本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療炎癥性疾病的藥物組合物及其用于炎性疾病治療的用途，具體的藥物組合物含有短冠草提取物作為活性成分。
背景技術(shù)：
：炎癥，是機體對于刺激的一種防御反應(yīng)，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙?？梢允歉腥疽鸬母腥拘匝装Y，也可以不是由于感染引起的非感染性炎癥。炎性信號通過環(huán)加氧酶(COX)途徑和脂加氧酶(LOX)途徑產(chǎn)生，并且前列腺素、白三烯、血栓烷等通過這些途徑產(chǎn)生。在炎癥過程中，一方面損傷因子直接或間接造成組織和細胞的破壞，另一方面通過炎癥充血和滲出反應(yīng)，以稀釋、殺傷和包圍損傷因子。同時通過實質(zhì)和間質(zhì)細胞的再生使受損的組織得以修復(fù)和愈合。因此可以說炎癥是損傷和抗損傷的統(tǒng)一過程。更具體的，炎癥是指組織對有害刺激物的生物保護反應(yīng)。炎癥是生物體去除有害刺激物并對由該刺激物的侵入而導(dǎo)致的器官損傷所在的細胞或組織啟動修復(fù)治療過程的防御性反應(yīng)。這一系列過程可能涉及的因子為局部血管組織、體液的各種組織細胞、免疫細胞等。隨著分子生物學(xué)的進步，科研工作者們已嘗試在分子水平上了解炎癥性疾病。并且逐步地揭示了導(dǎo)致炎癥性疾病的因子。炎癥是否會發(fā)生，以及將如何發(fā)展，取決于致炎因子的數(shù)量和種類，機體自身的免疫力強弱，以及是否有有效的防治措施。因此炎癥反應(yīng)的過程和結(jié)果是多樣的，臨床上對于炎癥性疾病的分類一般以炎癥的過程為依據(jù)。大多數(shù)炎癥反應(yīng)的結(jié)果是完全痊愈或者不完全痊愈，即經(jīng)過有效治療或者機體自身的免疫反應(yīng)，損傷部位的滲出液和壞死組織的崩解產(chǎn)物都被液化，最后經(jīng)由淋巴管吸收，使受損組織回復(fù)原有的結(jié)構(gòu)和功能，或者由于機體免疫力低下等原因，受損部位的肉芽被纖維化最終形成癱痕，不能完成回復(fù)原有機構(gòu)和功能。少數(shù)的炎癥反應(yīng)可能遷延不愈轉(zhuǎn)化為慢性炎癥，或者蔓延至損傷組織周圍或經(jīng)由循環(huán)系統(tǒng)蔓延各個臟器乃至全身。近期的研究表明，脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的信號通路與TLRs家族等有關(guān)。炎癥介質(zhì)的效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄因子由TLRs家族激活的細胞信號級聯(lián)反應(yīng)來控制的。LPS誘導(dǎo)的與TRLs相關(guān)的信號通路對于哺乳動物的宿主防御起著至關(guān)重要的作用。LPS介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路中最重要的下游通路是NF-κB信號傳導(dǎo)通路。NF-κB在哺乳動物中細胞中廣泛存在，參與機體的免疫反應(yīng)、細胞分化、炎癥反應(yīng)、與凋亡及其他應(yīng)激反應(yīng)。NF-κB是由Re1蛋白家族的五種蛋白(包括P50、P52、ReIB、c-Rel、P65即ReIA)中的任意兩種蛋白構(gòu)成的二聚體。在靜息細胞，細胞質(zhì)中的NF-KB二聚體與IκB蛋白復(fù)合，NF-κB的核定位信號被掩蓋，在細胞被外來因素刺激時，IκB磷酸化并被降解，NF-κB的核定位信號暴露，NF-κB進入細胞核，結(jié)合了與靶基因增強子順式元件κB序列，啟動轉(zhuǎn)錄。1986年Sen和Bahimoer首先從成熟B淋巴細胞核提取物中檢測到可與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κB序列特異結(jié)合的核蛋白因子。脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB的具體信號通路見圖1，現(xiàn)證實其廣泛存在于真核細胞內(nèi)，能與多種細胞基因啟動子或增強子序列的特定位點發(fā)生特異性結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄和表達，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關(guān)，迄今為止，已證實NF-κB亞家族有七個成員。包括p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、RelA(p65)、RelB、e-Rel。典型的NF-κB是p50和p65的異源二聚體，也是其活性的主要形式。每個NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族成員都可形成同源二聚體或與另一個家族成員形成異源二聚體，所有的NF-κB家族成員在N末端都有一個包含300個氨基酸的保守區(qū)域，即Rel同源結(jié)構(gòu)域(RHD)。這一保守結(jié)構(gòu)域的功能包括：①結(jié)合啟動子和增強子上的κB位點(5'GGGRNNYYCC3，N為任一堿基，R為嘌呤，Y為嘧啶)；②亞基之間通過該結(jié)構(gòu)域相互作用形成同源或者異源二聚體；③RHD結(jié)構(gòu)域也是抑制因子的結(jié)合位點，如hoBs的結(jié)合位點。RHD的c末端含核定位序列(NLS)，在大多數(shù)未受刺激、非疾病狀態(tài)的哺乳動物細胞中，NLS與被稱作NF-κB抑制劑的IκB蛋白結(jié)合而使NF-κB處于無活性狀態(tài)，大部分位于細胞質(zhì)內(nèi)。RelA、RelB、e-Rel的C端含轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transactivationdomain，TAD)。這些TADs可和多種基本轉(zhuǎn)錄因子相互作用，其中包括TATA序列結(jié)合蛋白(TATA-bindingprotein，TBP)、轉(zhuǎn)錄因子ⅡB(transcriptionfactorliB，TFⅡB)和p300/CBP轉(zhuǎn)錄共刺激因子。因此只有RelA、RelB、C-Rel參與形成的NF-κB二聚體能夠激活轉(zhuǎn)錄。p50和p52缺少TAD，它們以3種可能的方式發(fā)揮作用：與含有TAD的家族成員形成異源二聚體來改變κB位點的特異性；形成同源二聚體結(jié)合到κB位點而抑制轉(zhuǎn)錄；召集其他含TAD的蛋白到κB位點來促進轉(zhuǎn)錄。非活化狀態(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IκB（抑制劑κB）結(jié)合于細胞溶質(zhì)中。包括活性氧、趨化因子如TNF-α（腫瘤壞死因子-α）以及LPS（脂多糖）在內(nèi)的多種胞外信號激活I(lǐng)κB激酶。通過這種方式，IκB激酶使IκB磷酸化，使得IκB從NF-κB上解離。由此活化的NF-κB（由p50和p65組成的異二聚體）隨之轉(zhuǎn)位入核，在此與DNA特定序列結(jié)合，從而促進靶基因例如引起炎癥的基因如腫瘤壞死因子、環(huán)氧酶等的表達（樓希文等人，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的核內(nèi)活性調(diào)控[J]．細胞生物學(xué)雜志，2009，31(16)：741-748；ZHANGZ，等人．Nf-Kappab，InflammationandPancreaticCarcinogenesis：NF-KappabasaChemopreventionTarget(Review)[J]．IntJOncol，2006，29(1)：185-192；HAYDENMS，等人，SharedPrinciplesinNF-κBSignaling[J].Cell，2008，132：344-362)。