍵，則可以通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制含濕量、使用恰當(dāng)?shù)奶砑觿┖烷_(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物，來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。

脂質(zhì)體或類(lèi)蛋白質(zhì)組合物還可用于配制本文公布的蛋白質(zhì)或抗體。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,925,673和5,013,556。

可以通過(guò)使用無(wú)毒的“水溶性多價(jià)金屬鹽”增強(qiáng)本文描述的蛋白質(zhì)和抗體的穩(wěn)定性。實(shí)例包括ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、fe²⁺、fe³⁺、cu²⁺、sn²⁺、sn³⁺、al²⁺和al³⁺。可以與上述多價(jià)金屬陽(yáng)離子形成水溶性鹽的陰離子實(shí)例包括從無(wú)機(jī)酸和/或有機(jī)酸形成的陰離子。此類(lèi)水溶性鹽在水中(20℃時(shí))具有至少約20mg/ml，備選地至少約100mg/ml，備選地至少約200mg/ml的溶解度。

可用于形成“水溶性多價(jià)金屬鹽”的合適的無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、醋酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸?？梢允褂玫暮线m有機(jī)酸包括脂肪族羧酸和芳香族酸。該定義內(nèi)的脂肪族酸可被定義為飽和的或不飽和的c2-9羧酸(例如，脂肪族單羧酸、二羧酸和三羧酸)。例如，該定義內(nèi)的單羧酸包括飽和的c2-9單羧酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和capryonic，而不飽和的c2-9單羧酸丙烯酸、propriolic甲基丙烯酸、丁烯酸和異丁烯酸。示例性的二羧酸包括飽和的c2-9二羧酸丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不飽和的c2-9二羧酸包括馬來(lái)酸、延胡索酸、檸康酸和甲基延胡索酸。示例性的三羧酸包括飽和的c2-9三羧酸丙三羧酸和1，2，3-丁三羧酸。此外，該定義的羧酸還可以含有一個(gè)或兩個(gè)羥基，形成羥基羧酸。示例性的羥基羧酸包括乙醇酸、乳酸、甘油酸、羥基丙二酸、蘋(píng)果酸、酒石酸和檸檬酸。該定義內(nèi)的芳香酸包括苯甲酸和水楊酸。

可用于幫助穩(wěn)定本發(fā)明的膠囊化的多肽的常用水溶性多價(jià)金屬鹽包括例如：(1)無(wú)機(jī)酸金屬鹽鹵化物(例如，氯化鋅、氯化鈣)、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和硫氰酸鹽；(2)脂肪族羧酸金屬鹽(例如，醋酸鈣、醋酸鋅、丙酸鈣、乳酸鋅和酒石酸鋅)；和(3)苯甲酸鹽的芳香族羧酸金屬鹽(例如，苯甲酸鋅)和水楊酸鹽。

為了預(yù)防或治療疾病，活性劑的恰當(dāng)劑量取決于如上所定義的的待治療的疾病的類(lèi)型、疾病的嚴(yán)重程度和病程、是出于預(yù)防還是治療目的施用活性劑、先前的療法、患者的臨床史和對(duì)活性劑的應(yīng)答，以及主治醫(yī)生的自主裁量。適合以一次或在系列治療中對(duì)患者施用活性劑。

本發(fā)明的方法可與治療病癥的已知方法組合，作為組合的或額外的治療步驟，或者作為療法制劑的額外組分。

本發(fā)明的藥物組合物的劑量和所需的藥物濃度可以取決于預(yù)期的特定用途而改變。確定恰當(dāng)?shù)膭┝炕蚴┯猛緩綖楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所知曉。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了用于確定人類(lèi)療法的有效劑量的可靠指導(dǎo)?？梢宰裱璵ordenti，j.和chappell，w.″theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics，″intoxicokineticsandnewdrugdevelopment，yacobi等人編著，pergamonpress，newyork1989，第42-46頁(yè)設(shè)置的規(guī)則，實(shí)施有效劑量的種間類(lèi)推(interspeciesscaling)。

