本發(fā)明涉及MT基因的新用途，具體地指MT基因作為防治AFB1致鴨肝臟損傷靶標(biāo)基因的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

飼料中黃曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁,AFB₁)污染普遍存在，嚴(yán)重?fù)p害動(dòng)物的健康，降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能，并造成畜產(chǎn)品中黃曲霉毒素的殘留，給畜產(chǎn)品的食用安全帶來(lái)極大隱患。雛鴨是常見(jiàn)畜禽中對(duì)AFB₁最敏感的物種之一。動(dòng)物經(jīng)口攝入AFB₁后主要蓄積與肝臟，同時(shí)，肝臟也是生物活化AFB₁為高毒性AFB₁-外8,9-環(huán)氧化物(AFBO)的場(chǎng)所，是AFB₁危害的主要靶器官，且雛鴨的肝臟損傷具有典型的病理學(xué)變化特征。因此，雛鴨原代肝細(xì)胞是研究AFB₁毒性的理想模型。DNA被AFBO烷基化形成AFB₁-8,9-二氫二醇，導(dǎo)致了G→T的突變，被認(rèn)為是AFB₁引起的主要突變(Bedard and Massey,2006)。此外，AFB₁還能誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，如超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物，它們是羥基自由基的前體物質(zhì)(Halliwell and Gutteridge,1999)，而羥基自由基能攻擊DNA上的糖、嘧啶以及嘌呤，而引起DNA氧化損傷，甚至突變(Bedard and Massey,2006)。然而，有限的研究發(fā)現(xiàn)，AFB₁誘導(dǎo)ROS的形成，需要細(xì)胞色素P450酶(CYP450)催化形成的AFBO和/或水解產(chǎn)生的AFM₁的參與外，還同時(shí)需要鐵離子參與催化過(guò)程和Kupffers細(xì)胞的參與(Shen et al.,1996；Towner et al.,2003)。但是，目前關(guān)于AFB₁引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝臟損傷的機(jī)制尚不清楚。

AFB₁致鴨肝臟損傷與其誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化能力損傷有關(guān)。鴨AFB₁中毒造成的肝臟損傷尚無(wú)有效的治療或緩解方法，主要原因在于哪些關(guān)鍵基因參與AFB₁誘導(dǎo)鴨肝臟毒性尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)對(duì)防治AFB₁致家禽肝臟毒性的不足，提供了一種MT基因(金屬硫蛋白基因)作為防治AFB₁致動(dòng)物肝臟損傷靶標(biāo)基因的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種MT基因作為防治AFB₁致動(dòng)物肝臟損傷靶標(biāo)基因的應(yīng)用，所述MT基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

所述MT基因的編碼金屬硫蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)的分子功能主要是結(jié)合金屬離子，在重金屬脫毒反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Margoshes and Vallee,1957)，同時(shí)，越來(lái)越多的研究揭示了MT能緩解氧化應(yīng)激、致癌原對(duì)機(jī)體的損傷(Shibuya et al.,2008；Fujiwara and Satoh,2013)、參與細(xì)胞凋亡。MT1/2敲除小鼠對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和LPS/半乳糖胺極敏感，動(dòng)物接觸后表現(xiàn)為急性肝功能衰竭(Kimura et al.,2001；Inoue et al.,2006)。

本發(fā)明運(yùn)用鴨原代肝細(xì)胞為模型，通過(guò)鴨原代肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)MT基因，檢測(cè)MT基因在調(diào)控AFB₁致鴨肝臟毒性作用中的功能。通過(guò)MTT試驗(yàn)、細(xì)胞凋亡試驗(yàn)、Western blotting和q-PCR技術(shù)，以及檢測(cè)鴨原代肝細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)和肝細(xì)胞中AFBO-DNA含量的變化情況，結(jié)果表明MT能有效抑制AFB₁致雛鴨肝臟原代細(xì)胞損傷的功能，主要通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力、減少AFBO-DNA的生成、及調(diào)控抑癌因子和促凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制AFB₁誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌變和凋亡。說(shuō)明了MT基因在抑制AFB₁毒性上作用。

通過(guò)上述研究發(fā)現(xiàn)，AFB₁誘導(dǎo)雛鴨肝臟毒性過(guò)程中，能極顯著下調(diào)MT基因的表達(dá)，而鴨原代肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)MT可極顯著抑制AFB₁致肝細(xì)胞毒性。因此，確定MT基因在AFB₁致雛鴨肝臟損傷中起到關(guān)鍵作用。

本發(fā)明提供了一種MT基因在制備防治AFB₁致鴨肝臟損傷藥物及飼料添加劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明有益效果

