本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物領(lǐng)域，具體涉及竹節(jié)香附素A在制備抗人骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨肉瘤又稱為骨瘤，是青少年及兒童中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，也是最常見于骨組織的原發(fā)性惡性腫瘤?；颊叱０殡S截肢、肺轉(zhuǎn)移、死亡等后果，其對(duì)放療不敏感，化療和手術(shù)治療為其主要的治療手段，而單純手術(shù)治愈率僅15%～20%。雖然配合化療藥物使用可以有效的提升患者的生存周期，但是骨瘤的高轉(zhuǎn)移病人的治愈率仍然只有30%。其中腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。通過調(diào)控細(xì)胞凋亡，降低骨肉瘤的轉(zhuǎn)移，從而提高骨肉瘤治療效果，是降低骨肉瘤死亡率，改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后的重要途徑?，F(xiàn)有技術(shù)中，缺少能夠有效抗人骨肉瘤的藥物。

竹節(jié)香附素A是一種三萜皂苷，是從毛莨科銀蓮花屬植物多被銀蓮花(Anemone Raddeana Regel)的干燥根莖提取出的主要活性成分，具有祛風(fēng)濕的功效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供竹節(jié)香附素A在制備抗人骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供竹節(jié)香附素A在制備抗人骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供抗人骨肉瘤的藥物組合物，其活性成分為竹節(jié)香附素A。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，Hoechst 染色及Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示竹節(jié)香附素A高于1μmol/L的濃度可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依耐性。

Western Blot及免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，竹節(jié)香附素A通過誘導(dǎo)ROS（活性氧簇），激活JNK（c-Jun氨基末端激酶）的磷酸化，促發(fā)線粒體凋亡通路，有效抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的增殖。

竹節(jié)香附素A（0.25-1μmol/L）濃度范圍內(nèi)能夠有效地抑制人骨肉瘤細(xì)胞的劃痕傷口愈合，Transwell小室中的遷徙和侵襲。

本發(fā)明提供竹節(jié)香附素A在制備抗人骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)香附素A可通過上調(diào)ROS，調(diào)節(jié)線粒體中相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制抗凋亡基因Bcl-2和促進(jìn)促凋亡基因Bax的蛋白表達(dá)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。竹節(jié)香附素A還通過激活JNK通路誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。低濃度的竹節(jié)香附素A可以抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞劃痕愈合，可以顯著抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞Transwell穿膜能力和穿過Matrigel膠的侵襲能力，從而抑制MG-63細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。綜上所述，竹節(jié)香附素A可以應(yīng)用于制備抗人骨肉瘤的藥物。

附圖說明

圖1顯示不同濃度竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞抑制作用，C表示竹節(jié)香附素A的濃度；其中圖1（A）中竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞的作用時(shí)間為24h，圖1（B）中竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞的作用時(shí)間為48h。

圖2 是Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)得到的細(xì)胞凋亡率圖，RA表示竹節(jié)香附素A；其中圖2（A）是藥物作用24小時(shí)后的細(xì)胞凋亡率圖，圖2（B）是藥物作用48小時(shí)后的細(xì)胞凋亡率圖，圖2（A）、圖2（B）上方的濃度是各細(xì)胞處理過程中竹節(jié)香附素A的濃度。

圖3稀釋了不同濃度竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，圖下方的濃度為各細(xì)胞處理過程中竹節(jié)香附素A的濃度。Raddeanin A表示竹節(jié)香附素A。

圖4 竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞中Bcl-2，Bax，caspase-3和PARP蛋白表達(dá)的影響，每一行條帶左邊或右邊顯示了蛋白的名稱，圖的上方顯示了各細(xì)胞處理過程中竹節(jié)香附素A的濃度。Raddeanin A的意思是竹節(jié)香附素A。第5、6行條帶分別為胞漿和線粒體中細(xì)胞色素C的表達(dá)。

圖5 竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞中JNK蛋白表達(dá)的影響，其中每個(gè)膠條左邊顯示了蛋白條帶的名稱，上方顯示了各細(xì)胞處理過程中竹節(jié)香附素A的濃度。

圖6 竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞劃痕愈合能力的影響，圖片左邊的時(shí)間表示各細(xì)胞采用竹節(jié)香附素A處理的時(shí)間，圖片下方顯示了各細(xì)胞處理過程中竹節(jié)香附素A的濃度。

圖7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞遷移能力的影響，小圖下方的濃度為各細(xì)胞處理過程中竹節(jié)香附素A的濃度。