當(dāng)體內(nèi)施用本文所述多肽或抗體時(shí)，普通劑量可以是每天從約10ng/kg哺乳動(dòng)物體重多至約100mg/kg哺乳動(dòng)物體重或更多，優(yōu)選約1mg/kg/天至10mg/kg/天，取決于施用途徑。文獻(xiàn)中提供了對(duì)特定劑量和遞送方法的指導(dǎo)；參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,657,760；5,206,344或5,225,212。以下內(nèi)容也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，即，不同的制劑對(duì)于不同的治療和不同的病癥是有效的，且預(yù)期用來(lái)治療特定器官或組織的施藥可能需要以不同于對(duì)另一種器官或組織的施藥方式的方式來(lái)遞送。此外，可以通過(guò)一次或多次分開(kāi)的施用或通過(guò)連續(xù)灌注來(lái)施用劑量。對(duì)于在若干天或更久的時(shí)間的重復(fù)施藥，根據(jù)病況，持續(xù)治療直到出現(xiàn)對(duì)疾病癥狀的理想抑制作用。然而，其他劑量方案也可以是有用的。通過(guò)常規(guī)技術(shù)和測(cè)定，可以方便地監(jiān)控該療法的進(jìn)展。

根據(jù)已知的方法，向需要用蛋白質(zhì)治療的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)施用本發(fā)明的制劑(包括但不限于重構(gòu)的制劑)，如作為大丸劑或通過(guò)連續(xù)灌注一段時(shí)間靜脈內(nèi)施用，通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、鞘膜內(nèi)、口服、局部或吸入的途徑。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，制劑通過(guò)皮下(即，皮膚下)施用給哺乳動(dòng)物。出于此類(lèi)目的，可以使用注射器注射制劑。然而，用于施用制劑的其他裝置也是可獲得的，例如注射裝置(例如，inject-ease^tm和genject^tm裝置)；注射筆(例如genpen^tm)；自動(dòng)注射裝置、無(wú)針裝置(例如，medijector^tm和biojector^tm)；和皮下膜片(patch)遞送系統(tǒng)。

在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于單劑量施藥單元的試劑盒。此類(lèi)試劑盒包含治療性蛋白質(zhì)或抗體的水性制劑的容器，包括單室或多室的預(yù)填充注射器。示例性的預(yù)填充注射器可獲得自vettergmbh，ravensburg，德國(guó)。

蛋白質(zhì)的恰當(dāng)劑量(“療法有效量”)取決于，例如，待治療的病況，病況的嚴(yán)重程度和病程，蛋白質(zhì)是出于預(yù)防還是治療目的施用的，先前療法，患者的臨床史和對(duì)蛋白質(zhì)的應(yīng)答性，所使用的蛋白質(zhì)類(lèi)型，和主治醫(yī)生的自由裁量。以一次或經(jīng)過(guò)系列治療對(duì)患者合適地施用蛋白質(zhì)，而且可以在診斷后任何的時(shí)間對(duì)患者施用蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以作為唯一治療施用，或者與對(duì)于治療考慮的病況有用的其他藥物或療法聯(lián)合施用。

當(dāng)所選擇的蛋白質(zhì)是抗體時(shí)，對(duì)患者施用的初始候選劑量是從約0.1-20mg/kg，例如，通過(guò)一次或多次分開(kāi)的施用。然而，其他劑量方案也可以是有用的。通過(guò)常規(guī)技術(shù)可以方便地監(jiān)控該療法的進(jìn)展。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有制劑、并且優(yōu)選地提供了關(guān)于其使用說(shuō)明書(shū)的制品。制品包含容器。合適的容器包括例如瓶、小瓶(例如，雙室小瓶)、注射器(例如，單室或雙室注射器)和試管。容器可以由多種材料形成，例如玻璃或塑料。裝有制劑的容器上或與容器相關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽可以指明重構(gòu)或使用的說(shuō)明。標(biāo)簽還可以表明制劑是用于皮下施用或預(yù)期用于皮下施用的。裝有制劑的容器可以是多次使用的小瓶，其允許重復(fù)施用(例如，2-6次施用)重構(gòu)的制劑。制品還可以包含第二個(gè)容器，其包含合適的稀釋劑(例如，bwfi)。在混合稀釋劑和凍干的制劑后，重構(gòu)的制劑中的蛋白質(zhì)終濃度一般是至少50mg/ml。制品還可以包含基于商業(yè)和用戶(hù)的立場(chǎng)所需要的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭、注射器和具有使用說(shuō)明的包裝說(shuō)明書(shū)。

通過(guò)下列實(shí)施例將更全面的理解本發(fā)明。但其不應(yīng)被視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本公開(kāi)內(nèi)容全文的所有引用都明確地通過(guò)引用整合到本文中。

實(shí)施例1：對(duì)脂肪酸、聚山梨酸酯和poe山梨聚糖對(duì)蛋白質(zhì)聚集的作用的研究

本實(shí)施例說(shuō)明了聚山梨酸酯、脂肪酸和poe山梨聚糖如何影響水性溶液中的蛋白質(zhì)聚集。

使用攪拌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集分析，評(píng)價(jià)poe山梨聚糖針對(duì)溶液中攪拌誘導(dǎo)的抗il13單克隆抗體的聚集的保護(hù)性作用。具體而言，在該研究中，制備與下列潛在的穩(wěn)定化添加物組合的、含有1mg/ml抗il13單克隆抗體的緩沖溶液(20mmhis-oac，ph5.7)：

