本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是抗原肽RACGAP1-1和RACGAP1-2在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是一種起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，是人類主要的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告，全世界每年有約100萬人死于肝癌。肝癌死亡率很高，我國肝癌發(fā)病率居世界之首,肝癌是我國第2位癌癥殺手，是全球第3位癌癥死因。器官移植是治療肝癌晚期唯一有效的手段，但仍存在供肝數(shù)量逐年減少以及急性、慢性排斥反應(yīng)所導(dǎo)致的移植物存活時間短等諸多問題，放療、化療雖然一定程度上抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但對正常肝細(xì)胞造成的損傷以及復(fù)發(fā)率高的問題仍未得到有效解決。近年來針對實體瘤的免疫治療逐漸成為腫瘤學(xué)研究的熱點。生物體對腫瘤細(xì)胞識別殺傷過程中，細(xì)胞免疫、特別是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)發(fā)揮著核心作用。在此過程中，腫瘤細(xì)胞被抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presentingcell，APC)吞噬后，其癌細(xì)胞特有的蛋白可以被蛋白酶水解形成肽段，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)I類分子結(jié)合，形成復(fù)合物，后被運送到細(xì)胞表面進(jìn)行抗原遞呈，誘導(dǎo)特異性CTL增殖。CTL可以識別腫瘤細(xì)胞上的抗原肽與MHC的復(fù)合物，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。根據(jù)這一原理，可以通過選取腫瘤內(nèi)特異性蛋白設(shè)計抗原肽，來誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL。隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，循證醫(yī)學(xué)逐漸取代經(jīng)驗醫(yī)學(xué)成為科學(xué)診斷和治療的切入點，以大數(shù)據(jù)為背景，進(jìn)行科研研究逐漸成為主流。Oncomine、TCGA等含有大量腫瘤臨床樣本數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫得到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并越來越多的運用到腫瘤的研究中來，2013-2016年多篇研究工作發(fā)表在Nature、Science等頂級雜志。但是目前，利用大數(shù)據(jù)進(jìn)行肝癌研究的多關(guān)注于肝癌發(fā)生發(fā)展過程中分子機(jī)制，而較少關(guān)注腫瘤抗原肽的開發(fā)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有肝癌公開數(shù)據(jù)，設(shè)計了一套利用差異分析挖掘肝癌高表達(dá)分子、后用ENCODE數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)剔除可能引起自身免疫反應(yīng)抗原的篩選方案。鑒于I型HLA中，位于HLA-A基因座0201型等位基因在人群中分布極為廣泛，其表達(dá)產(chǎn)物HLA-A*0201在腫瘤的抗原遞呈過程中起著非常重要的作用，且與HLA-A*0201發(fā)生結(jié)合的CTL表位長度被限制在9±1個氨基酸殘基。因此，本發(fā)明利用網(wǎng)絡(luò)軟件在線計算出潛在的抗原九肽，鑒定出在以HLA-A*0201陽性肝癌細(xì)胞癌患者為對象的免疫療法中有效的、與HLA-A*0201結(jié)合并遞呈在人CTL上的肽段。在裸鼠移植瘤模型中回輸負(fù)載后的腫瘤抗原肽后的樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)與T細(xì)胞，證明使用該肽有效。