根據(jù)炎癥發(fā)病的誘因，可將炎癥分為免疫因子引起的炎癥、感染因子引起的炎癥、物理因子引起的炎癥如輻射性炎癥以及化學(xué)因子引起的炎癥如胰酶的泌出引起的急性胰腺炎。這些炎癥分類中，最常見的是以感染因子引起的炎癥，類型最多，病因病程也各有差異，常見的感染因子有病毒、蛋白質(zhì)、細菌、真菌等。免疫因子引起的疾病則包括機體的過敏反應(yīng)如花粉過敏以及自身免疫系統(tǒng)的疾病如紅斑狼瘡等。骨關(guān)節(jié)炎(OA)也稱退行性骨關(guān)節(jié)病，多見于中老年人，好發(fā)于負重較大的膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱及手指等部位，主要病變是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生，嚴重影響患者的肢體功能和日常生活，甚至可造成關(guān)節(jié)殘疾，是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一。MendesAF等在對牛關(guān)節(jié)軟骨細胞的研究中發(fā)現(xiàn)軟骨細胞在IL-1的單獨處理下，可以誘導(dǎo)NF-κB的活性和iN0S的表達，促進軟骨細胞的凋亡。IL-lβ還被發(fā)現(xiàn)可以增加MMP-3的表達，同時使蛋白多糖的濃度也隨之降低。IL-1有兩個常見的受體(IL-IRⅠ、IL-1RⅡ)，IL-1通過與靶細胞上的受體結(jié)合而發(fā)揮作用，OA軟骨細胞表面的受體數(shù)量是正常細胞表面的2倍，使OA的軟骨和滑膜細胞對IL-1具有高度的敏感性。潘海樂定量檢測OA模型動物血清、關(guān)節(jié)液中IL-1水平變化，結(jié)果實驗組動物血液、關(guān)節(jié)液中IL-1水平顯著升高，與正常對照組比較有明顯差異。表明IL-1升高與OA病變程度平行，二者呈高度正相關(guān)。ScholaakJF等發(fā)現(xiàn)，OA病人的滑液內(nèi)存在著高濃度的TNF-α，OA滑膜細胞培養(yǎng)液內(nèi)也有高濃度的TNF-α出現(xiàn)，而正常滑膜細胞培養(yǎng)液內(nèi)未能檢出TNF-α。Shimei用免疫組化方法檢測軟骨組織，OA軟骨TNF-α為陽性反應(yīng)，而正常軟骨則為陰性，說明TNF-α可能是OA發(fā)病過程中的重要一環(huán)。目前對TNF-α作用機理了解逐漸清晰，其對抑制軟骨合成，加重炎癥反應(yīng)作用已逐漸明確。炎癥性腸病(Inflammataryboweldisease，IBD)是病因和病理尚未完全清楚的慢性炎癥相關(guān)的自身免疫性疾病。IBD與NF-κB的關(guān)系已日益引起人們的重視，該通路與IBD的關(guān)系也是近年來研究的熱點領(lǐng)域。Neurat等在結(jié)腸炎動物模型中證實炎性結(jié)腸組織中的NF-κB被激活，并進入核內(nèi)與DNA的κB位點結(jié)合。Schrieiber等在IBD患者腸道細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)NF-κBp65水平明顯升高。研究證實UC患者腸粘膜組織、血清及糞便中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等多種細胞因子的表達都增強。通過研究克羅恩病的模型，發(fā)現(xiàn)大量Th-1相關(guān)的細胞因子(包括IFNγ和TNF)，這些因子主要受NF-ΚB的調(diào)節(jié)。通過抑制NF-κB信號通路來治療IBD為臨床提供了一個新思路。變應(yīng)性鼻炎(allergicrhinitis，AR)是發(fā)生在鼻粘膜的變態(tài)反應(yīng)，也是呼吸道變態(tài)反應(yīng)常見的表現(xiàn)形式，有時和支氣管哮喘同時存在。臨床主要特點為鼻癢、噴嚏、鼻分泌亢進、鼻粘膜腫脹。變態(tài)反應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機制實際上是發(fā)生在鼻粘膜的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。變應(yīng)原經(jīng)呼吸道進入人體，經(jīng)巨噬細胞處理，刺激B淋巴細胞變?yōu)闈{細胞，后者產(chǎn)生特異性IgE抗體?，F(xiàn)已證明，鼻粘膜中的特異性IgE抗體主要來自扁桃體。IgE經(jīng)血液到達鼻粘膜，以其Fc段附著于鼻粘膜中肥大細胞、嗜堿粒細胞的細胞膜上，使鼻粘膜外于致敏狀態(tài)。當變應(yīng)原物質(zhì)再次進入鼻粘膜是壞蛋IgE抗體的Fab段結(jié)合，并使相鄰的IgE發(fā)生橋連，結(jié)果使肥大細胞和嗜堿細胞細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，釋放出多種化學(xué)介質(zhì)，主要為組織胺、激肽、白細胞三烯、嗜酸細胞趨化因子、前裂腺素類、血小板活化因子、五羥色胺等。這些介質(zhì)通過它們各自在鼻粘膜血管壁、腺體和神經(jīng)末梢上的受體，使小血管擴張，血管通透性增高，滲出增加，炎性細胞浸潤(以嗜酸細胞為主)，組織水腫，神經(jīng)末梢興奮性增強等。上述病理變化即可導(dǎo)致相應(yīng)的臨床癥狀和體征。有許多研究表明慢阻肺(COPD)患者的氧化應(yīng)激增加。氧化物主要有超氧陰離子(O2-)、羥根(OH)、(HClOH2O2和一氧化氮(NO)等。氧化物可直接作用并破壞許多生化大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，導(dǎo)致細胞功能障礙或細胞死亡，還可以破壞細胞外基質(zhì)；引起蛋白酶-抗蛋白酶失衡；促進炎癥反應(yīng)，如激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，參與多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，如IL-8、TNF-α、NO誘導(dǎo)合成酶和環(huán)氧化物誘導(dǎo)酶等。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了具有不同機制的抗炎藥物。然而由于它們具有副作用，并且在治療一些疾病中，不能有效地作為基礎(chǔ)治療藥物。具體的，目前臨床上常用的抗炎藥有兩大類：一類是當體抗炎藥(Steroidalantiinflammatorydrugs)，由腎上腺皮質(zhì)分泌的糖皮質(zhì)激氫化可的松和其人工合成的衍生物，如氫化可的松、地塞米松等。正常情況下，機體內(nèi)神經(jīng)和體液對糖皮質(zhì)激素的分泌進行雙重調(diào)節(jié)。炎癥初期，甾體抗炎藥能通過抑制毛細血管擴張，減輕水腫和滲出，抑制白血細胞的浸潤和吞噬達到抗炎作用。炎癥后期，甾體能抑制毛細血管和纖維母細胞增生，延緩肉芽產(chǎn)生，從而減輕癱痕和粘連等。甾體抗炎藥作用廣泛，抗炎效果好，非特異性強。但長期大量使用會引發(fā)骨質(zhì)疏松癥、行為異常、癲癰發(fā)作、白內(nèi)障、高血壓和動脈粥樣硬化等。另一類是非當體抗炎藥(NSAIDs，non-steroidalanti-innammatorydrugs)，即臨床上用于解熱鎮(zhèn)痛的抗炎藥如保泰松、阿司匹林等。不具有甾體結(jié)構(gòu)的抗炎藥物就稱之為非甾體抗炎藥?？赏藷帷⒅雇?，抗炎、抗風(fēng)濕。非甾體體藥物主要有毗哇酮類、水楊酸類、丙酸類、芬那酸類、苯胺類、口引睬類。其分子結(jié)構(gòu)差異較大，但都是作用于環(huán)氧酶來抑制前列腺素的合成和釋放，干擾嗜中性細胞的吞噬能力、趨化性和殺傷性，以此抑制白三烯的產(chǎn)生。非幽體抗炎藥導(dǎo)致一些不良反應(yīng)。10％的患者在治療劑量下出現(xiàn)輕度肝臟受損，低于5％的個體出現(xiàn)耳鳴、頭暈、嗜睡等，在泌尿系統(tǒng)方面嚴重者可致間質(zhì)性腎炎，長期口服NsAIDS的患者發(fā)生腎臟疾病的風(fēng)險率是普通人群的2.1倍。