(i)無(wú)添加物，對(duì)照；

(ii)月桂酸(29ppm)；

(iii)月桂酸(29ppm)和聚山梨酸酯20(24ppm)；

(iv)poe山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”(150ppm)；

(v)poe山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”(150ppm)和聚山梨酸酯20(24ppm)；

(vi)poe山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”(150ppm)和月桂酸(29ppm)；

(vii)poe山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”(150ppm)，月桂酸(29ppm)和聚山梨酸酯20(24ppm)；

(viii)聚山梨酸酯20(24ppm)。

將9ml含有單克隆抗體的制劑存放到分開(kāi)的15mlformavitrium小瓶(一式三份)中，密封小瓶，然后允許在臺(tái)式振蕩器上在室溫?cái)嚢?70rpm)0小時(shí)、4小時(shí)或24小時(shí)。完成時(shí)，立即對(duì)每個(gè)小瓶的內(nèi)含物進(jìn)行uv光譜測(cè)定法分析(340-360nm)，測(cè)量溶液的濁度。使用1cm路徑長(zhǎng)度室和agilent8453uv分光光度計(jì)在25℃下獲得濁度。將在沒(méi)有蛋白質(zhì)制劑生色團(tuán)吸光的340、345、350、355和360nm處的吸光值進(jìn)行平均，并可以測(cè)定不可溶的蛋白質(zhì)聚集物的散射作用。在上述波長(zhǎng)下的平均吸收值代表樣品的濁度。在這方面，本領(lǐng)域普遍已知含有蛋白質(zhì)的溶液的濁度與溶液中蛋白質(zhì)聚集的量直接且定量地相關(guān)(例如參見(jiàn)，dani等人，j.pharm.sci.，96(6)：1504-1517(2007))。這些分析的結(jié)果顯示在圖1中。

圖1中顯示的數(shù)據(jù)表明，某些聚山梨酸酯降解物(包括脂肪酸、月桂酸)對(duì)水性溶液中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性具有不利的作用，并且在攪拌時(shí)引起蛋白質(zhì)聚集。相反，向含有抗體的水性溶液中添加poe山梨聚糖防止了在攪拌時(shí)蛋白質(zhì)聚集物的形成。因此，這些數(shù)據(jù)表明了poe山梨聚糖具有在攪拌時(shí)防止蛋白質(zhì)聚集的作用，因此增強(qiáng)了溶液中的治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

實(shí)施例2：對(duì)poe山梨聚糖和peg對(duì)蛋白質(zhì)聚集的作用的研究

本實(shí)施例說(shuō)明了poe山梨聚糖和peg作為防止或降低蛋白質(zhì)聚集的穩(wěn)定劑的用途。

使用攪拌誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集分析，評(píng)價(jià)多種poe山梨聚糖和peg針對(duì)溶液中攪拌誘導(dǎo)的兩種單克隆抗體(抗il13和抗ige抗體)的聚集的保護(hù)性作用。

在這組研究中，制備含有1mg/ml抗il13抗體(20mmhis-oac，ph5.7)或抗ige抗體(his-hiscl，ph6.0)的緩沖溶液，其中具有下列添加物：

(i)無(wú)添加物，對(duì)照；

(ii)濃度為200ppm的poe山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”；

(iii)濃度為1000ppm的poe山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”；

(iv)濃度為5000ppm的poe山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”；

(v)濃度為200ppm的peg1000；

(vi)濃度為1000ppm的peg1000；

(vii)濃度為5000ppm的peg1000；

(viii)濃度為200ppm的peg6000；

(ix)濃度為1000ppm的peg6000；

(x)濃度為5000ppm的peg6000。

將9ml含有單克隆抗體的每種制劑存放到分開(kāi)的15mlformavitrium小瓶(一式三份)中，密封小瓶，然后允許在臺(tái)式振蕩器上在室溫?cái)嚢?70rpm)0小時(shí)、4小時(shí)或24小時(shí)。完成時(shí)，立即對(duì)每個(gè)小瓶的內(nèi)含物進(jìn)行下列分析，(a)uv光譜測(cè)定法分析，以測(cè)量過(guò)濾后的蛋白質(zhì)濃度，(b)uv光譜測(cè)定法分析(340-360nm)，以測(cè)量溶液的濁度，和(c)不透光度(lightobscuration)分析，用于測(cè)定蛋白質(zhì)顆粒大小和分布。