本發(fā)明提供一種鑒定發(fā)現(xiàn)肝癌抗原肽的方法，具體是指通過公開的肝癌測序或芯片數(shù)據(jù)分析，篩選出肝癌高表達(dá)的基因，并通過ENCODE數(shù)據(jù)庫過濾表達(dá)于成年人其他組織中的分子，進(jìn)而設(shè)計與HLA-A*0201發(fā)生結(jié)合的抗原九肽，負(fù)載DC誘導(dǎo)CTL后，通過體外殺傷實驗與裸鼠移植瘤模型篩選獲得有效的抗原肽。本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下：本發(fā)明人通過調(diào)閱GEO數(shù)據(jù)庫中一例含有220例肝癌癌旁組織與224例肝癌組織芯片結(jié)果的Dataset，分析鑒定出了人肝癌細(xì)胞中特異性過表達(dá)的分析，并取top20作為候選分子。又通過ENCODE數(shù)據(jù)庫，剔除20個中表達(dá)于成年個體其他組織的分子，剩余SPINK1、GPC3、AKR1B10、RACGAP1、CCL20、PEG10、MDK和ENAH作為腫瘤抗原。通過在線軟件設(shè)計候選分子的抗原九肽，合成后體外負(fù)載DC，并加入T細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)特異性識別抗原肽的CTL，同時在體外殺傷實驗和PDTX模型中驗證其抗瘤能力，由此鑒定出可以作為應(yīng)用于免疫治療的候選肝癌抗原肽。即，本發(fā)明提供以下內(nèi)容：通過體外實驗證實負(fù)載樹突狀細(xì)胞并遞呈后可誘導(dǎo)特異性殺傷CTL的抗原肽：通過體內(nèi)實驗證實負(fù)載樹突狀細(xì)胞并遞呈后可誘導(dǎo)特異性殺傷CTL，并可在體內(nèi)顯著殺傷實體瘤的抗原肽：GPC3-1(編號2)、GPC3-3(編號4)、RACGAP1-1(編號7)和RACGAP1-2(編號8)。本發(fā)明的第一方面，提供抗原肽RACGAP1-1在制備預(yù)防和/或治療肝癌藥物中的應(yīng)用，所述的抗原肽RACGAP1-1的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。本發(fā)明的第二方面，提供抗原肽RACGAP1-2在制備預(yù)防和/或治療肝癌藥物中的應(yīng)用，所述的抗原肽RACGAP1-2的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。所述的抗原肽RACGAP1-1或RACGAP1-2可誘導(dǎo)特異性殺傷CTL，并可在體內(nèi)顯著殺傷肝癌實體瘤。本發(fā)明的第三方面，提供一種用于肝癌的預(yù)防和/或治療的藥物組合物，所述的藥物組合物是以抗原肽RACGAP1-1作為活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-1的藥物組合物。本發(fā)明的第四方面，提供一種用于肝癌的預(yù)防和/或治療的藥物組合物，所述的藥物組合物是以抗原肽RACGAP1-2作為活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-2的藥物組合物。本發(fā)明的第五方面，提供一種用于肝癌的預(yù)防和/或治療的藥物組合物，所述的藥物組合物是以抗原肽RACGAP1-1和抗原肽RACGAP1-2作為活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-1和抗原肽RACGAP1-2的藥物組合物。優(yōu)選的，所述的藥物組合物含有有效量的上述的抗原肽，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。所述的“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。本發(fā)明建立了一整套基于肝癌二代測序數(shù)據(jù)挖掘肝癌抗原的方案，并基于挖掘出的腫瘤抗原設(shè)計抗原肽，同時將抗原肽負(fù)載樹突狀細(xì)胞后遞呈CD8+T細(xì)胞，體外、體內(nèi)實驗篩選具有有效抗瘤能力的肽段。本發(fā)明提供可用于肝癌治療的4條抗原肽，由以編號2、編號4、編號7和編號8中的任意一條由氨基酸形成的短肽，或者編號2和編號4兩兩組合、編號7和編號8兩兩組合可以負(fù)載樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)并獲取大量具有特異性識別肝癌細(xì)胞的CTL。