圖8 Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞侵襲能力的影響，各小圖下方的濃度表示各細(xì)胞處理過程中竹節(jié)香附素A的濃度。

具體實(shí)施方式

人骨肉瘤細(xì)胞MG-63購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC細(xì)胞庫），該細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)方法：采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，置于37℃、5%CO₂孵箱中培養(yǎng)?；A(chǔ)培養(yǎng)液是含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。

在本發(fā)明中，如果無特殊說明，是通過將竹節(jié)香附素A溶于含有0.1% DMSO的基礎(chǔ)培液中，然后加入到人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中進(jìn)行干預(yù)的。

實(shí)施例1 竹節(jié)香附素A對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的細(xì)胞存活率的影響

人骨肉瘤細(xì)胞MG-63（縮寫為MG-63細(xì)胞）接種于96孔板中，常規(guī)方法培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，給予不同劑量的竹節(jié)香附素A（上海源葉生物科技有限公司）分別干預(yù)24和48h，對(duì)照組中加入含有0.1% DMSO的基礎(chǔ)培液。隨后每孔中加入5mg/mL的MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）溶液15μL，置二氧化碳培養(yǎng)箱中溫孵4h，吸去MTT溶液，加入DMSO(150μL/孔)溶解結(jié)晶，靜置30min后取出，置于酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處的吸光度。

給藥組細(xì)胞存活率用以下公式計(jì)算：存活率=給藥組吸光度／對(duì)照組吸光度*100％。

MTT法檢測(cè)結(jié)果見圖1，竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞的抑制呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性和時(shí)間依耐性，竹節(jié)香附素A干預(yù)24小時(shí)和48小時(shí)的IC₅₀值分別為2.293μmol/L和1.749μmol/L。上述結(jié)果說明，竹節(jié)香附素A能夠有效促進(jìn)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的凋亡。

另外，還采用Hoechst 染色方法考察了竹節(jié)香附素A對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡情況的影響，結(jié)果顯示竹節(jié)香附素A高于1μmol/L的濃度可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依耐性。

實(shí)施例2 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率

采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（中國(guó)凱基）檢測(cè)不同劑量的竹節(jié)香附素A干預(yù)24小時(shí)對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡率的影響。該試劑盒包括Binding buffer、AnnexinV-FITC和Propidiμm Iodide染色液。

MG-63細(xì)胞接種于6孔板中，常規(guī)方法培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，給予不同劑量（1、2、4μM）的竹節(jié)香附素A干預(yù)24小時(shí)，本發(fā)明中劑量是指采用藥物干預(yù)時(shí)，體系中竹節(jié)香附素A的終濃度。對(duì)照組中加入含有0.1% DMSO的基礎(chǔ)培液。干預(yù)后，將MG-63細(xì)胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，1200r/min離心10min，收集細(xì)胞。加入500μl的Binding buffer, 重懸細(xì)胞, 隨后加5μL AnnexinV-FITC混勻后，再加入5μL Propidiμm Iodide染色液, 室溫下混合，避光孵育15 min。Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

PI和Annexin V熒光補(bǔ)償校正后的細(xì)胞雙染結(jié)果如圖２所示：隨竹節(jié)香附素A濃度的增加，MG-63細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象呈現(xiàn)出梯度遞增。對(duì)照組中細(xì)胞24h、48h的凋亡率（早期凋亡與晚期凋亡的總和）分別為3.0%.和6.3%。在竹節(jié)香附素A濃度為1、2和4μM時(shí)，MG-63細(xì)胞24h的凋亡率（早期凋亡與晚期凋亡的總和）分別為19.3%、33.9%和42.6%；MG-63細(xì)胞48h的凋亡率（早期凋亡與晚期凋亡的總和）分別為21.2%、52.4%和61.2%。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述試驗(yàn)結(jié)果說明竹節(jié)香附素A能夠有效促進(jìn)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的凋亡，且存在著濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

