本發(fā)明涉及骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型領(lǐng)域，具體而言，涉及一種制備斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型的方法及其茜素紅染色方法。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)異常和骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一類病癥。該病癥是老年人常見(jiàn)病、多發(fā)病，隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率越來(lái)越高。因此，構(gòu)建有效的骨質(zhì)疏松篩藥模型，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的藥物治療和發(fā)現(xiàn)安全有效的新藥具有重要意義。目前，用于制備骨質(zhì)疏松模型的動(dòng)物主要有大鼠、小鼠和斑馬魚(yú)；由于個(gè)體小、生長(zhǎng)周期快、飼養(yǎng)和維護(hù)成本低，相對(duì)于大鼠和小鼠而言，斑馬魚(yú)作為骨質(zhì)疏松模型更具有優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)階段，構(gòu)建斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型時(shí)主要使用的藥物是潑尼松龍和地塞米松，但上述兩種藥物屬于糖皮質(zhì)激素類藥物，在造模時(shí)極易因?yàn)閯┝堪盐詹粶?zhǔn)而使免疫抑制過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎致畸、致死率高。目前還有研究發(fā)現(xiàn)，去鐵銨或鐵調(diào)素可修復(fù)高鐵造成的斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育缺陷，但高鐵誘導(dǎo)的幼魚(yú)骨質(zhì)疏松模型是否能夠用于篩選鐵螯合劑以外的其他治療骨質(zhì)疏松的藥物尚未可知。另外，現(xiàn)階段用于制模的斑馬魚(yú)一般選擇幼魚(yú)階段的斑馬魚(yú)，與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病時(shí)患者所處的生理階段(骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生在成年尤其是中老年階段)差異大，不能很好地模擬骨質(zhì)疏松癥。因此，本領(lǐng)域亟待提出一種制備骨質(zhì)疏松模型的方法，能夠快速、高效地制備用于廣泛評(píng)價(jià)和篩選不同種類的治療骨質(zhì)疏松藥物的模型。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種制備斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型的方法，由該方法制備的模型能夠用于廣譜地篩選各種治療骨質(zhì)疏松的藥物。本發(fā)明的第二目的在于提供一種對(duì)上述斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型進(jìn)行茜素紅染色的方法，該方法能夠穩(wěn)定、高效地對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行染色。本發(fā)明的第三目的在于提供一種對(duì)上述斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型進(jìn)行茜素紅染色的方法，該方法能夠穩(wěn)定、高效地對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)進(jìn)行染色。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明涉及一種制備斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型的方法，所述方法包括用Fe3+溶液處理斑馬魚(yú)的步驟，其中，所述溶液中Fe3+的摩爾濃度大于0.8mmol/L。在上述制備方法中，本發(fā)明使用Fe3+溶液處理斑馬魚(yú)。