附圖說明圖1為GEO數(shù)據(jù)庫中下載包含220例癌旁組織和224例肝癌組織的GSE14520數(shù)據(jù)集U133芯片數(shù)據(jù)，R語言中分析并輸出的熱圖結(jié)果。調(diào)用函數(shù)包為DeSeq，參數(shù)設(shè)定為padj＜0.05，log2(foldchange)＞2。圖2為ENCODE數(shù)據(jù)庫中下載127種primarycell的RNA-Seq數(shù)據(jù)以及44種tissue的RNA-Seq數(shù)據(jù)。將表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)過TPM算法(RPKM算法的優(yōu)化版本)進(jìn)行均一化處理，生成矩陣，并在矩陣中調(diào)用GPC3的表達(dá)數(shù)據(jù)。圖3為ENCODE數(shù)據(jù)庫中下載127種primarycell的RNA-Seq數(shù)據(jù)以及44種tissue的RNA-Seq數(shù)據(jù)。將表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)過TPM算法(RPKM算法的優(yōu)化版本)進(jìn)行均一化處理，生成矩陣，并在矩陣中調(diào)用TOP2A的表達(dá)數(shù)據(jù)。圖4為體外誘導(dǎo)人樹突狀細(xì)胞并負(fù)載不同的抗原肽，后使用樹突狀細(xì)胞提成抗原給T細(xì)胞，在肝癌細(xì)胞系中驗證腫瘤抗原肽的殺傷效果，此處僅展示有效的抗原肽結(jié)果。A為編號1-6的抗原肽誘導(dǎo)T細(xì)胞后殺傷Hep3B的結(jié)果，B為編號1-6的抗原肽誘導(dǎo)T細(xì)胞后殺傷MHCC9H的結(jié)果，C為編號7-12的抗原肽誘導(dǎo)T細(xì)胞后殺傷Hep3B的結(jié)果，D為編號7-12的抗原肽誘導(dǎo)T細(xì)胞后殺傷MHCC9H的結(jié)果。圖5為體外誘導(dǎo)人樹突狀細(xì)胞并負(fù)載不同的抗原肽，后使用樹突狀細(xì)胞提成抗原給T細(xì)胞，在PDTX模型中驗證CTL殺傷實體瘤的效果，此處僅展示有效的抗原肽結(jié)果。A為編號2(GPC3-1)的抗原肽誘導(dǎo)T細(xì)胞后殺傷實體瘤的結(jié)果，B為編號4(GPC3-3)的抗原肽誘導(dǎo)T細(xì)胞后殺傷實體瘤的結(jié)果，C為編號7(RACGAP1-1)的抗原肽誘導(dǎo)T細(xì)胞后殺傷實體瘤的結(jié)果，D為編號8(RACGAP1-2)的抗原肽誘導(dǎo)T細(xì)胞后殺傷實體瘤的結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)；《蛋白質(zhì)純化：原理和實踐》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《實驗免疫學(xué)手冊》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)?；蛘撸砂凑赵噭┥a(chǎn)商所提供的說明書進(jìn)行。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1：基于肝癌芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)肝癌抗原候選分子。本專利數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中樣本數(shù)最多的一例肝癌dataset(GSE14520)，包含220例癌旁組織和224例肝癌組織的U133芯片檢測結(jié)果。實驗方法：數(shù)據(jù)下載后進(jìn)行差異分析分析，分析軟件使用R語言，差異分析調(diào)用函數(shù)包DeSeq(參考文獻(xiàn)：AndersS,HuberW:Differentialexpressionanalysisforsequencecountdata.GenomeBiol.2010,11(10):R106-10.1186/gb-2010-11-10-r106.)，參數(shù)設(shè)定為padj＜0.05，log2(foldchange)＞2。并生成熱圖，后輸出TOP20高表達(dá)基因。