本發(fā)明的MT基因能有效抑制或緩解AFB₁誘導(dǎo)的雛鴨肝臟毒性作用，主要與其增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧化能力有關(guān)。本發(fā)明的MT基因可以作為治療AFB₁致鴨肝臟損傷藥物及新型飼料添加劑開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)基因。

附圖說(shuō)明

圖1 MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞經(jīng)AFB₁處理后細(xì)胞活率的變化；

圖2 MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞經(jīng)AFB₁處理后細(xì)胞凋亡率的變化；

圖3 MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞經(jīng)AFB₁處理后MT下游基因mRNA表達(dá)量的變化。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所屬的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)中選擇。

實(shí)施例1：AFB₁處理正常鴨原代肝細(xì)胞和MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞后的細(xì)胞抗氧化酶活力的變化

用冷PBS溶液沖洗六孔板兩次，將各處理組肝細(xì)胞收集于1.5mL EP管中，于-80℃凍存。試驗(yàn)時(shí)，用液氮磨碎細(xì)胞，用4℃生理鹽水溶解。SOD、GST、GPX等酶的活性以及MDA含量均按南京建成相關(guān)說(shuō)明書(shū)操作，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。

由結(jié)果可知50ng/mL AFB₁處理肝細(xì)胞后(AFB₁組)，細(xì)胞中GPX和SOD的活性顯著低于未經(jīng)AFB₁處理組(對(duì)照組)(P＜0.05)，分別比對(duì)照組降低了85.2％、45.7％，而以相同濃度AFB₁處理MT過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞組(MT+A組)，細(xì)胞中GPX和SOD的活性顯著高于AFB₁組(P＜0.05)，分別比AFB₁組提高了418.8％、31.9％。且MT+A組GPX的活性與對(duì)照組差異不顯著。MT+A組MDA含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，但是顯著高于AFB₁組(P＜0.05)。GST活性在3組間無(wú)顯著差異。說(shuō)明肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)MT后，細(xì)胞的抗氧化能力得到了增強(qiáng)。

實(shí)施例2：AFB₁處理正常鴨原代肝細(xì)胞和MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞后的細(xì)胞內(nèi)AFBO-DNA含量的變化

AFBO-DNA加合物的測(cè)定按照Aflatoxin DNA Adduct Competitive ELISA Kit(Cell Biolabs,Inc.)(AKR-351)說(shuō)明書(shū)規(guī)范進(jìn)行操作。(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：將AFBO-DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，配制成濃度為0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/mL溶液。(2)分別向包被板每孔加50μL樣品和AFBO-DNA標(biāo)品，室溫?fù)u床上搖10min。(3)抗體稀釋：將AFBO-DNA一抗用Assay Diluent 1:500稀釋，立即向包被板每孔加入50μL該稀釋液，室溫振蕩搖1h。(4)用洗滌液洗3次，濾紙吸去殘留液體。(5)將AFBO-DNA二抗按1:1000比例稀釋后，立即向每孔加入100μL該稀釋液，室溫振蕩1h。(6)將底物溶液預(yù)熱至室溫，每孔加100μL，室溫下振蕩2～20min，出現(xiàn)顏色變化后立即終止反應(yīng)。(7)每孔加100μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀以450nm波長(zhǎng)處讀取數(shù)據(jù)。(8)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中AFBO-DNA的濃度。結(jié)果以AFBO-DNA/DNA表示。

結(jié)果表明，正常鴨原代肝細(xì)胞組AFBO-DNA加合物含量極低，極顯著低于AFB₁組(P＜0.001)、極顯著低于MT+A組(P＜0.01)，AFB₁處理正常鴨原代肝細(xì)胞組以及AFB₁處理MT過(guò)表達(dá)亞原代肝細(xì)胞組AFBO-DNA加合物含量分別是對(duì)照組的43.5倍、14.8倍，且MT+A組極顯著低于AFB₁組(P＜0.01)。說(shuō)明MT轉(zhuǎn)染后降低了細(xì)胞中AFBO-DNA加合物的形成，減輕了AFB₁的毒性。