與潑尼松龍和地塞米松的高致畸率和高致死率不同，F(xiàn)e3+溶液相對(duì)溫和，用Fe3+溶液、甚至是高濃度的Fe3+溶液處理斑馬魚(yú)也基本不會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)致畸或致死。其次，阿侖膦酸鈉(不屬于鐵螯合劑，用于治療骨質(zhì)疏松，但作用機(jī)制尚不清楚)能夠修復(fù)由本發(fā)明上述方法制備而成的骨質(zhì)疏松模型，表明本發(fā)明上述方法制備的模型雖然是利用高鐵沉積制備而成，但鐵螯合劑以外的其他治療骨質(zhì)疏松癥的陽(yáng)性藥物也能修復(fù)該模型，因此，該模型能夠廣譜地用于篩選各種不同的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。本發(fā)明上述方法使用高濃度的Fe3+溶液處理斑馬魚(yú)，不但顯著降低斑馬魚(yú)骨骼礦化面積，誘使斑馬魚(yú)骨密度顯著降低，還引發(fā)軟骨發(fā)育缺陷，降低骨骼調(diào)控相關(guān)基因Bgp、Sox9b、col1a2和col10ala的表達(dá)。因此，與一般骨質(zhì)疏松模型相比，本發(fā)明上述方法制備的斑馬魚(yú)模型的總骨量損失更多，所具備的骨質(zhì)疏松的特征更突出、明顯。在一些實(shí)施方式中，所述溶液中Fe3+的摩爾濃度為0.8～1.2mmol/L，優(yōu)選1mmol/L。本發(fā)明上述方法對(duì)溶液中Fe3+濃度做出進(jìn)一步優(yōu)選，采用該優(yōu)選的Fe3+溶液能夠進(jìn)一步降低斑馬魚(yú)骨骼的硬骨礦化面積、軟骨面積以及骨骼調(diào)控相關(guān)基因Bgp、Sox9b、col1a2和col10ala的表達(dá)，使斑馬魚(yú)所具備的骨質(zhì)疏松癥狀更突出。在一些實(shí)施方式中，所述Fe3+溶液包括選自枸櫞酸鐵銨溶液、FeCl3溶液、硫酸鐵銨溶液中的一種或多種，優(yōu)選地，所述Fe3+溶液為枸櫞酸鐵銨溶液。在一些實(shí)施方式中，所述Fe3+溶液為枸櫞酸鐵銨溶液，所述枸櫞酸鐵銨溶液的濃度大于400μg·ml-1，優(yōu)選為400～600μg·ml-1，特別優(yōu)選500μg·ml-1。在一些實(shí)施方式中，所述斑馬魚(yú)為幼魚(yú)。在一些實(shí)施方式中，所述斑馬魚(yú)為成魚(yú)。本發(fā)明上述方法選擇斑馬魚(yú)成魚(yú)為枸櫞酸鐵銨的處理對(duì)象，由于成魚(yú)在進(jìn)行藥物處理時(shí)已經(jīng)發(fā)育完全，且活力和抵抗力也高于幼魚(yú)，因此，以成魚(yú)為制模對(duì)象能夠進(jìn)一步降低制模過(guò)程中斑馬魚(yú)的致畸率和致死率。更重要地是，該模型是在骨骼發(fā)育完成之后的成年階段誘導(dǎo)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的癥狀，與骨質(zhì)疏松病癥發(fā)病時(shí)所處的階段和骨骼狀態(tài)更為接近，因此，與幼魚(yú)模型相比，本發(fā)明上述方法制備的成魚(yú)模型能夠更好地模擬骨質(zhì)疏松癥，在進(jìn)行藥物篩選時(shí)獲得更好的篩藥效果。在一些實(shí)施方式中，所述斑馬魚(yú)為三月齡斑馬魚(yú)成魚(yú)。在一些實(shí)施方式中，所述方法具體包括以下步驟：將受精后24～72h的幼魚(yú)暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)3～5d；或者，將成魚(yú)暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)10～20d。在一些實(shí)施方式中，所述方法具體包括以下步驟：將受精后48h的幼魚(yú)暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)4d；或者，將成魚(yú)暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)15d，優(yōu)選地，所述成魚(yú)為三月齡斑馬魚(yú)。在一些實(shí)施方式中，在將幼魚(yú)暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)的期間，每隔10～14h重新更換Fe3+溶液，優(yōu)選每隔12h重新更換Fe3+溶液；或者，在將成魚(yú)暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)的期間，每隔18～36h重新更換Fe3+溶液，優(yōu)選每隔24h重新更換Fe3+溶液。