實驗結(jié)果：通過差異分析發(fā)現(xiàn)了肝癌組織中相對于癌旁組織有大量的差異基因，并通過熱圖(Heatmap)展示(圖1)。并選取TOP20(表1)，作為候選基因。表1.肝癌中高表達(dá)基因Top20實施例2：利用ENCODE數(shù)據(jù)庫過濾實施例1中候選基因中的自身抗原。ENCODE，即DNA元件百科全書(EncyclopediaofDNAElements)，旨在描述人類基因組中所編碼的全部功能性序列元件。ENCODE計劃于2003年9月正式啟動，由來自美國、英國、西班牙、日本和新加坡五國的32個研究機(jī)構(gòu)參與，目前所有數(shù)據(jù)均全部公開(http://genome.ucsc.edu/ENCODE/)。在發(fā)明人所提供的腫瘤抗原挖掘方案中，ENCODE數(shù)據(jù)庫中人各組織中的RNA-Seq數(shù)據(jù)被調(diào)用，用以過濾實施例1中候選基因中的自身抗原。實驗方法：1、ENCODE數(shù)據(jù)庫中下載127種primarycell的RNA-Seq數(shù)據(jù)以及44種tissue的RNA-Seq數(shù)據(jù)。將表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)過TPM算法(RPKM算法的優(yōu)化版本)進(jìn)行均一化處理，生成矩陣。2、將實施例1中候選基因在矩陣中逐一查找TPM值，篩選僅表達(dá)于肝癌而不表達(dá)/低表達(dá)于成人其他組織的分子作為候選腫瘤抗原。實驗結(jié)果：闡明了實施例1所獲得的20個候選基因在正常成年人中的表達(dá)模式，主要分為兩種模式：一種如圖2所示GPC3的表達(dá)模式，僅表達(dá)于肝癌或/和胚胎細(xì)胞中；一種如圖3所示TOP2A的表達(dá)模式，不僅表達(dá)于肝癌或/和胚胎細(xì)胞中，同時在成體其他細(xì)胞中或/和造血干細(xì)胞中也有表達(dá)。剔除達(dá)于成年個體其他組織的分子后，保留SPINK1、GPC3、AKR1B10、RACGAP1、CCL20、PEG10、MDK和ENAH作為腫瘤抗原。實施例3：利用BIMAS軟件設(shè)計抗原肽I型HLA中，位于HLA-A基因座0201型等位基因在人群中分布極為廣泛，其表達(dá)產(chǎn)物HLA-A*0201在腫瘤的抗原遞呈過程中起著非常重要的作用，且與HLA-A*0201發(fā)生結(jié)合的CTL表位長度被限制在9±1個氨基酸殘基。因此，發(fā)明人利用軟件BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)在線計算出潛在的抗原九肽，從而獲得以HLA-A*0201陽性肝癌細(xì)胞癌患者為對象的免疫療法中有效的、與HLA-A*0201結(jié)合并遞呈在人CTL上的肽段。實驗方法：登錄BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)網(wǎng)站，分別輸入SPINK1、GPC3、AKR1B10、RACGAP1、CCL20、PEG10、MDK和ENAH的氨基酸序列。參數(shù)設(shè)定為：HLAmolecule＝A_0201，n-mers＝9。篩選Score≥100的序列作為候選序列。實驗結(jié)果：經(jīng)過計算，一共獲得了來自于8個基因的27條抗原肽(表2)。表2.BIMAS預(yù)測候選腫瘤抗原HLA_A_02*01九肽實施例4：體外腫瘤細(xì)胞殺傷實驗驗證抗原肽效率實驗方法：1、多肽合成：抗原九肽合成使用氨基酸的羧內(nèi)酸酐法，具體來說是在堿性條件下，氨基酸陰離子攻擊氨基酸的羧內(nèi)酸酐形成穩(wěn)定的氨基甲酸根離子，后在酸化時該離子失去二氧化碳生成二肽，生成的二肽又進(jìn)攻其它的氨基酸的羧內(nèi)酸酐，如此進(jìn)行八個循環(huán)，獲得九肽。2、人PBMC分離：健康人肝素抗凝靜脈血加入等體積HBSS緩沖液進(jìn)行稀釋，用滴管輕輕加到稀釋血50％體積的FICOLL上，25℃、2000rpm20分鐘，離心后吸取中間的白色云霧狀狹窄帶，置于另一離心中，加入盡可能多的HBSS液洗滌吸取的細(xì)胞，1000rpm5分鐘，洗2次，獲得PBMC。3、人樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)與抗原肽負(fù)載：人PBMC計數(shù)后重懸于1640培養(yǎng)基中，后按每孔4x106加入6孔板，37℃、5％CO2濃度孵育4小時，使單核細(xì)胞貼壁，懸浮細(xì)胞收集至另一10cm培養(yǎng)皿中。