實(shí)施例3 竹節(jié)香附素A誘導(dǎo)ROS生成促發(fā)線粒體凋亡通路

1.竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞內(nèi)ROS（活性氧簇）水平的影響

MG-63細(xì)胞接種于24孔板中，常規(guī)方法培養(yǎng)24h，去除培養(yǎng)液，給予不同劑量（1、2、4μM）的竹節(jié)香附素A干預(yù)3小時(shí)，另外采用1mmol/L的NAC（ROS清除劑）與2μmol/L的竹節(jié)香附素A同時(shí)干預(yù)3小時(shí)，陰性對(duì)照組中加入含0.1% DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；藥物作用3小時(shí)后，加入熒光染料DCFH-DA（美國(guó)sigma公司），在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育20min。取出培養(yǎng)板，吸去熒光染液，4℃預(yù)冷的PBS溶液清洗細(xì)胞3次，4%的多聚甲醛溶液固定30min，PBS溶液清洗3次，最后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的強(qiáng)度。ROS的檢測(cè)結(jié)果：從圖3可以看出，用竹節(jié)香附素A處理MG-63細(xì)胞3小時(shí)后，竹節(jié)香附素A以劑量依賴性地方式增加細(xì)胞內(nèi)的ROS（活性氧簇）水平，4μM的竹節(jié)香附素A顯著增加了細(xì)胞內(nèi)的ROS水平；而經(jīng)過NAC和竹節(jié)香附素A同時(shí)干預(yù)，可以抑制竹節(jié)香附素A導(dǎo)致的MG-63細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高。

2.竹節(jié)香附素A對(duì)ROS相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響

蛋白質(zhì)提?。篗G-63細(xì)胞接種于24孔板中，常規(guī)方法培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，給予不同劑量（1、2、4μM）的竹節(jié)香附素A干預(yù)24h，陰性對(duì)照組加入含0.1% DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；24小時(shí)后用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞，加入500μl RIPA裂解液（中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司），反復(fù)吹打混勻，置于冰上裂解30分鐘；4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，將離心后的上清分裝至1.5mL的離心管，部分用于實(shí)驗(yàn)，其余的于-20℃保存。然后采用 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（中國(guó)凱基）檢測(cè)不同劑量竹節(jié)香附素A干預(yù)24h后細(xì)胞中的蛋白含量。

Western blot實(shí)驗(yàn)：采用SDS-PAGE電泳分離上述提取到的蛋白質(zhì)，然后分別采用Bax、Bcl-2、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3和β-action蛋白的一抗及相應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育（美國(guó)CST公司）鑒定上述蛋白的表達(dá)情況。具體方法如下：配制10%分離膠和4%濃縮膠，每孔上樣20μg蛋白，在120V下電泳65min。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉溶液封閉2小時(shí)，然后與1:1000稀釋的一抗（兔Bax、Bcl-2、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3、Cytochrome C和β-action抗體，美國(guó)CST公司）4℃孵育過夜。然后用含有0.1% Tween20的PBS溶液洗膜3次，每次10min，再與1:1000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，美國(guó)CST公司) 室溫孵育2小時(shí)。用含有0.1% Tween20的PBS溶液洗膜3次，每次10min。ECL法顯影，Clinx Science化學(xué)發(fā)光成像儀成像，Clinx Chemi Image Analysis圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。Western blot結(jié)果顯示（圖4），MG-63細(xì)胞經(jīng)竹節(jié)香附素A作用24h后，細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白隨著竹節(jié)香附素A濃度的增加出現(xiàn)了明顯的降解，與之對(duì)應(yīng)的是Bax蛋白顯著上調(diào)，說明竹節(jié)香附素A能有效地誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。隨著竹節(jié)香附素A濃度的逐漸增加，MG-63細(xì)胞株內(nèi)的Cleaved caspase-3和Cleaved PARP活性都隨之增加，表明其引起caspase系列的凋亡反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖 4）。

因此，本實(shí)施例證明了竹節(jié)香附素A通過誘導(dǎo)ROS進(jìn)一步激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡。

實(shí)施例4 竹節(jié)香附素A激活JNK通路誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡

竹節(jié)香附素A激活JNK通路的驗(yàn)證：MG-63細(xì)胞接種于96孔板中，常規(guī)方法培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，給予不同劑量（1、2或4μM）的竹節(jié)香附素A干預(yù)24h，陰性對(duì)照組加入含0.1% DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。然后按照實(shí)施例3中方法提取蛋白質(zhì)，采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JNK通路中ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38、JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)情況，以β-action為內(nèi)參。兔ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38、JNK、p-JNK和β-action蛋白抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)自美國(guó)CST公司。結(jié)果如圖5所示，竹節(jié)香附素A可顯著促進(jìn)JNK蛋白的磷酸化，對(duì)總蛋白沒有影響。