本發(fā)明還涉及對(duì)上述斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型進(jìn)行茜素紅染色的方法，所述方法包括以下步驟：(1)用脫色素液脫去斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型的色素，所述斑馬魚(yú)為斑馬魚(yú)幼魚(yú)；(2)用染色工作液對(duì)幼魚(yú)進(jìn)行染色，所述工作液的組分包括茜素紅、氫氧化鉀、乙醇和水；優(yōu)選地，所述工作液中茜素紅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.003～0.005％，進(jìn)一步優(yōu)選為0.004％；氫氧化鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5～0.8％，進(jìn)一步優(yōu)選0.7％，乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0.6～0.8％，進(jìn)一步優(yōu)選為0.75％。本發(fā)明上述茜素紅染色方法對(duì)傳統(tǒng)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)染色方法進(jìn)行改進(jìn)，在染色之前先脫去斑馬魚(yú)體內(nèi)的黑色素和黃色素，使斑馬魚(yú)透明化，從而令染色背景更干凈；并且本發(fā)明所述方法用于染色的工作液中含有乙醇和KOH，能夠進(jìn)一步地吸附色素。與傳統(tǒng)染色方法相比，本發(fā)明所述染色方法具備使染色背景更干凈、染色效果更穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明上述染色方法還對(duì)茜素紅、KOH和乙醇的含量進(jìn)行優(yōu)化，提高上述工作液對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼染色的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施方式中，上述方法還包括在步驟(1)之后，步驟(2)之前還包括甲醇梯度脫水的操作；優(yōu)選地，所述甲醇梯度脫水包括將斑馬魚(yú)依次置于溶液1、溶液2和溶液3中，其中，溶液1中包括甲醇和含吐溫的緩沖液，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為20～30％，優(yōu)選25％，含吐溫的緩沖液的體積分?jǐn)?shù)是70～80％，優(yōu)選75％，所述含吐溫的緩沖液優(yōu)選為PBST或TBST；溶液2中包括甲醇和含吐溫的緩沖液，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為45～55％，優(yōu)選50％，含吐溫的緩沖液的體積分?jǐn)?shù)是45～55％，優(yōu)選50％，所述含吐溫的緩沖液優(yōu)選為PBST或TBST；溶液3為100％甲醇溶液。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括在甲醇梯度脫水后將斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于含DMSO和甲醇的溶液中，其中，DMSO的體積分?jǐn)?shù)為15～25％，優(yōu)選20％，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為75～85％，優(yōu)選85％。在本發(fā)明的上述方法中，使用含吐溫的甲醇溶液進(jìn)行梯度脫水，并將脫水后的幼魚(yú)置于含DMSO的甲醇溶液中，其中PBST和DMSO都能夠增強(qiáng)組織的通透性，提交染料與組織的結(jié)合度，從而提高染色效果。在一些實(shí)施方式中，上述脫色素液的組分包括KOH和H2O2，優(yōu)選地，KOH在脫色素液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4～0.6％，優(yōu)選0.5％，H2O2在脫色素液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2～4％，優(yōu)選3％。本發(fā)明還涉及一種對(duì)上述斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型進(jìn)行茜素紅染色的方法，所述方法包括以下步驟：(1)固定斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型，其中所述斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型為斑馬魚(yú)成魚(yú)；(2)梯度脫水；(3)將成魚(yú)腹部剪開(kāi)，用茜素紅染色液染色；(4)胰蛋白酶消化；(5)KOH溶液處理?