實(shí)施例3：MTT試驗(yàn)測(cè)定AFB₁處理正常鴨原代肝細(xì)胞和MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞后的細(xì)胞活力的變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鴨原代肝細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用WME培養(yǎng)基制成原代肝細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度后，接入96孔板中，保證每孔細(xì)胞數(shù)量為2000～4000個(gè)，置于CO₂培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，加入含有AFB₁的培養(yǎng)基100μL，各培養(yǎng)基中AFB₁濃度分別為25、50、75、100、125ng/mL，置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，在培養(yǎng)板的每個(gè)孔中分別加入10μL 0.5％MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，小心棄去培養(yǎng)基，加入150μL DMSO，于搖床上振蕩10min后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)孔的吸光值(測(cè)定波長(zhǎng)：570nm，參比波長(zhǎng)：630nm)，得到MTT試驗(yàn)中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，建立各不同劑量AFB₁與細(xì)胞死亡率間的關(guān)系，計(jì)算得到IC₃₀、IC₅₀。利用IC₃₀(AFB₁濃度為50ng/mL)用正常鴨原代肝細(xì)胞和MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。

由MTT的結(jié)果可知雛鴨原代肝細(xì)胞未經(jīng)任何處理時(shí)(對(duì)照組)活力約為99.6％；而被50ng/mL AFB₁處理24h后(AFB₁ 50組)，細(xì)胞活力降為68.7％，極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；而MT過(guò)表達(dá)的雛鴨原代肝細(xì)胞被以同水平AFB₁處理24h后(M+A 50組)，其活力為89.5％，顯著高于AFB₁ 50組(P＜0.05)。并且MT+A50組細(xì)胞活力與對(duì)照組差異不顯著。說(shuō)明過(guò)表達(dá)MT能有效提高雛鴨肝細(xì)胞活力。

實(shí)施例4：細(xì)胞凋亡試驗(yàn)檢測(cè)AFB₁處理正常鴨原代肝細(xì)胞和MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化

將轉(zhuǎn)染MT質(zhì)粒的亞原代肝細(xì)胞和正常肝細(xì)胞分別用AFB₁溶液處理后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰蛋白酶消化5min，收集細(xì)胞與于1.5mL離心管中，500r/mL離心3min，棄上清。用4℃PBS溶液洗滌細(xì)胞兩次，去除PBS溶液。用400μL 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×10⁶cells/mL。在細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光孵育15min。加入10μL PI染色液后輕輕混勻于2～8℃避光孵育5min。將處理好的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定凋亡情況。

由結(jié)果可知正常鴨原代肝細(xì)胞活率為：94.1％，早期凋亡率為5.1％。50ng/mL AFB₁處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力降為40％，其早期凋亡率為32.2％，晚期凋亡和死亡細(xì)胞率為27.3％。MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞被相同濃度AFB₁處理24h，細(xì)胞活力為61.6％，早期凋亡率為22.8％，晚期凋亡和死亡細(xì)胞率15.1％。即MT過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)AFB₁的耐受性較正常表達(dá)組顯著升高(P＜0.05)，早期凋亡率和死亡率顯著下降(P＜0.05)。說(shuō)明MT過(guò)表達(dá)，顯著增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)AFB₁的耐受性。

實(shí)施例5：q-PCR檢測(cè)AFB₁處理正常鴨原代肝細(xì)胞和MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞后的MT下游基因mRNA表達(dá)量的影響

q-PCR檢測(cè)按照常規(guī)方法進(jìn)行，即提取正常原代肝細(xì)胞、AFB₁處理正常鴨原代肝細(xì)胞和MT過(guò)表達(dá)鴨原代肝細(xì)胞后總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格后進(jìn)行RT-PCR和cDNA合成，隨后進(jìn)行q-PCR。

q-PCR實(shí)驗(yàn)使用iTaq Universal SYBR Green Supermix定量染料(172-5124，Bio-Rad)按照說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作。10μL反應(yīng)體系組成如下：5μL SYBR Green mix、0.5μL Forward primer、0.5μL Reverse primer、3μL DEPC water、1μLcDNA。

引物設(shè)計(jì)根據(jù)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，使用的定量引物見(jiàn)表4-1，引物由武漢擎科生物公司合成。將引物凍干粉用DEPC水配置成10μM的溶液，于-20℃保存。在CFX384實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)儀(Biorad，美國(guó))上完成測(cè)定過(guò)程，程序?yàn)椋?5℃，4min(95℃，10s；60℃(根據(jù)引物Tm值調(diào)整)，10s)重復(fù)40個(gè)循環(huán)，退火溫度55℃升溫到95℃，溫度每升高0.5℃讀5s溶解曲線。用β-actin 作為內(nèi)參進(jìn)行樣品間的校正，結(jié)果用2^-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣品均有6個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3次平行PCR反應(yīng)。