中藥抗炎藥由多種有效成分協(xié)同抗炎，毒副作用相對西藥較小。多數(shù)中藥抗炎機制是在炎癥發(fā)展的不同階段通過不同信號通路抗炎，因此中藥有較好的抗炎效果。通過研究現(xiàn)在對于中藥有效成分的認識加深，對中藥的抗炎機制認識更為全面的，為中藥的研發(fā)提供了理論依據(jù)。許多中藥都具有良好的抗炎效果，如連翹揮發(fā)油、黃連、大蒜、魚腥草、金銀花以及一些復(fù)方等。傳統(tǒng)中藥以復(fù)方為主，現(xiàn)代中藥中單體重要的抗炎作用也被廣泛研究。有報道表明，余甘子、茄根、火絨草、蒼術(shù)、槐角等對棉球肉芽腫增生，耳廓腫脹，足趾腫脹，腔毛細血管通透性增大有顯著抑制作用。近年來，中草藥抗炎成為研究的熱點。從中藥中篩選抗炎藥物具有良好的研究價值和廣泛的市場前景。例如，在NF-κB結(jié)合免疫細胞的特定基因來促進炎癥介質(zhì)表達的思路下，來自日本弘前大學(xué)的研究團隊與來自日本大阪大學(xué)的團隊合作開發(fā)出一種含有模擬NF-κB所結(jié)合的基因的人工DNA的特應(yīng)性疾病治療劑，其通過誘使NF-κB至人工DNA模擬物來抑制NF-κB的活性，并且證明其具有治療的臨床效果。瑞士巴塞爾的諾華制藥公司開發(fā)出并推銷源自吡美莫司的“醫(yī)立妥”作為特應(yīng)性皮炎的治療劑，該治療劑是作用為選擇性抑制引起炎癥的細胞因子合成與釋放的子囊霉素巨內(nèi)酰胺衍生物。此外，韓國嶺南大學(xué)藥學(xué)院的H.W.Chang教授帶領(lǐng)的研究團隊發(fā)現(xiàn)，臭椿和三白草的提取物對炎癥和過敏有治療效果，且市場前景極為可觀。截止到現(xiàn)在，已經(jīng)開發(fā)出許多用于炎癥性疾病的治療劑來靶向疾病發(fā)作所涉及的細胞因子和趨化因子。其中有含有構(gòu)樹和忍冬的提取物的組合物。現(xiàn)有技術(shù)中并未發(fā)現(xiàn)短冠草提取物在治療炎癥中的應(yīng)用。短冠草(SopubiatrifidaBuch.-Ham.exD.Don)，玄參科短冠草屬一年生草本，直立，具單一或少數(shù)的莖，莖高40-90厘米，常在上部多分枝，枝有時偶有3枚輪生，有棱角及條紋，被細柔毛。分布于我國江西、湖南、廣東、廣西、云南、貴州、四川等省區(qū)，印度至菲律賓及非洲也有分布，生于海拔1600-2100米的空曠草坡或荒地中。據(jù)《中華本草》記載，短冠草具有舒筋活絡(luò)，溫腎止痛，主治風(fēng)濕骨痛，胃寒痛，腎虛腰痛。雖然被民間用于上述疾病治療，但并未闡明短冠草的具體抗炎機制。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供用于預(yù)防和治療或改善炎癥性疾病的藥物組合物和皮膚外用劑，其含有作為活性成分的短冠草提取物。本發(fā)明人通過大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)了短冠草提取物的抗炎機制。發(fā)現(xiàn)用短冠草提取物處理時，人工炎癥誘導(dǎo)的巨噬細胞抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，通過這樣抑制NO和PGE2的生成、iNOS和COX-2的表達以及IL-1β和TNF-α的釋放，并顯著下調(diào)Th2-介導(dǎo)的IL-4和IL-13生成。此外，卵清蛋白誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎小鼠模型實驗顯示，短冠草提取物均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中的組胺水平，使炎性介質(zhì)的釋放減少，并減少對鼻黏膜及其血管和腺體的刺激，減輕過敏反應(yīng)癥狀，從而達到治療炎癥的目的。此外，發(fā)現(xiàn)短冠草提取物幾乎沒有細胞毒性，因此其可作為用于預(yù)防或治療各種炎癥病癥的藥物組合物的活性成分，由此得到本發(fā)明。本發(fā)明的另一個目的是提供利用短冠草提取物預(yù)防或治療炎癥性疾病的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和治療炎癥性疾病的藥物組合物，其含有作為活性成分的短冠草提取物。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和治療炎癥性疾病的皮膚外用劑，其含有作為活性成分的短冠草提取物。根據(jù)又一個方面，本發(fā)明提供一種用于治療炎癥性疾病的方法，其包括對有需要的個體施用藥學(xué)有效劑量的短冠草提取物。根據(jù)再一個方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防炎癥性疾病的方法，其包括對有需要的個體施用藥學(xué)有效劑量的短冠草提取物。根據(jù)又一個方面，本發(fā)明提供一種應(yīng)用于用來預(yù)防和治療炎癥性疾病的藥物組合物中的短冠草提取物。根據(jù)再一個方面，本發(fā)明提供一種應(yīng)用于用來預(yù)防和治療炎癥性疾病的皮膚外用劑中的短冠草提取物。除非另外指出，或者上下文明確表明，以下術(shù)語包括下面規(guī)定的含義。本文所使用的術(shù)語“炎癥”旨在涵蓋由外來感染因素(細菌、真菌、病毒、各種過敏原等)侵入形成膿腫的病理狀況。本文所使用的術(shù)語“預(yù)防”是指由于本發(fā)明的藥物組合物的施用而導(dǎo)致的炎癥性疾病發(fā)作和發(fā)展抑制或延緩的任何作用。本文所使用的術(shù)語“治療”、緩解是指由于施用本發(fā)明的組合物而導(dǎo)致炎癥性疾病癥狀改善或者炎癥狀態(tài)有利改變的任何作用。本文所使用的術(shù)語“施用”旨在涵蓋用任何適當?shù)姆椒▽€體提供本發(fā)明的組合物。本文所使用的術(shù)語“個體”旨在涵蓋例如人、猴、犬、山羊、豬、大鼠的患者，其患有炎癥性疾病，其癥狀能夠通過施用本發(fā)明的組合物來改善或者有利改變。本文所使用的術(shù)語“炎性疾病”是炎癥作為它們主要破壞因子的疾病的統(tǒng)稱。炎性疾病的實例包括但不限于急性或慢性支氣管炎、變應(yīng)性鼻炎、CPOD、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、斯耶格倫氏綜合征以及多發(fā)性硬化，并且優(yōu)選過敏性鼻炎和咽喉炎，前者是更加優(yōu)選的。本文所使用的術(shù)語“治療有效劑量”是指以適用于任何藥物治療的合理效益/風(fēng)險比來治療病癥的足夠的組合物的量。該有效量可根據(jù)多種因素而變化，上述因素包括：所治療的病癥的種類、所治療的病癥的嚴重性、藥物活性、藥物敏感性、施用時間、施用途徑、排泄率、治療時間、藥物聯(lián)合施用等。下面將給出本發(fā)明的詳細描述。本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療炎癥性疾病的藥物組合物，其含有作為活性成分的短冠草提取物。本發(fā)明能夠治療的炎癥性疾病實例包括但不限于：急性或慢性支氣管炎、變應(yīng)性鼻炎、CPOD、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、斯耶格倫氏綜合征以及多發(fā)性硬化，以及急性和慢性的炎癥性疾病。本發(fā)明中有用的短冠草提取物可由如下方法制備，包括但不限于下述步驟：1)將短冠草加入提取溶劑以產(chǎn)生滲出液；2)對步驟1)的滲出液進行過濾；并且3)對步驟2)的濾液進行真空濃縮至干燥。其中，步驟1)中可使用任何短冠草，無論其為栽培的或者購買的。本發(fā)明中有用的短冠草為全草。進一步的，關(guān)于提取所使用的溶劑，可以使用水、甲醇、乙醇或者它們的混合物。提取可用但不限于如下方法進行：振蕩提取法、或者回流提取法。提取溶劑按干燥短冠草的5-15倍體積使用。提取溫度可優(yōu)選地設(shè)置在30-100℃的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，提取持續(xù)8-60小時，更為優(yōu)選的是14-32小時。另外，提取可優(yōu)選地重復(fù)二至六次，更為優(yōu)選的是三次。