，F(xiàn)階段，本領(lǐng)域一般選取幼魚(yú)進(jìn)行斑馬魚(yú)的茜素紅染色，盡管成魚(yú)所處的生理階段以及骨骼狀態(tài)更接近真實(shí)的骨質(zhì)疏松癥，但由于難以染色或染色效果不好，成魚(yú)在構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型時(shí)通常被棄用。而本發(fā)明上述方法創(chuàng)造性地選擇斑馬魚(yú)成魚(yú)作為染色對(duì)象，并特別針對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)染色效果差的技術(shù)問(wèn)題，在染色過(guò)程中將成魚(yú)樣本的腹部剪開(kāi)促進(jìn)染料在成魚(yú)樣本中的滲透，并進(jìn)一步用胰蛋白酶和KOH溶液處理樣本，極大增加樣本的透明度，從而成功實(shí)現(xiàn)斑馬魚(yú)成魚(yú)的茜素紅染色，使得斑馬魚(yú)成魚(yú)能夠成功地用于制備骨質(zhì)疏松模型。在一些實(shí)施方式中，所述步驟(3)具體包括以下步驟：將成魚(yú)置于茜素紅染色液中染色18～30h，優(yōu)選室溫下染色，染色時(shí)間優(yōu)選為24h，所述茜素紅溶液中茜素紅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4～0.6％，優(yōu)選為0.5％，pH值為7.5～8.5。在一些實(shí)施方式，所述步驟(4)具體包括將樣本置于胰蛋白酶溶液中處理2～4d，優(yōu)選在室溫下處理3d，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7～1.5％，優(yōu)選1％。在一些實(shí)施方式中，所述步驟(5)具體包括將樣本置于KOH溶液中處理4～6d，優(yōu)選在室溫下處理5d，所述KOH溶液中KOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7～1.5％，優(yōu)選1％。本發(fā)明上述方法對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)的茜素紅染色所涉及的關(guān)鍵參數(shù)和染色條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高了斑馬魚(yú)成魚(yú)的茜素紅染色效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1)、本發(fā)明上述制模方法使用Fe3+溶液處理斑馬魚(yú)，與使用潑尼松龍和地塞米松的常規(guī)制模方法相比，本發(fā)明所述方法可以顯著降低斑馬魚(yú)的致畸率和致死率。2)、本發(fā)明上述方法采用高濃度Fe3+溶液處理斑馬魚(yú)，由此制備而成的斑馬魚(yú)模型不但出現(xiàn)硬骨損傷，同時(shí)軟骨也出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，總骨量損傷增加，骨骼調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)量也顯著下降。因此，與常規(guī)斑馬魚(yú)模型相比，本發(fā)明所制模型的骨質(zhì)疏松特征更明顯、突出。3)、本發(fā)明上述方法制備的模型能夠篩選鐵螯合劑以外的其他治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，該模型的應(yīng)用范圍廣，能夠用于廣譜地篩選各種治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。4)本發(fā)明所述方法選取斑馬魚(yú)成魚(yú)制備骨質(zhì)疏松模型，進(jìn)一步降低制模過(guò)程中斑馬魚(yú)的致畸率和致死率；更重要的是，與幼魚(yú)模型相比，該成魚(yú)模型所處的生理階段和骨骼狀態(tài)與真實(shí)的骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病階段和骨骼狀態(tài)更為接近，能夠更好地模擬骨質(zhì)疏松癥。5)本發(fā)明提供一種優(yōu)化后的斑馬魚(yú)幼魚(yú)茜素紅染色方法，能夠脫去黑色素和黃色素，降低染色背景，并進(jìn)一步優(yōu)化染色工作液的配比，提高斑馬魚(yú)幼魚(yú)染色效果的穩(wěn)定性。