表0-1Q-PCR反應(yīng)的引物序列

Table 0-1 Primer sequences of q-PCR reaction

結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，AFB₁顯著下調(diào)了肝細(xì)胞中PTGR、p53、TrxR、AR以及Bcl-2mRNA的表達(dá)量(P＜0.05)，顯著上調(diào)了Cas-3mRNA的表達(dá)量(P＜0.05)，而MT過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞中，PTGR、p53、TrxR及Bcl-2的mRNA的表達(dá)量(P＜0.05)顯著高于AFB₁處理正常肝細(xì)胞組。Abdel-Aziem等(2014)報(bào)道用AFs含量為2.5mg/kg日糧飼喂大鼠5wk，大鼠肝臟中p53顯著下調(diào)(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2顯著上調(diào)(P＜0.05)。El-Mahalaway等(2015)報(bào)道AFs導(dǎo)致大鼠腎小管壞死，且腎小管中Bcl-2表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)。AFB₁導(dǎo)致肉雞原代肝細(xì)胞線粒體功能受損、ROS大量產(chǎn)生、凋亡率上升，相關(guān)基因變化為Cas-3、Cas-9蛋白表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)，而Nrf2表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)，而NAD(P)H：醌氧化還原酶1、SOD以及血紅素加氧酶的mRNA顯著下降(P＜0.05)。此外，AFB₁還能通過(guò)異常調(diào)控肝臟中p53、p21、Bax、Bcl-2、surviving、Cas-3及Cas-8基因的表達(dá)而促進(jìn)肝細(xì)胞的癌變(Soman et al.,1993；Sun et al,2015b)。

前列腺素還原酶PTGR、硫氧還原蛋白酶TrxR、糖醛還原酶AR均參與機(jī)體氧化還原反應(yīng)中的還原反應(yīng)。AFB₁處理的肝臟中抗氧化酶和還原酶的上調(diào)以及氧化酶的下調(diào)能減輕AFB₁所引起的氧化應(yīng)激(Mary et al.,2012)。腫瘤抑制因子p53(Haupt et al.,1997)、促凋亡因子Cas-3(Stennicke et al.,1998)均為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因?？沟蛲鯞cl-2家族成員如Bcl-2，在保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能、抑制細(xì)胞凋亡起著重要的保護(hù)作用(Zou et al.,2014)。腫瘤抑制因子p53在肝臟中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用，p53長(zhǎng)期高表達(dá)可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，但是p53短期高表達(dá)能消除促癌細(xì)胞從而預(yù)防癌癥的發(fā)生(Charni et al.,2014)。Cas3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，它在腫瘤發(fā)展及癌癥死亡過(guò)程中起到促進(jìn)作用(Stennicke et al.,1998)。這些基因表達(dá)的變化可能是機(jī)體對(duì)AFB₁誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激的一種復(fù)雜的保護(hù)性反饋調(diào)控。

表1

¹結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝6)。同一行數(shù)據(jù)肩標(biāo)(小寫(xiě)英文字母)不同，表示差異顯著(P<0.05)。以下表同。

²對(duì)照組：肝細(xì)胞未經(jīng)AFB₁處理；AFB₁組：肝細(xì)胞+50ng/mL AFB₁孵育24h；

MT+A：MT過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞+50ng/mL AFB₁孵育24h；(n＝6)

表2

¹結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n＝6)。同一行數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫(xiě)英文字母不同，表示差異顯著(P<0.05)。大寫(xiě)英文字母不同，表示差異極顯著(P<0.01)

²對(duì)照組：肝細(xì)胞未經(jīng)AFB₁處理；AFB₁組：肝細(xì)胞+50ng/mL AFB₁孵育24h；

MT+A：MT過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞+50ng/mL AFB₁孵育24h；(n＝6)

其它未詳細(xì)說(shuō)明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

序列表

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> MT基因作為防治AFB1致動(dòng)物肝臟損傷靶標(biāo)基因的應(yīng)用

<210> 1

<211> 192

<212> DNA

<213> MT基因

<400> 1

ATGGACCCCCAGGACTGCACATGTGCTGCTGGTGACTCCTGCTCCTGTGCTGGGTCCTGCAAGTGCAAGAACTGCCGCTGCCGGAGCTGCCGCAAGAGCTGCTGCTCCTGCTGCCCCGCCGGCTGCAACAACTGCGCCAAGGGCTGCGTCTGCAAGGAGCCGGCCAGCAGCAAGTGCAGCTGCTGCCACTGA

<210> 2

<211> 63

<212> PRT

<213>金屬硫蛋白

<400> 2

MDPQDCTCAAGDSCSCAGSCKCKNCRCRSCRKSCCSCCPAGCNNCAKGCVCKEPASSKCSCCH