MG-63細(xì)胞接種于96孔板中，常規(guī)方法培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，同時(shí)給予4μM竹節(jié)香附素A和10μM JNK的特異性抑制劑SP600125干預(yù)24h，然后按照實(shí)施例1中MTT法檢測(cè)竹節(jié)香附素A和SP600125的加入對(duì)MG-63細(xì)胞存活率的影響。MTT結(jié)果顯示：10μM的JNK特異性抑制劑SP600125，可以有效抑制竹節(jié)香附素A（4μM）促發(fā)的MG-63細(xì)胞凋亡。因此，本實(shí)施例證明了竹節(jié)香附素A通過激活JNK通路誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例5 竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞劃痕愈合能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞接種于12孔板中，常規(guī)方法培養(yǎng)24h至細(xì)胞基本融合。用200μL微量移液頭在12孔板內(nèi)垂直劃痕，PBS溶液沖洗2次后, 給予不同劑量（0.25μM、0.5μM或1μM）的竹節(jié)香附素A干預(yù)24小時(shí)，陰性對(duì)照組中加入含0.1% DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。分別用倒置相差顯微鏡觀察。每個(gè)視野內(nèi)，隨機(jī)選擇3個(gè)區(qū)域，并計(jì)算100×視野內(nèi)遷移劃痕空隙的長(zhǎng)度。

結(jié)果如圖6所示：劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，竹節(jié)香附素A干預(yù)24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，給藥組MG-63細(xì)胞遷移距離減小，且呈現(xiàn)濃度依賴性。0.5μM、1μM竹節(jié)香附素A處理后，細(xì)胞的遷移距離顯著小于陰性對(duì)照組。

實(shí)施例6 竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞遷移能力的影響

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞，胰蛋白酶消化，無血清MEM培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)；將Transwell小室置于24孔板中，小室上層加入200μL含有不同劑量竹節(jié)香附素A(0.25μM、0.5μM和1μM)的細(xì)胞懸液（溶劑為含有0.1%DMSO的MEM培養(yǎng)液），每孔接種5×10⁴個(gè)細(xì)胞；陰性對(duì)照中加入200μL含有0.1%DMSO的MEM培養(yǎng)液的細(xì)胞懸液，每孔同樣接種5×10⁴個(gè)細(xì)胞；Transwell小室下層加入600μＬ基礎(chǔ)培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。37℃培養(yǎng)24h，吸棄上下層培養(yǎng)液，PBS溶液清洗3次；加入1ml甲醇固定30min，PBS溶液清洗3次；加入1ml吉姆薩染液染色30min，PBS溶液清洗3次；用棉簽將Transwell小室上層細(xì)胞拭去；將Transwell小室膜剪下，中性樹膠封閉于載玻片上；顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過的細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果（圖7）顯示，與對(duì)照組相比較，竹節(jié)香附素A可明顯抑制骨肉瘤MG-63的穿膜能力，0.5μM和1μM的竹節(jié)香附素A的抑制效果非常顯著。

實(shí)施例7 竹節(jié)香附素A對(duì)MG-63細(xì)胞侵襲能力的影響

在Transwell小室上層中加入一層Matrigel凝膠，下室加入600μL基礎(chǔ)培養(yǎng)液。然后在上室中加入200μL含有不同劑量竹節(jié)香附素A (0.25μM、0.5μM、1μM)的細(xì)胞懸液（溶劑為含有0.1%DMSO的MEM培養(yǎng)液），每孔接種5×10⁴個(gè)細(xì)胞；陰性對(duì)照中加入200μL含有0.1%DMSO的MEM培養(yǎng)液的細(xì)胞懸液，每孔同樣接種5×10⁴個(gè)細(xì)胞；置于37 ℃、5% CO₂及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出小室，染色計(jì)數(shù)。如圖8所示：與對(duì)照組比較，各給藥處理組細(xì)胞24h穿過Matrigel膠的數(shù)量均顯著降低，且呈現(xiàn)濃度依賴性。

從實(shí)施例1-7中，可以看出竹節(jié)香附素A可通過上調(diào)ROS，調(diào)節(jié)線粒體中相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制抗凋亡基因Bcl-2和促進(jìn)促凋亡基因Bax的表達(dá)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。竹節(jié)香附素A還通過激活JNK通路誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。低濃度的竹節(jié)香附素A可以抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞劃痕愈合，可以顯著抑制Transwell穿膜能力和穿過Matrigel膠的侵襲能力，從而抑制MG-63細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。綜上所述，竹節(jié)香附素A可以應(yīng)用于制備抗人骨肉瘤的藥物。