6)本發(fā)明提供一種斑馬魚(yú)成魚(yú)染色方法，該染色方法克服斑馬魚(yú)成魚(yú)茜素紅染色難、染色效果不佳的缺陷，通過(guò)促進(jìn)染料的滲透、增加樣本透明度以及優(yōu)化染色液配比的方式改善染色效果，成功對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)進(jìn)行茜素紅染色，使得斑馬魚(yú)成魚(yú)用于制備骨質(zhì)疏松模型成為可能。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為不同濃度枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚(yú)幼魚(yú)的茜素紅染色結(jié)果圖；圖2為不同濃度枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚(yú)幼魚(yú)的鈣黃綠素染色結(jié)果圖；圖3為不同濃度枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚(yú)幼魚(yú)的阿爾新藍(lán)染色結(jié)果圖；圖4為不同枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚(yú)幼魚(yú)的骨骼標(biāo)記基因的mRNA水平表達(dá)差異；圖5為阿侖膦酸鈉對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨質(zhì)疏松模型的治療效果圖；圖6為枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚(yú)成魚(yú)的茜素紅染色結(jié)果圖；圖7為阿侖膦酸鈉對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)骨質(zhì)疏松模型的治療效果圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例11、建立斑馬魚(yú)幼魚(yú)茜素紅染色方法：(1)配制染色所需試劑：a)茜素紅溶液：稱0.5g的茜素紅粉末溶于100ml的95％乙醇中，終濃度為0.5％；b)0.7％KOH溶液：稱取0.7gKOH固體溶解于100ml的蒸餾水中，配置成0.7％的KOH溶液。(2)茜素紅染色的具體步驟：a)樣品收集及固定：收集受精后第6天的幼魚(yú)，將幼魚(yú)置于1.5ml的EP管中，于4％PF中4℃固定過(guò)夜，不宜超過(guò)一星期；b)脫色素：吸走4％PF,用PBST洗3遍，每次5min；加入脫色素液(0.5％KOH/3％H2O2)直到黑色素及黃色素肉眼觀察不可見(jiàn)，中間根據(jù)需要置換1～2次溶液，整個(gè)過(guò)程需要30min～1h，為防止脫色過(guò)程中因反應(yīng)膨脹爆管，脫色素液不宜加滿整管；脫色完成后，吸走脫色素液，用PBST快速洗3遍，后加入4％PF再次4℃固定過(guò)夜；c)脫水：吸走4％PF，用PBST洗3次，每次5min；依次用25％甲醇/75％PBST、50％甲醇/50％PBST、100％甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，每次5min；最后置于20％DMSO/80％甲醇溶液中，保存于-20℃；d)復(fù)水和染色：將脫水過(guò)的幼魚(yú)取出，依次置換成75％、50％、25％甲醇的PBST溶液中，每次5min，最后置換成100％PBST溶液，重復(fù)2次，每次5min；吸走PBST溶液，加入工作液，即：0.5％茜素紅溶液與0.7％KOH溶液按照1:125配制而成的染色液，置于搖床上，室溫避光染12h以上；e)染色終止：吸走染色液，用PBST洗3次，每次5min；吸走PBST溶液，將幼魚(yú)置于在80％的甘油溶液中避光保存，并觀察拍照。2、建立斑馬魚(yú)成魚(yú)茜素紅染色方法：(1)配制染色所需試劑：a)茜素紅染色液：稱取5.0g茜素紅粉末，加入1L的0.5％的KOH溶液中，調(diào)pH到7.5～8.5，現(xiàn)配現(xiàn)用。b)胰蛋白酶溶液：稱取0.5g的胰蛋白酶(Trypsin)粉末溶于50ml的30％飽和硼酸鈉溶液中，再用蒸餾水補(bǔ)至100ml。