a.uv光譜測(cè)定法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度

在如上所述進(jìn)行振蕩后，立即過(guò)濾含有蛋白質(zhì)的溶液，以移除蛋白質(zhì)聚集物，然后通過(guò)uv光譜測(cè)定法確定濾液中的蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)濃度數(shù)據(jù)是使用0.5或1cm路徑長(zhǎng)度室和agilent8453uv分光光度計(jì)在25℃獲得的。在278nm處使用的消光系數(shù)e為1.45和1.60mlmg^-1cm^-1，來(lái)測(cè)定通過(guò)0.2μm注射器式濾器過(guò)濾后的抗體濃度。從在278nm處的吸光值中減去在320nm處的吸光值，來(lái)計(jì)算散射作用。在這方面，本領(lǐng)域普遍已知可以使用uv吸收分析定量地測(cè)量含有蛋白質(zhì)的溶液中的蛋白質(zhì)濃度(例如參見(jiàn)，liu等人，j.pharm.sci.，94(9)：1928-1940(2005))。對(duì)于抗il13抗體和抗ige抗體獲得的數(shù)據(jù)的結(jié)果分別顯示在圖2和3中。

圖2和3中的數(shù)據(jù)表明，攪拌未處理的對(duì)照抗體制劑誘導(dǎo)可測(cè)量的并且顯著的聚集以及在過(guò)濾時(shí)的蛋白質(zhì)損失。相反，添加全部測(cè)試的多種濃度的poe山梨聚糖或peg都防止攪拌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集物形成，并因此防止過(guò)濾時(shí)的蛋白質(zhì)損失。這些數(shù)據(jù)表明，poe山梨聚糖和聚乙二醇通過(guò)防止或降低溶液中的蛋白質(zhì)聚集物形成，而在水性溶液中作為有效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑發(fā)揮功能。

b.uv光譜測(cè)定法測(cè)量溶液濁度

如上所述，在340-360nm處的uv光譜測(cè)定法提供了定量地測(cè)定溶液中存在的蛋白質(zhì)聚集物的量的有效手段，其中濁度與存在的聚集的蛋白質(zhì)的量直接相關(guān)。從抗il13抗體和抗ige抗體的濁度分析獲得的結(jié)果分別顯示在圖4和5中。

圖4和5中的數(shù)據(jù)表明，攪拌未處理的對(duì)照抗體制劑誘導(dǎo)其中可測(cè)量的和顯著的抗體聚集。相反，添加全部測(cè)試的多種濃度的poe山梨聚糖或peg都防止和/或降低了攪拌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集物形成。這些數(shù)據(jù)表明，poe山梨聚糖和聚乙二醇通過(guò)防止或降低溶液中的蛋白質(zhì)聚集物形成，而在水性溶液中作為有效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑發(fā)揮功能。

c.測(cè)定顆粒大小分布

還分析上述含有抗體的水性溶液，以測(cè)定其中含有的蛋白質(zhì)的顆粒大小分布。具體而言，使用與hiac/royco3000a液體注射器采樣儀、hrld-150傳感器相連的hiac/royco9703液體顆粒計(jì)數(shù)器，在室溫下測(cè)量在2至50μm之間的不可溶的顆粒的數(shù)量和大小，并使用pacificspec2.0版軟件進(jìn)行分析。檢測(cè)的上限是～18000顆粒/ml，并且超過(guò)該閾值的樣品經(jīng)過(guò)恰當(dāng)稀釋后進(jìn)行測(cè)量。以每次注射1.0ml體積，測(cè)量每個(gè)樣品4次。丟棄第1次注射，從最后3次注射獲得平均值。在每次樣品分析之間，用注射用水清洗系統(tǒng)，至儀器的2μm顆粒計(jì)數(shù)＜10?！?、5、10、15、25、35和50μm的亞可見(jiàn)(sub-visible)的顆粒表示為每ml的累積計(jì)數(shù)。

從這些分析獲得的結(jié)果分別顯示在圖6-11中。圖6-11中的數(shù)據(jù)表明，攪拌未處理的對(duì)照抗體制劑誘導(dǎo)其中可測(cè)量的和顯著的抗體聚集。相反，添加全部測(cè)試的多種濃度的poe山梨聚糖或peg都防止和/或降低了攪拌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集物形成。這些數(shù)據(jù)表明，poe山梨聚糖和聚乙二醇通過(guò)防止或降低溶液中的蛋白質(zhì)聚集物形成，而在水性溶液中作為有效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑發(fā)揮功能。