該方法的步驟3)中，濾液可利用但不限于真空離心濃縮器或者真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮。濃縮液可用真空干燥法、減壓干燥法、沸騰干燥法、噴霧干燥法或者冷凍干燥法任意一種進行干燥。進行實驗來考察短冠草提取物是否抑制NF-κB轉(zhuǎn)位入核。為此，用脂多糖(LPS)處理巨噬細胞來誘發(fā)炎癥，用免疫熒光法觀察NF-κB的轉(zhuǎn)位。結(jié)果，檢測出用LPS聯(lián)合短冠草提取物處理的細胞位于核內(nèi)的NF-κB比僅用LPS處理的細胞的少。為了檢測短冠草提取物是否對iNOS蛋白和RNA的表達具有負面作用，用免疫印跡(Westernblotting)、PCR和免疫熒光分析LPS誘導(dǎo)的炎癥下巨噬細胞中的iNOS的表達。用LPS聯(lián)合短冠草提取物處理的細胞中的iNOS水平明顯低于僅用LPS處理的細胞中的水平。類似于iNOS，也對COX-2進行蛋白和RNA水平上表達的分析。觀察到用LPS與短冠草提取物聯(lián)合處理的細胞表達COX-2的水平顯著低于僅用LPS處理的細胞。進行測試來考察NO和PGE2的生成是否受到短冠草提取物對iNOS和COX-2表達的抑制的影響。就此而言，在酶標儀上測量LPS誘導(dǎo)的炎癥下巨噬細胞中NO和PGE2水平。類似地，與僅用LPS處理的細胞相比，用LPS和短冠草提取物聯(lián)合處理的細胞中NO和PGE2的水平都以短冠草提取物劑量依賴的形式顯著降低。通過對細胞活力和對NO生成的抑制活性分析，篩選較好的在短冠草提取物。具體的，細胞用100、250、500μg/ml的短冠草乙醇提取物，100、250、500μg/ml的短冠草石油醚提取物，100、250、500μg/ml的短冠草氯仿提取物，100、250、500μg/ml的短冠草乙酸乙酯提取物以及100、250、500μg/ml的短冠草水提取物來處理，并對細胞活力和NO生成進行分析。短冠草乙醇提取物中幾乎檢測不出細胞毒性，而石油醚提取物和氯仿提取物的毒性隨其劑量的增加而增加。用乙醇、乙酸乙酯或氯仿處理減少了NO的產(chǎn)生。因此，短冠草乙醇提取物被確定為用于預(yù)防和治療炎癥性疾病、過敏性疾病的藥物組合物中最為有效的成分，因為其無細胞毒性并顯著降低NO的產(chǎn)生。此外，檢測了短冠草提取物對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β釋放的抑制活性。用相應(yīng)的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和小鼠IL-1β酶聯(lián)免疫檢測試劑盒)對LPS-誘導(dǎo)的炎癥下的巨噬細胞分析其TNF-α和IL-1β水平。與僅用LPS處理的那些相比，用LPS和短冠草提取物聯(lián)合處理的細胞的TNF-α和IL-1β水平均顯著低下，并且短冠草提取物以劑量依賴的形式降低TNF-α和IL-1β的水平。此外，通過短冠草提取物的作用，進一步可以檢測到細胞因子從脾細胞的釋放。用多種劑量的短冠草提取物孵育脾細胞然后用伴刀豆球蛋白A(ConA)處理。據(jù)ELISA所測，發(fā)現(xiàn)短冠草以劑量依賴的形式降低ConA-誘導(dǎo)的細胞因子IL-4和IL-13的水平。因此，本發(fā)明的短冠草提取物主要抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，通過這樣抑制NO和PGE2的生成、iNOS和COX-2的表達以及IL-1β和TNF-α的釋放，并顯著下調(diào)Th2-介導(dǎo)的IL-4和IL-13生成。此外，短冠草提取物均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中的組胺水平，使炎性介質(zhì)的釋放減少，并減少對鼻黏膜及其血管和腺體的刺激，減輕過敏反應(yīng)癥狀，從而達到治療變應(yīng)性鼻炎的目的。另外，發(fā)現(xiàn)短冠草提取物幾乎沒有細胞毒性。因此，該提取物可作為用于預(yù)防或治療各種炎癥性病癥的藥物組合物活性成分。本發(fā)明的短冠草提取物還可以與藥物可接受的載體制備藥物組合物，并且該藥物組合物可以為各種口服或非口服劑型。對此，本發(fā)明的藥物組合物可以與稀釋劑或賦形劑如填充劑、增稠劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等組合配制。預(yù)期口服給藥的固體制劑可以為片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊等形式。對于這些固體試劑，本發(fā)明的化合物與至少一種賦形劑如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠組合配制。除了單一的賦形劑，可以使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石等。其中，預(yù)期口服給藥的液體制劑為混懸劑、內(nèi)用溶液、乳劑、糖漿等。除了單一的稀釋劑如水或液體石蠟，在液體制劑中可以包含各種賦形劑，例如濕潤劑、甜味劑、芳香劑、防腐劑等。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以為腸胃外劑型，例如無菌水溶液、非水性溶劑、混懸劑、乳劑、凍干劑、栓劑等?？勺⑸涞谋?、聚乙二醇、植物油如橄欖油以及酯如油酸乙酯可以適于非水性溶劑和栓劑。栓劑的基質(zhì)材料包括Witepsol、聚乙二醇、吐溫61、可可油脂、月桂精油脂以及甘油明膠。根據(jù)目的，本發(fā)明的組合物可口服施用或腸胃外施用。對于腸胃外施用，本發(fā)明的組合物施用的途徑可為：外用、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或胸內(nèi)。施用的劑量可根據(jù)患者體重、年齡和性別、健康狀況、飲食、施用時間、施用途徑、排泄率和疾病嚴重性而變化。本發(fā)明的短冠草提取物的有效劑量可根據(jù)各種因素變化，包括：患者體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、施用時間、施用途徑、排泄率、疾病嚴重性等。本發(fā)明的短冠草提取物可單劑施用或者分成每日兩至六劑，日劑量為0.001-100mg/kg，并且優(yōu)選為0.01-10mg/kg。為達到預(yù)防和治療炎癥性疾病的目的，本發(fā)明的組合物可單獨使用或者結(jié)合外科手術(shù)、放射療法、激素療法、化學(xué)療法或生物調(diào)節(jié)劑使用。本發(fā)明的組合物還可用于治療炎癥性疾病。因此，對有需要的個體施用藥學(xué)有效劑量的短冠草提取物在內(nèi)的用來治療炎癥性疾病的方法，形成了本發(fā)明的另一個方面。另外，本發(fā)明另一個方面提供一種用于預(yù)防炎癥性疾病的方法，其包括對有需要的個體施用藥學(xué)有效劑量的短冠草提取物。根據(jù)本發(fā)明的短冠草提取物可按0.001-100mg/kg的劑量施用，優(yōu)選為0.01-10mg/kg的劑量。有效劑量可根據(jù)各種因素，包括患者體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、施用時間、施用途徑、排泄率和疾病嚴重性等變化。該個體為脊椎動物，優(yōu)選為哺乳動物，更為優(yōu)選的是大鼠、兔、豚鼠、倉鼠、犬或貓，最為優(yōu)選的是類人猿如黑猩猩或大猩猩。施用可采用口服或腸胃外途徑。對于腸胃外施用，可采用腹膜內(nèi)注射、直腸內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、子宮內(nèi)注射、腦室內(nèi)注射或者胸內(nèi)注射。本發(fā)明可治療的炎癥性疾病實例包括但不限于：急性或慢性支氣管炎、變應(yīng)性鼻炎、CPOD、骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、斯耶格倫氏綜合征以及多發(fā)性硬化。