(2)茜素紅染色的具體步驟：a)將三月齡成魚(yú)麻醉后，放入60mm的培養(yǎng)皿中，加入4％PF，4℃固定2天；b)吸走4％PF，置換成75％乙醇，室溫脫水2天，中間更換一次75％乙醇；此時(shí)，可以將腹部剪開(kāi)，小心不要剪到腹鰭，以增加染色劑的滲透性；c)將脫水后的魚(yú)放入0.5％茜素紅染色液中，室溫染色24h，可放在搖床上輕微搖動(dòng)；d)回收染色液，將魚(yú)用清水迅速清洗，之后浸泡在胰蛋白酶溶液中，于室溫中浸泡3天，期間胰蛋白酶溶液要置換1～2次(此步不可搖動(dòng)，以防止骨骼脫落)；e)將胰蛋白酶去除干凈，加入1％KOH溶液，浸泡5天，期間要更換新鮮的1％KOH溶液，經(jīng)過(guò)此步驟，魚(yú)鱗可以用鑷子輕輕刮除；f)先保存在甘油：1％KOH為7:3的溶液中2天，最后換成100％甘油永久保存，并觀察拍照。3、設(shè)置對(duì)比例：參照公開(kāi)號(hào)為CN102980981A的發(fā)明專利申請(qǐng)所記載的茜素紅染色方法分別對(duì)受精后第6天的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行染色。4、染色結(jié)果評(píng)價(jià)(1)幼魚(yú)茜素紅染色效果評(píng)價(jià)：將本發(fā)明建立的幼魚(yú)染色方法的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)比例的染色結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，本發(fā)明所述幼魚(yú)染色方法能夠?qū)⒂佐~(yú)色素去除完全，背景干凈，染色效果佳，而對(duì)比例的幼魚(yú)染色方法不能將色素完全去除，背景深，影響染色結(jié)果。(2)成魚(yú)茜素紅染色效果評(píng)價(jià)：本發(fā)明所述成魚(yú)染色方法能夠成功地對(duì)成魚(yú)骨骼進(jìn)行茜素紅染色，成魚(yú)骨骼著色深，染色成功率高，染色效果好。實(shí)施例21、枸櫞酸鐵銨誘導(dǎo)建立斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨質(zhì)疏松模型參照以下方法建立枸櫞酸鐵銨誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨質(zhì)疏松模型：以枸櫞酸鐵銨(FAC)為造模用藥，選用受精后48h的幼魚(yú)暴露于不同濃度的FAC溶液中，F(xiàn)AC濃度分別為50、100、200、500μg·ml-1，同時(shí)設(shè)普通培養(yǎng)液(HolfreterH20)為對(duì)照組，28.5℃下在6孔板中培養(yǎng)4d，至斑馬魚(yú)顱骨形成，期間每隔12h換藥。2、斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨質(zhì)疏松模型的評(píng)價(jià)(1)致畸率和致死量統(tǒng)計(jì)：造模結(jié)束后統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的致畸率和致死率，結(jié)果參見(jiàn)表1。由此可見(jiàn)，使用枸櫞酸鐵銨進(jìn)行造模時(shí)，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的致畸率為0，其致死率也極低。表1斑馬魚(yú)幼魚(yú)致畸率和致死率FAC濃度(μg·ml-1)050100200500致畸率00000致死率5％5％5％10％12％(2)茜素紅染色：對(duì)培養(yǎng)至6d的斑馬魚(yú)骨骼進(jìn)行茜素紅染色，以顯微檢測(cè)和數(shù)碼成像方法對(duì)骨骼染色區(qū)域進(jìn)行定量分析，觀察其骨骼鈣化程度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，具體檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖1。根據(jù)圖1所示結(jié)果可知，斑馬魚(yú)幼魚(yú)用茜素紅染色后，頭骨礦化骨骼部分如脊索(NC)、孔蓋(OP)、副蝶骨(PS)、角鰓骨(CB)、角舌骨(CH)和舌骨下頷弓(Hm)呈紅色，而非骨組織耳石(Otolith，OT)部分呈棕黑色。經(jīng)過(guò)不同濃度的FAC處理后，斑馬魚(yú)頭部的染色較淺，如副蝶骨(ps)、孔蓋(op)、角舌骨(ch)和脊索(NC)等部位；與對(duì)照組相比，隨著FAC處理濃度的增加，斑馬魚(yú)頭部的染色區(qū)域逐漸減小，尤其在500μg·ml-1FAC處理組，只可見(jiàn)脊索，且染色面積及程度都大大減弱(圖1a)。采用專業(yè)圖像軟件計(jì)算斑馬魚(yú)的染色面積(骨礦化面積)。