貼壁細(xì)胞每孔加入2mL含GM-CSF50ng/ml、IL-410ng/ml的1640(10％FBS)培養(yǎng)基誘導(dǎo)DC。前四天每隔一天半量換液，同時補(bǔ)加細(xì)胞因子。第四天加入抗原肽10mg/孔。第五天補(bǔ)加1mL含GM-CSF50ng/ml、IL-410ng/ml的1640(10％FBS)培養(yǎng)基。第6天時加入細(xì)胞因子TNF-α(200U/mL)培養(yǎng)到第8天，即為具有抗原遞呈能力的成熟的DC。4、人T細(xì)胞分離：步驟3中所獲得懸浮細(xì)胞用磁珠分選法分選CD3+T細(xì)胞，1x105/孔接種24孔板，加入含有1000u/mlIFN-γ、500U/mlIL-2、anti-CD310ng/ml1640(FBS10％)培養(yǎng)基500μL，隔一天換液一次。培養(yǎng)直第8天。5、DC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)：負(fù)載抗原肽后的成熟DC與T細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)1：2混合。使用含有1000u/mlIFN-γ、500U/mlIL-2、anti-CD310ng/ml1640(FBS10％)培養(yǎng)基500μL連續(xù)培養(yǎng)5天，每隔兩天換液一次，第六日磁珠分選法收集CD3+T細(xì)胞。6、細(xì)胞殺傷效率測定：使用HLA_A_02*01陽性的肝癌細(xì)胞系Hep3B與MHCC97H作為靶細(xì)胞，培養(yǎng)處理后調(diào)制成1×105/ml鋪96孔板，細(xì)胞加入MTT液(5mg/ml)10-20μL/孔。效應(yīng)T細(xì)胞和靶細(xì)胞等體積培養(yǎng)4小時(Tumor∶T-cell＝1∶1，3∶1，5∶1，10∶1)，每孔加入酸化異丙醇100μL，振蕩10min，測OD值(波長570nm，參考波長630nm)，并計算細(xì)胞活力。實驗結(jié)果：通過體外殺傷實驗我們共獲得了12條具有顯著殺傷活力的九肽，其體外殺傷實驗結(jié)果如圖4所示，肽段序列如表3所示。表3.12條具有顯著殺傷活力的九肽序列肽段名稱序列SEQIDNO.SPINK1FLLSALALL1GPC3-1RMLTRMWYC2GPC3-2ELFDSLFPV3GPC3-3RLQPGLKWV4GPC3-4FVGEFFTDV5AKR1B10KLSYLDVYL6RACGAP1-1FLMIHLQRV7RACGAP1-2MLADFVSQT8CCL20LLLAALMSV9PEG10KLTEENTTL10MDKFLLLTLLAL11ENAHGLMEEMSAL12實施例5：抗原肽特異性T細(xì)胞回輸PDTX小鼠評估療效實驗方法：1、多肽合成：抗原九肽合成使用氨基酸的羧內(nèi)酸酐法，具體來說是在堿性條件下，氨基酸陰離子攻擊氨基酸的羧內(nèi)酸酐形成穩(wěn)定的氨基甲酸根離子，后在酸化時該離子失去二氧化碳生成二肽，生成的二肽又進(jìn)攻其它的氨基酸的羧內(nèi)酸酐，如此進(jìn)行八個循環(huán)，獲得九肽。2、人PBMC分離：健康人肝素抗凝靜脈血加入等體積HBSS緩沖液進(jìn)行稀釋，用滴管輕輕加到稀釋血50％體積的FICOLL上，25℃、2000rpm20分鐘，離心后吸取中間的白色云霧狀狹窄帶，置于另一離心中，加入盡可能多的HBSS液洗滌吸取的細(xì)胞，1000rpm5分鐘，洗2次，獲得PBMC。3、人樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)與抗原肽負(fù)載：人PBMC計數(shù)后重懸于1640培養(yǎng)基中，后按每孔4x106加入6孔板，37℃、5％CO2濃度孵育4小時，使單核細(xì)胞貼壁，懸浮細(xì)胞收集至另一10cm培養(yǎng)皿中。貼壁細(xì)胞每孔加入2mL含GM-CSF50ng/ml、IL-410ng/ml的1640(10％FBS)培養(yǎng)基誘導(dǎo)DC。前四天每隔一天半量換液，同時補(bǔ)加細(xì)胞因子。第四天加入抗原肽10mg/孔。第五天補(bǔ)加1mL含GM-CSF50ng/ml、IL-410ng/ml的1640(10％FBS)培養(yǎng)基。第6天時加入細(xì)胞因子TNF-α(200U/mL)培養(yǎng)到第8天，即為具有抗原遞呈能力的成熟的DC。