具有對NF-κB核轉(zhuǎn)位的抑制活性，本發(fā)明的短冠草提取物可抑制NO和PGE2的生成、iNOS和COX-2的表達以及IL-1β和TNF-α的釋放，并且能夠顯著下調(diào)Th2-介導(dǎo)的IL-4和IL-13生成。此外，短冠草提取物均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中的組胺水平，使炎性介質(zhì)的釋放減少，并減少對鼻黏膜及其血管和腺體的刺激，減輕過敏反應(yīng)癥狀，從而達到治療變應(yīng)性鼻炎的目的。另外，發(fā)現(xiàn)短冠草提取物幾乎無細胞毒性。因此，該提取物可應(yīng)用于用來預(yù)防或治療各種炎癥病癥的方法。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療炎癥性疾病的皮膚外用劑，其含有作為活性成分的短冠草提取物。該皮膚外用劑可治療的炎癥可選自但不限于：急性或慢性支氣管炎、變應(yīng)性鼻炎、CPOD、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、斯耶格倫氏綜合征以及多發(fā)性硬化，以及急性和慢性的炎癥性疾病。主要通過達到抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位的作用，本發(fā)明的短冠草提取物能夠抑制NO和PGE2的生成、iNOS和COX-2的表達以及IL-1β和TNF-α的釋放，并且能夠顯著下調(diào)Th2-介導(dǎo)的IL-4和IL-13的生成。同時，短冠草提取物均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中的組胺水平，使炎性介質(zhì)的釋放減少，并減少對鼻黏膜及其血管和腺體的刺激，減輕過敏反應(yīng)癥狀，從而達到治療變應(yīng)性鼻炎的目的。另外，發(fā)現(xiàn)短冠草提取物幾乎沒有細胞毒性。因此，該提取物可作為用來預(yù)防或治療各種炎癥病癥的皮膚外用劑的活性成分。除了作為其活性成分的本發(fā)明的短冠草提取物，該皮膚外用劑還可以包括脂類、有機溶劑、溶解劑、增稠劑、凝膠劑、軟化劑、抗氧化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、芳香劑、表面活性劑、水、離子或非離子乳化劑、充填劑、多價螯合劑、螯合劑、防腐劑、維生素、UV阻斷劑、潤濕劑、精油、染料、色素、親水或親脂活化劑、脂質(zhì)體和/或其他用于皮膚科學(xué)領(lǐng)域的普通添加劑。并且，添加量按本領(lǐng)域常規(guī)添加即可。此外，在經(jīng)皮外用給藥方式中，根據(jù)本發(fā)明的短冠草提取物可按0.001-100mg/kg的劑量施用，并且優(yōu)選為0.01-10mg/kg的劑量施用。有效劑量可根據(jù)各種因素變化，包括患者體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、施用時間、排泄率、疾病嚴重性等。根據(jù)再一個方面，本發(fā)明提供一種用于治療炎癥性疾病的方法，其包括對有需要的個體施用藥學(xué)有效劑量的短冠草提取物。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面還提供一種用于預(yù)防炎癥性疾病的方法，其包括對有需要的個體施用藥學(xué)有效劑量的短冠草提取物。本發(fā)明的短冠草提取物通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位的作用，發(fā)現(xiàn)其抑制NO和PGE2的生成、iNOS和COX-2的表達以及IL-1β和TNF-α的釋放，并且顯著下調(diào)Th2-介導(dǎo)的IL-4和IL-13的生成。同時，短冠草提取物均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中的組胺水平，使炎性介質(zhì)的釋放減少，并減少對鼻黏膜及其血管和腺體的刺激，減輕過敏反應(yīng)癥狀，從而達到治療變應(yīng)性鼻炎的目的。此外，發(fā)現(xiàn)短冠草提取物幾乎沒有細胞毒性。因此，該提取物可用于預(yù)防或治療各種炎癥病癥。此外，短冠草提取物還可以用于制備預(yù)防和治療炎癥性疾病藥物組合物。另外，根據(jù)再一個方面，本發(fā)明提供短冠草提取物在皮膚外用劑中用于預(yù)防和治療炎癥性疾病的用途。本發(fā)明的短冠草提取物通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，然后抑制NO和PGE2的生成、iNOS和COX-2的表達以及IL-1β和TNF-α的釋放，并顯著下調(diào)Th2-介導(dǎo)的IL-4和IL-13生成。此外，短冠草提取物均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中的組胺水平，使炎性介質(zhì)的釋放減少，并減少對鼻黏膜及其血管和腺體的刺激，減輕過敏反應(yīng)癥狀，從而達到治療變應(yīng)性鼻炎的目的。另外，發(fā)現(xiàn)短冠草提取物幾乎沒有細胞毒性。因此，該提取物能夠有效應(yīng)用于制備用來預(yù)防或治療各種炎癥性病癥的藥劑。本發(fā)明的有益效果：如上所述，NF-κB核轉(zhuǎn)位可被本發(fā)明的短冠草提取物所抑制，通過這樣能夠抑制NO和PGE2的生成、iNOS和COX-2的表達以及IL-1β和TNF-α的釋放，并且能夠顯著下調(diào)Th2-介導(dǎo)的IL-4和IL-13的生成。同時，短冠草提取物均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中的組胺水平，使炎性介質(zhì)的釋放減少，并減少對鼻黏膜及其血管和腺體的刺激，減輕過敏反應(yīng)癥狀，從而達到治療變應(yīng)性鼻炎的目的。另外，發(fā)現(xiàn)短冠草提取物幾乎沒有細胞毒性。因此，該提取物可作為用于預(yù)防或治療各種炎癥病癥的藥物組合物的活性成分。附圖說明構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當限定。圖1：脂蛋白誘導(dǎo)的NF-κB信號傳導(dǎo)通路概圖。圖2：NaNO2標準曲線。圖3：短冠草水提取物和乙醇提取物對巨噬細胞J774.1產(chǎn)生的NO的影響，其中10-500μg/mL不同濃度條帶顯示右側(cè)為短冠草乙醇提取物，左側(cè)為短冠草水提取物。圖4：短冠草分極提取物對細胞產(chǎn)生的NO的影響(*P<0.05，**P<0.01vs.Con(對照)，n＝4)，其中不同濃度條帶顯示從左至右依次為乙醇提取物、石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、水提取物。圖5：短冠草提取物對細胞產(chǎn)生的iNOS的影響的時效關(guān)系(*P<0.05,**P<0.01vs.模型組，n＝2)。圖6：短冠草提取物對細胞產(chǎn)生的iNOS的影響的量效關(guān)系(*P<0.05，**P<0.01vs.模型組，n＝2)。圖7：短冠草提取物對細胞產(chǎn)生的COX-2的影響的時效關(guān)系(*P<0.05，**P<0.01vs.模型組，n＝2)。圖8：短冠草提取物對細胞產(chǎn)生的COX-2的影響的量效關(guān)系(*P<0.05，**P<0.01vs.模型組，n＝2).圖9:各組鼻粘膜病理切片特征(HE染色，×40)A、空白對照組B、模型對照組C、鼻炎康組D、短冠草低劑量組E、短冠草中劑量組F、短冠草高劑量組。具體實施方式應(yīng)該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當理解的是，當在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細說明本申請的技術(shù)方案。本發(fā)明實施例中所用的試驗材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。實施例1：短冠草(SopubiatrifidaBuch.