如圖1b所示，與對(duì)照組相比，50μg·ml-1和100μg·ml-1的FAC對(duì)斑馬魚(yú)骨骼的礦化面積影響并不顯著。但隨著FAC處理濃度的增加，斑馬魚(yú)骨骼的礦化面積是呈降低趨勢(shì)的。與對(duì)照組相比，當(dāng)FAC處理濃度為200μg·ml-1時(shí)，其骨骼的礦化面積減少明顯，具有顯著差異(p<0.01)。當(dāng)FAC處理濃度為500μg·ml-1時(shí)，其骨骼礦化面積的減少為對(duì)照組的三分之一左右，差異最為顯著(p<0.001)。由此可見(jiàn)，濃度為200～500μg·ml-1的FAC可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)骨骼礦化量顯著減少，并呈濃度依賴性。采用同款軟件計(jì)算累積光密度(IOD，圖1c)，用不同濃度FAC處理，對(duì)IOD的影響與其對(duì)骨礦化面積的影響相似，且隨著FAC濃度的增加，IOD值呈現(xiàn)降低趨勢(shì)且呈現(xiàn)梯度依賴性。當(dāng)濃度提高至200～500μg·ml-1時(shí)，IOD值顯著降低。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，F(xiàn)AC的處理濃度為200～500μg·ml-1時(shí)，可誘使斑馬魚(yú)骨密度顯著降低，且呈濃度依賴性。(3)鈣黃綠素染色：對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行鈣黃綠素染色，觀察骨骼鈣化程度并計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度以表征骨骼鈣化程度，具體結(jié)果參見(jiàn)圖2。鈣黃綠素染色結(jié)果也進(jìn)一步表明：隨著FAC濃度的增加，其骨骼礦化程度減弱，其鈣黃綠素染色的部位逐漸減小且熒光的強(qiáng)度逐漸減弱，尤其在脊椎發(fā)育上差異更明顯，在對(duì)照組中第6節(jié)脊椎已經(jīng)開(kāi)始鈣化，而FAC處理組中脊椎數(shù)量逐漸減少，在500μg·ml-1FAC組，其脊椎只有一節(jié)鈣化較為完整，整體鈣化嚴(yán)重受損(圖2a)；熒光強(qiáng)度計(jì)算結(jié)果表明：熒光強(qiáng)度的表達(dá)隨著FAC濃度的增加而逐漸減弱，在200～500μg·ml-1時(shí)，其差異非常顯著(圖2b)。(4)阿爾新藍(lán)染色：對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行阿爾新藍(lán)染色，觀察其頭部及顱面部軟骨的發(fā)育情況，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，具體結(jié)果參見(jiàn)圖3。如圖3所示：與對(duì)照組相比，斑馬魚(yú)頭部的麥克耳軟骨(mk)、副蝶骨(ps)、角舌骨(ch)、腭方骨(pq)、角鰓骨(cb1-5)和舌骨下頜結(jié)合弓(hm)等部位發(fā)育存在明顯缺陷，且隨著濃度增加，缺陷越明顯，發(fā)育越不完全。甚至在500μg·ml-1FAC的處理下，斑馬魚(yú)頭部的骨骼染色幾乎無(wú)信號(hào)顯示(圖3a)，說(shuō)明FAC對(duì)骨骼發(fā)育有抑制作用。此外，通過(guò)圖像軟件Imageproplus6.0對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算斑馬魚(yú)的染色面積，其染色面積的變化是逐漸減少的趨勢(shì)，且在100μg·ml-1時(shí)就有顯著性差異，濃度越高差異性越明顯，呈濃度梯度依賴性(圖3b)。由此可見(jiàn)，F(xiàn)AC不但影響骨密度，還引發(fā)軟骨發(fā)育的嚴(yán)重缺陷。(5)mRNA的檢測(cè)：檢測(cè)成骨細(xì)胞分化特異表達(dá)的基因以及調(diào)控軟骨發(fā)育相關(guān)基因的mRNA水平變化。骨鈣素(Bglap或Bgp)，是一種由造骨細(xì)胞合成的結(jié)構(gòu)蛋白，通過(guò)促進(jìn)造骨細(xì)胞鈣化為成骨細(xì)胞而參與骨骼發(fā)育，而成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。Sox9b調(diào)控軟骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，col1a2、col10a1a是軟骨標(biāo)記基因，參與骨膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控過(guò)程。