本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制嗜水氣單胞菌感染的藥物組合物，用于預(yù)防和治療嗜水氣單胞菌感染引起的水產(chǎn)動物疾病。

背景技術(shù)：

厚樸又名紫樸，是一種常見的中草藥，主要分布于我國四川、湖北等地。中藥厚樸具有行氣化濕、溫中止痛等功效，對常見的致病菌具有較強的抑菌作用。木脂體類化合物是厚樸的主要化學(xué)成分，其中厚樸酚、和厚樸酚等化合物為產(chǎn)生藥理學(xué)活性的主要成分。二氫楊梅素是提取自葡萄屬植物藤茶的提取物，是一種黃酮類化合物，在抗氧化、抗腫瘤和抗炎等方面有較好的效果。但目前尚未見到有關(guān)以二氫楊梅素、和厚樸酚治療嗜水氣單胞菌感染藥物的報道。

嗜水氣單胞菌是一種廣泛分布于自然界中的一種條件性致病菌，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，是一種典型的人-獸-魚共患致病菌。近年來隨著人們對水產(chǎn)品消費的日益增加，嗜水氣單胞菌感染人的事件時有發(fā)生，對人類健康產(chǎn)生了嚴重的威脅。另一方面，由于近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展導(dǎo)致抗生素類藥物在養(yǎng)殖過程中大量使用，導(dǎo)致細菌耐藥性加重，因此以抗生素為主的治療手段面臨極大的局限性。因此尋找新的抗菌機制對于水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物研發(fā)刻不容緩。近年來研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌分泌的外毒素是其導(dǎo)致各種疾病的主要原因，其中氣溶素是嗜水氣單胞菌分泌的最重要的毒力因子之一，在其致病過程中起關(guān)鍵作用，不表達氣溶素的嗜水氣單胞菌的菌株致病力顯著下降甚至消失。因此，以氣溶素為靶標設(shè)計藥物對嗜水氣單胞菌感染的治療具有重要的意義。通過本研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素聯(lián)合和厚樸酚使用可以降低二氫楊梅素的抑菌濃度，提高抑菌活性，結(jié)合和厚樸酚具有抑制氣溶素表達的作用，在提高二氫楊梅素抗菌活性的同時通過和厚樸酚降低細菌的致病性，提高感染魚模型的存活率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供一種抑制嗜水氣單胞菌感染的藥物組合物，所述的藥物組合物由二氫楊梅素、和厚樸酚組成，在提高二氫楊梅素抗菌活性的同時通過和厚樸酚降低細菌的致病性。

本發(fā)明的另一個目的是在于提供一種抑制嗜水氣單胞菌感染的藥物組合物在制備預(yù)防或治療水產(chǎn)動物嗜水氣單胞菌的藥物中的應(yīng)用，實驗動物模型存活率的影響證實二氫楊梅素聯(lián)合和厚樸酚可以對水產(chǎn)動物嗜水氣單胞菌感染起到治療作用，該藥物具有劑量低、毒副作用小、殘留量低、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，可以作為藥物制劑和飼料添加劑。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種抑制嗜水氣單胞菌感染的藥物組合物，其特征在于：所述的藥物組合物由二氫楊梅素、和厚樸酚組成，二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1:2至1:16。

作為優(yōu)選，抑制嗜水氣單胞菌感染的藥物組合物中二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1:2至1:8。

作為優(yōu)選，抑制嗜水氣單胞菌感染的藥物組合物中二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1:2。

一種抑制嗜水氣單胞菌感染的藥物組合物在制備預(yù)防或治療水產(chǎn)動物嗜水氣單胞菌的藥物中的應(yīng)用，對于感染嗜水氣單胞菌的水產(chǎn)動物可每8h口服給藥一次，二氫楊梅素的用量為6.25-50mg/kg，和厚樸酚的用量為100mg/kg，可達到最佳治愈率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：該組合物使用劑量低，治療效果好，不易產(chǎn)生耐藥性，兩種成分均為中藥提取物，對魚體沒有毒副作用，沒有藥物殘留的風(fēng)險。

附圖說明

圖1為和厚樸酚與二氫楊梅素不同組合方式(單獨或聯(lián)合)對嗜水氣單胞菌菌株MS201509的時間殺菌曲線。

圖2為和厚樸酚對不同嗜水氣單胞菌菌株氣溶素溶血活性的作用。

具體實施方式

實施例1：二氫楊梅素與和厚樸酚單獨或聯(lián)合使用對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度測定