-Ham.exD.Don)提取物的制備1-1.短冠草提取物的制備短冠草采集于生長在山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，取經(jīng)過干燥和磨粉10kg短冠草葉，用95％的乙醇回流提取3次，每次5小時，然后過濾并留取上清液。將獲得的上清液在真空中濃縮，得到0.5kg的短冠草乙醇提取物。1-2.短冠草級分的制備實施例1-1中制備的短冠草乙醇提取物在1L水中懸浮，進一步混入1體積的100％石油醚，放置同時攪拌。該過程進行兩次，同時除去水層。結(jié)果，獲得1.8g的石油醚提取物。移去石油醚級分后，加入等體積的氯仿并攪拌。重復(fù)該過程三次，得到0.6g的氯仿提取物。余下的混懸液以同上的方式用乙酸乙酯提取，得到1.59g的乙酸乙酯提取物，然后再濃縮剩余物，最終得到0.8g的水提取物。實施例2：短冠草提取物和級分對細胞生長和NO生成的抑制活性試驗2-1.細胞活力試驗選擇小鼠巨噬細胞J774.1作為試驗細胞，檢測不同濃度的短冠草提取物對細胞活力的影響，更具體的，將小鼠巨噬細胞J774.1以1x106細胞/ml的密度懸浮于補充了5％胎牛血清的無酚紅DMEM中，然后將該懸浮液按80μL/孔接種于96-孔細胞培養(yǎng)板中。四小時后，用每一級分孵育貼壁細胞24小時，然后用每孔10μL的5mg/mlMTT溶液繼續(xù)孵育4小時。去除培養(yǎng)基后，每孔加入100μL的DMSO，并在550nm處讀取吸光度。根據(jù)數(shù)學(xué)公式計算，細胞活力表示為相對于用0.1％DMSO處理的陰性對照在550nm處吸光度的百分比。細胞存活率％＝(處理的提取物OD550nm÷處理的陰性對照物OD550nm)×100％如表1所示，短冠草石油醚提取物、短冠草氯仿提取物和短冠草乙酸乙酯提取物對細胞的存活率的影響隨著短冠草提取物的濃度的增加有所下降，同時，與陰性對照組相比，短冠草乙醇提取物和短冠草水提取物在100-400μg/ml的濃度范圍內(nèi)的細胞存活率均在90％以上，說明在此濃度范圍內(nèi)的短冠草提取物對細胞無明顯毒性。表1：2-2.對NO生成的抑制活性的試驗磺胺磷酸溶液：稱取1g磺胺粉末，溶于2.5％磷酸溶液，雙蒸水定容至100mL。常溫下避光保存。N-萘基二乙胺(0.1％)：稱取0.1gN-萘基二乙胺粉末，溶于2.5％磷酸溶液，雙蒸水定容至100mL。常溫下避光保存。Griess試劑：0.1％N-蔡基二乙胺(NED)與1％磺胺-磷酸溶液以1：1比例混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。亞硝酸鈉配制(10μM)稱取0.063gNaNO2溶于100mL雙蒸水中，使用時稀釋10倍得到10μM：NaNO2溶液。細胞培養(yǎng)，同2-1。樣品(濃度為500，250，100，l0μg/mL)預(yù)孵育2h后加入濃度為1μg/mL的LPS稀釋液共同培養(yǎng)24h，然后吸取96孔細胞培養(yǎng)板中的上清液50μL，轉(zhuǎn)至另一新的96孔細胞培養(yǎng)板的相應(yīng)部位，同時在新板的空孔中依次加入50μL濃度為10，8，6，4，2，0μM的亞硝酸鈉溶液以備標準曲線的制作。在新板上所有孔加入50μLGriess試劑。原板用于樣品的細胞毒性測試。用酶標儀混勻孔內(nèi)液體后后在550nm處測定新板的光密度值。通過測定一定范圍濃度梯度的NaNO2溶液在550nm處的光密度值，得到如圖2所示的標準曲線，在0μM到10μM的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。Y軸表示所測得的OD值，x軸為該OD值所對應(yīng)的亞硝酸鈉濃度。即OD值＝0.027×亞硝酸鈉濃度+0.0413(R2＝0.9933)，根據(jù)該公式得到NO濃度計算公式：NO濃度(μM)＝OD-0.0413/0.027。正常生長的對照組細胞只產(chǎn)生低濃度的NO(0.06±0.03μM)。LPS模型組產(chǎn)生了較多的NO，記為1μM。各個濃度的短冠草水提取物和乙醇提取物相對于LPS模型組，對于NO的產(chǎn)生有下調(diào)作用，并具有量效關(guān)系，如圖3所示。其中水提取物的各個樣品組濃度由低到高產(chǎn)生的NO為0.88±0.358、0.66±0.14、0.59±0.10、0.50±0.10μM。乙醇提取物的各個樣品組濃度由低到高產(chǎn)生的NO為0.67±0.18、0.77±0.09、0.53±0.08、0.40±0.09μM。在水提取物的各個濃度中，500μg/mL的下調(diào)作用最強，乙醇提取物的500μg/mL對于NO的下調(diào)作用在各個濃度中最強。經(jīng)過T檢驗發(fā)現(xiàn)，10-500μg/mL的乙醇提取物對于LPS刺激巨嗜細胞產(chǎn)生的NO的下調(diào)都有統(tǒng)計學(xué)顯著性(p<0.05或p<0.01)，其中100，250，500μg/mL的乙醇提取物樣品組為極顯著(p<0.01)。100，250，500μg/mL的水提取物樣品組對NO的下調(diào)作用也具有統(tǒng)計學(xué)顯著性為極顯著(p<0.01)。用極性從大到小的順序用石油醚，氯仿，乙酸乙醋對短冠草乙醇提取物進行提取，得到包括乙醇提取物和提取物殘渣在內(nèi)的五種樣品，取濃度為10和100μg/ml的樣品作用于細胞，用Griess法檢測得到一下結(jié)果：正常生長的對照組細胞只產(chǎn)生低濃度的NO(0.17±0.14μM)。LPS模型組產(chǎn)生較高濃度的NO，記為1μM，濃度為100μg/ml時，四種提取物(乙醇，石油醚，氯仿，乙酸乙醋提取物)及提取物殘留對LPS刺激下的J774.1細胞產(chǎn)生的NO有下調(diào)作用，分別為0.84±0.02、0.67±0.05、0.12±0.04、0.25±0.08、0.61±0.2μM，如圖4所示。其中氯仿提取物的下調(diào)作用為最強，乙酸乙醋提取物次之，這兩種提取物的下調(diào)作用在統(tǒng)計學(xué)上呈極顯著(p<0.01)。濃度為10μg/mL時，氯仿提取物對NO有顯著下調(diào)作用。石油醚提取物的下調(diào)作用為顯著(p<0.05)。濃度為10μg/mL時，氯仿提取物對NO有顯著下調(diào)作用(p<0.05)，為0.81±0.14。對于每種提取物來說，濃度為100μg/ml的樣品組對NO的下調(diào)作用強于10μg/ml的樣品組，呈現(xiàn)出劑量依賴的量效關(guān)系。實施例3：J774.1細胞中短冠草提取物的消炎活性1-1.對NF-κB的抑制活性用免疫熒光法檢測LPS-誘導(dǎo)的炎癥條件下J774.1細胞NF-κB轉(zhuǎn)位入核。為此，將J774.1細胞以1x106細胞/ml的密度懸浮于含酚紅和10％胎牛血清的DMEM中，接種至塑料腔室玻片，放置8小時使其附著至玻片上。隨后，將細胞用50μg/mL的每種短冠草提取物孵育2小時，然后用1μg/mL脂多糖(LPS，Sigma公司)再孵育1.5小時。去除培養(yǎng)基后，4℃下用乙醇固定細胞30min，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，然后室溫下用5％小牛血清白蛋白封閉40min。然后，細胞在室溫下用一抗[抗-NF-κB抗體(1:100)]反應(yīng)5小時，充分洗滌，然后用德克薩斯紅標記的二抗在室溫、黑暗條件下孵育3小時。然后，用PBS洗滌細胞三次，再用ProLongGold抗淬滅試劑封片，然后進行共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果所示，與僅用LPS處理的細胞相比，觀測到用短冠草提取物和LPS共同處理的細胞中核內(nèi)NF-κB數(shù)量更少。1-2.對前列腺素的抑制活性在以實施例2-2相同方式處理的J774.1細胞中，用PGE2檢測試劑盒(R&Dsystems公司，美國)測量前列腺素的水平。結(jié)果如表2中所示，根據(jù)數(shù)據(jù)可知，短冠草提取物以劑量依賴的形式降低了被LPS提高的前列腺素水平。