通過(guò)半定量檢測(cè)上述基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖4所示：隨著FAC處理濃度的增加，bgp基因電泳條帶的亮度逐漸減弱，尤其在500μg·ml-1FAC組減弱尤為明顯，說(shuō)明其mRNA表達(dá)隨著FAC濃度提高而下調(diào)(圖4a)。對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，計(jì)算bgp的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組相比，在低濃度FAC處理組，上述幾個(gè)基因的mRNA表達(dá)量降低均沒(méi)有顯著差異。當(dāng)FAC處理濃度為500μg·ml-1時(shí)，sox9b和col10a1a的mRNA表達(dá)水平下降至對(duì)照組三分之一(圖4b,c)；BGP和col1a2的表達(dá)量下降為對(duì)照組的一半水平，差異都非常顯著(圖4d，e)。實(shí)施例3阿侖膦酸鈉能良好地修復(fù)FAC誘導(dǎo)的幼魚(yú)骨質(zhì)疏松癥幼魚(yú)修復(fù)：收集受精后48h的斑馬魚(yú)幼魚(yú)隨機(jī)分成4組，每組至少30枚，分別為：對(duì)照組即正常的養(yǎng)魚(yú)水培養(yǎng)至第10天；造模組即500μg·ml-1FAC處理至第10天；陰性藥對(duì)照組即FAC處理4天，再換成H2O培養(yǎng)4天；陽(yáng)性藥修復(fù)組即FAC處理4天，再換成0.1％的陽(yáng)性藥阿侖膦酸鈉培養(yǎng)4天。收集處理后即第10天的4組幼魚(yú)，進(jìn)行茜素紅染色、鈣黃綠素染色以及阿爾新藍(lán)染色檢測(cè)硬骨及軟骨發(fā)育的修復(fù)情況，結(jié)果如圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)論是從骨密度、礦化程度還是軟骨發(fā)育，阿侖膦酸鈉能夠極好地修復(fù)由FAC造成的骨鈣化減少及軟骨缺失。實(shí)施例4枸櫞酸鐵銨誘導(dǎo)建立斑馬魚(yú)成魚(yú)骨質(zhì)疏松模型成魚(yú)造模：選用三月齡的斑馬魚(yú)成魚(yú)，采用500μg·ml-1FAC浸泡處理15天，以正常培養(yǎng)液(HolfreterH2O)為對(duì)照，每組樣本量8條，每天換藥一次，喂食一次，15天后統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)成魚(yú)的致畸率和致死率，并進(jìn)行茜素紅染色，觀察鈣化及礦化程度。結(jié)果表明：(1)與幼魚(yú)相比，造模過(guò)程中斑馬魚(yú)成魚(yú)的致畸率為0，而致死率與斑馬魚(yú)幼魚(yú)相比進(jìn)一步降低(統(tǒng)計(jì)結(jié)果參見(jiàn)表2)；(2)FAC處理后引發(fā)斑馬魚(yú)整骨礦化程度明顯下降，包括脊椎、腹鰭和尾鰭等部位(結(jié)果參見(jiàn)圖6b1-b3)。表2斑馬魚(yú)成魚(yú)致畸率和致死率FAC濃度(μg·ml-1)0500致畸率00致死率07％實(shí)施例5阿侖膦酸鈉對(duì)成魚(yú)骨質(zhì)疏松具有良好的治療效果成魚(yú)修復(fù)：選用三月齡的斑馬魚(yú)成魚(yú)，隨機(jī)分成4組，每組8條，分別為：對(duì)照組即正常的養(yǎng)魚(yú)水培養(yǎng)至第25天；造模組即500μg·ml-1FAC處理至第25天；陰性藥對(duì)照組即FAC處理15天，再換成H2O培養(yǎng)10天；陽(yáng)性藥修復(fù)組即FAC處理15天，再換成0.1％的陽(yáng)性藥阿侖膦酸鈉培養(yǎng)10天。每天換藥一次、喂食一次，收集處理后的4組成魚(yú)，進(jìn)行茜素紅染色測(cè)硬骨骨密度修復(fù)情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案所述方法進(jìn)行分組處理，收集處理后的25天的成魚(yú)進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果如圖7所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FAC處理后引發(fā)的斑馬魚(yú)整骨密度降低癥狀可由阿侖膦酸鈉極好地修復(fù)，包括脊椎、腹鰭和尾鰭等部位(圖7d1-d3)。最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3