采用CLSI推薦的微量稀釋法測定二氫楊梅素、和厚樸酚單獨或聯(lián)合使用的最小抑菌濃度(MICs)。本發(fā)明中涉及7種不同來源的嗜水氣單胞菌菌株均由長江水產(chǎn)研究所保存，名稱見表1。其步驟是：

(1)將配置好的藥物在96孔細胞培養(yǎng)板中倍比稀釋，二氫楊梅素濃度分別為128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL；和厚樸酚濃度分別為512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL，每孔藥物體積100μL；

(2)分別無菌接種嗜水氣單胞菌7個菌株的單菌落至MH培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過夜，離心取菌體用無菌生理鹽水調(diào)整濃度為0.5麥氏比濁度，然后用培養(yǎng)基稀釋至1×10⁶CFU/mL，在96孔細胞培養(yǎng)板中加入菌液，使其最終濃度達到5×10⁵CFU/mL，分別設(shè)置陰性和陽性對照組(陰性對照組不加藥物不加菌液，陽性對照組只加菌液不加藥物)，每個藥物重復(fù)三次，在30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h后觀察結(jié)果，以沒有細菌生長的最低藥物濃度判定為該藥物的最低抑菌濃度。

結(jié)果如表1所示，二氫楊梅素、和厚樸酚單獨使用對嗜水氣單胞菌的MIC范圍分別為4-16μg/mL和32-128μg/mL。

表1和厚樸酚與二氫楊梅素(單獨或聯(lián)合)對受試嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度

實施例2：棋盤式微量稀釋試驗測定二氫楊梅素與和厚樸酚聯(lián)合使用的作用效果

依據(jù)CLSI公布的標準方法測定不同濃度二氫楊梅素聯(lián)合和厚樸酚對嗜水氣單胞菌Ah01的抑制作用。其步驟是：

(1)分別將兩種用于試驗的不同藥物組合在無菌離心管中倍比稀釋，使二氫楊梅素濃度分別為128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL；和厚樸酚濃度分別為512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL，然后分別向96孔細胞培養(yǎng)板中各加入50μL的二氫楊梅素、和厚樸酚，使二氫楊梅素濃度從左到右(1-10)依次降低，和厚樸酚濃度從上到下(A-H)依次降低；

(2)加入嗜水氣單胞菌菌液100μL到96孔細胞培養(yǎng)板中，使菌液終濃度為5×10⁵CFU/mL，分別設(shè)置陰性和陽性對照組(陰性對照組不加藥物不加菌液，陽性對照組只加菌液不加藥物)，每個藥物重復(fù)三次，在30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h后觀察結(jié)果，記錄藥物聯(lián)合應(yīng)用以后兩者的MIC值；藥物聯(lián)合使用以后的抗菌活性通過抑菌濃度指數(shù)FICI(fractioanl inhibitory concerntration index)進行評價：FICI＝MICA藥聯(lián)合/MICA藥單獨+MICB藥聯(lián)合/MICB藥單獨。FICI≤0.5時判定為協(xié)同作用(Synergism,SYN)；0.5＜FICI≤4時判定為無關(guān)作用(indifference,IND)；FICI＞4時判定為為拮抗作用(antagonism,ANT)。

如表1所示，兩種藥物聯(lián)合使用后二氫楊梅素MIC范圍為1-16μg/mL，和厚樸酚MIC范圍為8-32μg/mL。除IHB01菌株外，和厚樸酚聯(lián)合二氫楊梅素在體外具有協(xié)同抑菌作用，可以降低兩種藥物的使用量，降低毒副作用和殘留量。根據(jù)表1得到的聯(lián)合用藥MIC濃度數(shù)據(jù)可知，兩種藥物聯(lián)合使用后組合中二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1：2，1：4，1：8，1：16，四種不同組合對除IHB01以外的6個嗜水氣單胞菌菌株具有協(xié)同抑菌作用。具有協(xié)同抑菌作用的藥物濃度組合可以對嗜水氣單胞菌具有較強的抑制作用，有利于降低藥物使用濃度，提高作用效果，可以作為備選的藥物濃度組合。根據(jù)此方案初步確定該組合物中二氫楊梅素與和厚樸酚質(zhì)量濃度比為1:2至1:16。

實施例3：測定時間殺菌曲線進一步驗證不同組合的二氫楊梅素與和厚樸酚聯(lián)合使用的協(xié)同效應(yīng)