表2：樣品(μg/mL)PGE2(pg/ml)抑制率(％)陰性對照12.58±037LPS處理532.56±27.37LPS+實施例1的提取物(100)472.26±19.4910.17±2.46LPS+實施例1的提取物(250)339.21±25.7641.23±4.65LPS+實施例1的提取物(500)256.47±44.9858.97±8.52實施例4：短冠草提取物對J774.1細胞中iNOS表達的抑制活性胰酶酶解對數(shù)期生長的J774.1細胞，計數(shù)后用完全DMEM培養(yǎng)基調(diào)整密度至2.5×106個細胞/4mL，接種于9個60mm細胞培養(yǎng)皿。種皿后繼續(xù)培養(yǎng)36h，36h后細胞長至接觸抑制的密度，將完全DMEM倒去，加入無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。12h后倒去無血清DMEM培養(yǎng)基，加入濃度為100μg/mL的短冠草乙醇提取物的無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋液，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h,2h后加入濃度為1μg/mL的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)。此時將皿分為三組(6h、12h、24h)，每組包括三個皿(對照組，模型組，樣品組)，分別在6h、12h、24h收取細胞，以供提取細胞全蛋白使用。另外，取細胞接種于5個60mm細胞培養(yǎng)皿。種皿后繼續(xù)培養(yǎng)36h，36h后細胞長至接觸抑制的密度，將完全DMEM倒去，加入無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。12h后倒去無血清DMEM培養(yǎng)基，將皿分為三組即對照組，模型組，樣品組(三個皿)，在對照組加入濃度為100、50、25}μg/mL的短冠草水提取物的無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋液，模型組和樣品組加入無血清DMEM培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，2h后除對照組外均加入濃度為1μg/mL的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)6h后收取細胞，以供提取細胞全蛋白使用。用WesternBlot法測定iNOS的生成用免疫印跡法對誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)進行檢測培養(yǎng)蛋白24h的細胞基本上不表達iNOS，加入1μg/mlLPS。研究結(jié)果顯示：正常模型組則高表達iNOS并且隨著作用時間的加長(6、12、24h)，其產(chǎn)生的iNOS越多，即LPS對iNOS的上調(diào)作用在6h-24h間呈現(xiàn)出時效關(guān)系。在短冠草乙醇提取物濃度為100μg/ml時，樣品組的iNOS蛋白相對于各個時間點的模型組有不同程度的下調(diào)作用，其中，12h的樣品組相對于模型組的下調(diào)作用顯著(p<0.05)，6h的下調(diào)作用極為顯著(p<0.01)。隨著與樣品共孵育時間的增長，樣品組相對于模型組來說，呈現(xiàn)出對于iNOS下調(diào)作用減弱的趨勢。實驗結(jié)果表明，在樣品孵育細胞的6-24小時內(nèi)，6h的樣品組對于iNOS的下調(diào)作用最強。如圖5所示。根據(jù)時效關(guān)系實驗結(jié)果得出，濃度為100μg/ml短冠草水提取物作用于LPS刺激的巨噬細胞6h時對于巨噬細胞產(chǎn)生的iNOS蛋白的下調(diào)作用最強。因此，選擇6h為樣品作用時間點，選擇25、50、100μg/ml的水提取物樣品進行對iNOS蛋白作用的量效關(guān)系的研究。實驗表明，在25-100μg/ml的濃度范圍內(nèi)，樣品組相對于模型組產(chǎn)生的iNOS蛋白減少，并且隨著樣品濃度的增大，其減少的趨勢變強，說明在一定濃度范圍內(nèi)，短冠草乙醇提取物對于巨噬細胞產(chǎn)生的iNOS蛋白具有下調(diào)作用，并且有濃度依賴的量效關(guān)系。25μg/ml的提取物對iNOS的下調(diào)作用顯著(p<0.05)，50、100μg/ml的提取物對iNOS的下調(diào)作用極顯著(p<0.01)，如圖6所示。實施例5：短冠草提取物對J774.1細胞中：COX-2表達的抑制活性細胞培養(yǎng)及處理同實施例4，并且利用WesternBlot法測定COX-2的生成。用免疫印跡法對環(huán)氧合酶(COX-2)進行檢測。研究結(jié)果顯示:在正常培養(yǎng)6、12、24h后，巨噬細胞基本上不表達COX-2，加入1μg/mlLPS模型組則高表達COX-2蛋白，在所研究的時間點，12h表達的COX-2最多。設(shè)置短冠草乙醇提取物濃度為100μg/ml，作用時間為12、24h時樣品組的COX-2蛋白相對于各個時間點的模型組有不同程度的下調(diào)作用，其中，12h的樣品組相對于模型組的下調(diào)作用顯著(p<0.05)，24h的下調(diào)作用沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。在6h時間點上，樣品組相對于模型組的COX-2沒有下調(diào)作用，反而有一定程度的上調(diào)作用，如圖7所示。根據(jù)時效關(guān)系實驗得出，濃度為100μg/ml的短冠草乙醇提取物作用于LPS刺激的巨噬細胞12h時對于巨噬細胞產(chǎn)生的COX-2蛋白的下調(diào)作用最強。因此，選擇12h為樣品作用時間點，選擇25、50、100μg/ml的提取物樣品進行對COX-2蛋白作用的量效關(guān)系的研究。實驗表明，在25、100μg/ml的濃度范圍內(nèi)，樣品組相對于模型組的COX-2蛋白表達量下調(diào)，并且隨著樣品濃度的增大，其下調(diào)作用變強，說明在一定濃度范圍內(nèi)，短冠草乙醇提取物對于巨噬細胞產(chǎn)生的COX-2蛋白具有下調(diào)作用，并且有濃度依賴的量效關(guān)系。50μg/ml的提取物對COX-2的下調(diào)作用顯著(p<0.05)，100μg/ml的提取物對iNOS的下調(diào)作用極顯著(p<0.01)，如圖8所示。實施例6：短冠草提取物對J774.1細胞中細胞因子釋放的抑制活性分析短冠草提取物對LPS-處理的J774.1細胞中細胞因子釋放的抑制活性。在此背景下，用相應(yīng)的酶聯(lián)免疫分析試劑盒(小鼠IL-1β酶聯(lián)免疫分析試劑盒和TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒；上海生工)定量測定IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的LPS-誘導(dǎo)生物合成。如實施例2-2一樣的方式培養(yǎng)J774.1細胞后，將從細胞培養(yǎng)物收集的上清液按50μL/孔的量轉(zhuǎn)移至小鼠免疫球蛋白涂覆的96-孔板上并同時振蕩孵育2小時。然后，用洗滌緩沖液洗板四次，并用50μL/孔的一抗抗-IL-1β或抗-TNF-α抗體孵育2小時。再次洗滌細胞，并用二抗孵育30min。洗滌后，用底物顯色30min出現(xiàn)顏色，用酶標儀在450nm處測量。結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的合成，并且提高的IL-1β和TNF-α水平均被短冠草提取物以劑量依賴的形式降低。實施例7：短冠草提取物對脾細胞中細胞因子釋放的抑制活性測定短冠草對脾細胞中細胞因子合成的影響。首先，從BALB/c小鼠(山東省試驗動物中心)中無菌切除脾臟，并在含有10％胎牛血清、25mMHEPES、2mM谷氨酰胺、青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)的RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)中均質(zhì)化從而形成單細胞懸浮液。