4、人T細(xì)胞分離：步驟3中所獲得懸浮細(xì)胞用磁珠分選法分選CD3+T細(xì)胞，1x105/孔接種24孔板，加入含有1000u/mlIFN-γ、500U/mlIL-2、anti-CD310ng/ml1640(FBS10％)培養(yǎng)基500μL，隔一天換液一次。培養(yǎng)直第8天。5、DC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)：負(fù)載抗原肽后的成熟DC與T細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)1：2混合。使用含有1000u/mlIFN-γ、500U/mlIL-2、anti-CD310ng/ml1640(FBS10％)培養(yǎng)基500μL連續(xù)培養(yǎng)5天，每隔兩天換液一次，第六日磁珠分選法收集CD3+T細(xì)胞，1x105每份重懸于300μLHBSS。6、肝癌PDTX小鼠制備：1x106肝癌細(xì)胞Hep3B或MHCC97H重懸于200μLHBSS緩沖液中，用胰島素注射器注入裸鼠背部皮膚。約3周，腫瘤可生長至1cm3。7、T細(xì)胞回輸PDTX小鼠評估治療效果：PDTX小鼠腫瘤生長至≥1cm3后，尾靜脈回輸步驟5中T細(xì)胞懸液。連續(xù)觀察兩周，評估療效。實驗結(jié)果：通過這一方案，我們共篩選到了體內(nèi)模型中具有顯著療效的4條抗原肽：GPC3-1、GPC3-3、RACGAP1-1和RACGAP1-2。根據(jù)體內(nèi)實驗結(jié)果，所有經(jīng)過T細(xì)胞回輸治療的小鼠均發(fā)生了腫瘤消退或腫瘤縮小(圖5)。以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)<120>抗原肽RACGAP1-1和RACGAP1-2在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用<130>/<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>1PheLeuLeuSerAlaLeuAlaLeuLeu15<210>2<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>2ArgMetLeuThrArgMetTrpTyrCys15<210>3<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>3GluLeuPheAspSerLeuPheProVal15<210>4<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>4ArgLeuGlnProGlyLeuLysTrpVal15<210>5<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>5PheValGlyGluPhePheThrAspVal15<210>6<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>6LysLeuSerTyrLeuAspValTyrLeu15<210>7<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>7PheLeuMetIleHisLeuGlnArgVal15<210>8<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>8MetLeuAlaAspPheValSerGlnThr15<210>9<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>9LeuLeuLeuAlaAlaLeuMetSerVal15<210>10<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>10LysLeuThrGluGluAsnThrThrLeu15<210>11<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>11PheLeuLeuLeuThrLeuLeuAlaLeu15<210>12<211>9<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>12GlyLeuMetGluGluMetSerAlaLeu15當(dāng)前第1頁1 2 3