為了驗證實施例2中所得到的協(xié)同效應(yīng)，根據(jù)試驗方法要求取具有協(xié)同效應(yīng)的聯(lián)合用藥后二氫楊梅素與和厚樸酚濃度比為1：2，1：8，1：16的藥物組合，將MS201509菌株作為代表菌株進行時間殺菌曲線測定。細菌培養(yǎng)至OD600約為0.3時分裝為4瓶，每瓶10mL，分別加入以下組合的藥物：1/2MIC和厚樸酚、1/2MIC二氫楊梅素、1/2MIC和厚樸酚+1/2MIC二氫楊梅素、陰性對照，詳見表2。30℃振蕩培養(yǎng)，分別于0、12、24、36和48h取菌液并稀釋后涂板，用計數(shù)器計數(shù)。判定標準：聯(lián)合用藥組細菌數(shù)的對數(shù)比活性較強的藥物組細菌數(shù)的對數(shù)下降大于等于2時判定為具有協(xié)同抑菌作用。如圖1所示，組合A(二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1：2)對MS201509菌株在24h后出現(xiàn)協(xié)同抑菌作用，組合B(二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1：8)對MS201509在48h后出現(xiàn)協(xié)同抑菌作用，組合C(二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1：16)對MS201509在24h后出現(xiàn)協(xié)同抑菌作用。由此結(jié)果可以看出，三種不同組合物對MS201509菌株均具有協(xié)同抑菌作用。該方案再次驗證當組合物中二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1:2至1:16時，這兩種藥物具有協(xié)同抑菌作用。

表2時間殺菌曲線不同組合藥物濃度表

注：根據(jù)J Antimicrob Chemother等雜志報道，時間殺菌曲線試驗時兩種藥物添加到各個試驗組的濃度為單獨使用時測的MIC的1/2，而并非聯(lián)合使用后的MIC，因此此處使用的藥物比例及濃度與組合名稱中的比例不相對應(yīng)。文獻：Synergistic Activity of Econazole-Nitrate and Chelerythrine against Clinical Isolates of Candida albicans,Iranian Journal of Pharmaceutical Research(2014),13(2):567-573.；Comparative evaluation of synergy of combinations ofβ-lactams with fluoroquinolones or a macrolide in Streptococcus pneumonia,J Antimicrob Chemother 2011；66:845–849.

實施例4：和厚樸酚對嗜水氣單胞菌上清液溶血活性的影響

將不同來源的細菌培養(yǎng)至OD600約為0.3時分裝為5瓶，分別加入和厚樸酚使其濃度達到16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL和0μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為2.0時收集菌液，12000rpm離心1min取上清測定上清液的溶血活性。如圖2所示，隨著和厚樸酚濃度的增加上清液的溶血作用逐漸減弱，呈顯著的劑量依賴性，且該藥物具有廣譜性，對所有試驗菌株均有效。通過溶血實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)和厚樸酚通過抑制嗜水氣單胞菌溶血性毒素的表達降低其致病性，和厚樸酚濃度越高其對嗜水氣單胞菌致病因子的抑制作用越強，因此在組合中提高和厚樸酚的比例可以起到更好的治療效果。

實施例5：和厚樸酚聯(lián)合二氫楊梅素對斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染的實驗治療

試驗在100cm×50cm×60cm的水族箱中進行，每天換水并保持水溫在25℃左右。200g左右的健康斑點叉尾鮰經(jīng)麻醉后通過腹腔注射嗜水氣單胞菌Ah01建立人工感染模型。人工感染后2h開始對感染魚灌服以下藥物組合(見表3)，每8h給藥一次。陽性對照組灌服相同體積的生理鹽水作為對照。每組使用斑點叉尾鮰20尾，感染后開始記錄死亡情況，結(jié)果見表4。該結(jié)果表明，人工感染嗜水氣單胞菌的斑點叉尾鮰經(jīng)二氫楊梅素、和厚樸酚藥物不同比例組合藥物治療后可以顯著降低因細菌感染造成的死亡率，其存活率高于單獨使用和厚樸酚或二氫楊梅素。通過動物模型試驗確定當組合物中二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比為1:2 至1:16時，對斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染有治療作用。為了提高治療效果，二氫楊梅素與和厚樸酚的質(zhì)量濃度比優(yōu)選1:2至1:8，濃度比為1:2時對斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染的治療效果最佳。

表3動物模型試驗中不同組合藥物濃度表

注：為了減少試驗分組，兩種藥物單獨使用時均采用最高濃度。

表4不同藥物組合對斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染死亡率的影響