將脾細胞懸浮液室溫下1500rpm離心10min后，由此得到的細胞團在1mL的紅細胞裂解液中37℃下溶解10min。該溶液與10mL的PBS混合并室溫下1500rpm離心5min，然后棄除上清液。該過程重復(fù)兩次，然后細胞團在補充了10％FBS(HyClone公司，美國)的RPMI1640中重新懸浮。將細胞懸浮液中的細胞數(shù)量調(diào)整為1x106細胞/ml，并將200μL的細胞懸浮液置于96-孔板的每孔中，以多種劑量(0、100、200和400μg/mL)的短冠草提取物在5％CO2潮濕環(huán)境中37℃孵育1小時，然后用2μg/mL伴刀豆球蛋白A(ConA)(Sigma公司，美國)在5％CO2潮濕環(huán)境中37℃孵育3天，從而誘導(dǎo)白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)的表達。IL-4和IL-13的水平用各自的ELISA試劑盒根據(jù)廠商說明測定。對照組為不用ConA處理。結(jié)果表明，ConA-誘導(dǎo)的細胞因子表達以劑量依賴的形式被短冠草提取物降低。實施例8：短冠草提取物對過敏性鼻炎的治療動物，清潔級昆明小鼠，雌雄兼用，體重20±2g，購買自山東省試驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d供試。變應(yīng)性鼻炎動物模型的建立，選取合格健康的小鼠，以卵清蛋白(OVA)10μg，Al(OH)32mg溶于1ml生理鹽水中，進行腹腔注射，隔天1次，連續(xù)7次(共14d)，于第15d開始，以1％OVA生理鹽水溶液噴霧吸入激發(fā)，每次10min，連續(xù)7天。對同致敏天數(shù)的小鼠進行眼球采血，離心取得血清并按倍數(shù)(1/2，1/4，1/8，1/16，1/32)稀釋，然后分別取0.1ml上述稀釋好的各種血清注射與正常未致敏的小鼠背部皮內(nèi)。48h后，尾靜脈注射1ml卵清白蛋白伊文恩藍生理鹽水溶液(2mg卵清白蛋白和10mg伊文恩藍溶于生理鹽水中)，30min后將小鼠頸椎脫臼處死，剝離皮膚測定藍斑直徑，藍斑直徑大于5mm判定為陽性反應(yīng)，提示動物已被致敏，并可繼續(xù)進行試驗。給藥治療，取造模成功的小鼠，隨機分為：模型對照組，變應(yīng)性鼻炎康組，短冠草提取物高、中、低組，每組10只，另設(shè)10只為空白對照組，采用實施例1方法制備的短冠草提取物，短冠草提取物按照高、中、低計量組分別為3，1.5，0.75mg/kg；變應(yīng)性鼻炎康組計量為0.6mg/kg；模型對照組和空白對照組用等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)用藥10d；在給藥期間，除了空白對照組外，其余各組小鼠每隔一天用1％OVA溶液霧化吸入，激發(fā)維持，霧化時間為每次灌胃后1h。于末次給藥后30min給予1％OVA激發(fā)，激發(fā)后觀察30min內(nèi)小鼠出現(xiàn)鼻癢、噴嚏、流涕等情況及癥狀輕重，動物變應(yīng)性鼻炎癥狀評分標準見表1。然后摘眼球取血，離心取血清測定其組胺含量；取小鼠的鼻中隔進行鼻黏膜組織病理切片，并選取5個高倍視野(×1000)技術(shù)嗜酸性粒細胞(EOS)，計算平均值作為該切片的代表值；取外周血白細胞分類測定。表3為動物變應(yīng)性鼻炎癥狀評分標準。表3：癥狀輕度(1分)中度(2分)重度(3分)噴嚏1-3個4-8個8個以上流涕留至鼻前孔超過鼻前孔流涕至面部鼻癢單前肢偶有撓鼻雙前肢撓鼻不停到處撓鼻統(tǒng)計學(xué)處理運用SPSS17.0軟件統(tǒng)計，計量資料以平均數(shù)±標準差表示，組間差異采用T檢驗，以P<0.05有顯著性差異。各組癥狀積分及組胺含量、鼻黏膜EOS計數(shù)結(jié)果見表4。其中，癥狀積分結(jié)果表明，于空白對照組比較，模型對照組癥狀積分明顯升高(p<0.05)；于模型對照組比較，短冠草各劑量組級變應(yīng)性鼻炎康組癥狀積分顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.5)，表明用藥后癥狀獲得明顯緩解。表4：組別計量(g/kg)癥狀積分(分)組胺含量(μg/ml)鼻黏膜EOS(個/HP)空白對照組-0.5±0.680.65±0.260.7±±0.46模型對照組-7.5±±0.971.53±0.434.6±±0.35變應(yīng)性鼻炎康組0.61.5±0.480.75±0.212.9±±0.65短冠草低劑量組0.752.3±0.321.42±0.681.8±±0.21短冠草中劑量組1.51.8±0.521.21±0.731.7±±0.69短冠草高劑量組3.01.8±0.430.92±0.241.2±±0.53組胺含量測定及鼻黏膜EOS計數(shù)結(jié)果顯示，模型對照組含量及鼻黏膜EOS計數(shù)明顯高于空白對照組(p<0.5)；與模型對照組比較，短冠草各劑量組及變應(yīng)性鼻炎康組的組胺含量及鼻黏膜EOS計數(shù)顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.5)。根據(jù)各組白細胞分類測定結(jié)果(見表5)可知，與空白對照組比較，模型組各類白細胞含量均明顯升高(p<0.05)，與空白對照組比較，模型對照組各類白細胞含量均明顯升高(p<0.05)；而個用藥組中各類白細胞含量均有不同程度下降，與模型都招租比較有顯著差異性(p<0.05)。表5：(x±s，n＝10)同時，如圖9顯示，空白對照組黏膜上皮未見增厚，黏膜下層未見炎性細胞浸潤；模型對照組黏膜上皮明顯增厚，并見黏膜下層大量嗜酸性粒細胞浸潤；變應(yīng)性鼻炎康組黏膜上皮增厚，黏膜下層嗜酸性粒細胞較模型對照組少；短冠草低劑量組黏膜下層嗜酸性粒細胞減少；中劑量組嗜酸性粒細胞較模型對照組大量減少，但黏膜上皮層及黏膜下層增厚，腺體增多；高劑量組未見嗜酸性粒細胞浸潤，但黏膜上皮及黏膜下層增厚，腺體增多較中計量組少。變應(yīng)性鼻炎是IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病機理復(fù)雜，有多種炎癥細胞及多種細胞因子參與，其中EOS作為變態(tài)反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞，其功能與其所產(chǎn)生和釋放的化學(xué)性介質(zhì)、顆粒相關(guān)蛋白和某些細胞因子有關(guān)，本研究顯示，短冠草提取物能偶降低鼻黏膜中的EOS計數(shù)，改善小鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀。組胺是肥大細胞釋放的主要炎性介質(zhì)，是引起AR鼻癢、流涕和噴嚏癥狀的主要原因之一，組胺與鼻腔上皮細胞中的H1受體結(jié)合，引起血管通透性增加和腺體分泌亢進，出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)的癥狀。因此，組胺在AR發(fā)病機制中起著重要的作用。本實驗結(jié)果顯示，AR模型對照組血清中組胺的含量明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，說明AR發(fā)病時小鼠血清中組胺含量明顯增加，使小鼠鼻黏膜毛細血管通透性增加，腺體分泌增多，產(chǎn)生并加重變態(tài)炎癥性反應(yīng)。用藥后與模型對照組比較，變應(yīng)性鼻炎康組及短冠草高中低劑量組血清中組胺水平均顯著見底，表明變應(yīng)性鼻炎康和短冠草提取物均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中的組胺水平，使炎性介質(zhì)的釋放減少，并減少對鼻黏膜及其血管和腺體的刺激，減輕過敏反應(yīng)癥狀，從而達到治療AR的目的。以上所述僅為本申請的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本申請的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3