發(fā)明背景

本申請要求2015年1月5日提交的美國臨時申請?zhí)?2/099,899的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院授予的基金號r01ca109035和r01ca169603的政府支持下完成的。政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。

1.技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)、生物化學(xué)、腫瘤學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及用于表征癌細(xì)胞的方法和組合物。

2.

背景技術(shù)：

大多數(shù)癌細(xì)胞主要通過胞質(zhì)溶膠(cytosol)中高速率的糖酵解隨后進(jìn)行乳酸發(fā)酵來產(chǎn)生能量(甚至在充足的氧存在下也是如此)，而不是像在大多數(shù)正常細(xì)胞中一樣通過線粒體中的丙酮酸氧化產(chǎn)生能量。這種腫瘤特異性瓦博格效應(yīng)(warburgeffect)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展(koppenol等，2011；vanderheiden等，2009)。線粒體氧化磷酸化受氧和丙酮酸的可用性的調(diào)節(jié)，二者分別為該過程的末端電子受體和主要碳源(brown，1992)。線粒體丙酮酸代謝受丙酮酸脫氫酶激酶(pdhk或pdk)(其具有四種同種型(pdhk1-4))和丙酮酸脫氫酶(pdh)的調(diào)節(jié)(roche和hiromasa，2007)。pdhk1(其表達(dá)被缺氧誘導(dǎo)因子1α(hif1α)上調(diào))使pdhe1α亞基的s293磷酸化并使pdh復(fù)合物失活，所述pdh復(fù)合物通常將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a(acetyl-coa)和co2；這導(dǎo)致抑制丙酮酸代謝和三羧酸(tca)循環(huán)偶聯(lián)的電子傳遞，并因此減弱線粒體呼吸和ros產(chǎn)生(holness和sugden，2003；kim等，2006；papandreou等，2006)。通過從線粒體消耗排除丙酮酸，pdhk1誘導(dǎo)可促進(jìn)糖酵解并提高丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化速率。癌細(xì)胞還依賴除葡萄糖之外的用于線粒體代謝的多種底物(例如谷氨酰胺)(gao等，2009)。然而，通過癌基因協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)糖酵解、tca循環(huán)和谷氨酰胺分解的機(jī)制尚未闡明。

丙酮酸激酶m2(糖酵解途徑中的第二atp生成酶)催化磷酸基團(tuán)從磷酸烯醇丙酮酸(pep)轉(zhuǎn)移至腺苷二磷酸用于產(chǎn)生丙酮酸和腺苷三磷酸(atp)。pkm2還充當(dāng)使組蛋白h3、bub3、stat3和erk磷酸化的蛋白激酶(yang等，2012，gao等，2012，jiang等，2014；lowery等，2007)。磷酸甘油酸激酶1(pgk1)(糖酵解途徑中的第一atp生成酶)催化高能磷酸從1，3-二磷酸甘油酸(1，3-bpg)的1位轉(zhuǎn)移至adp，這導(dǎo)致生成3-磷酸甘油酸(3-pg)和atp(marin-hernandez等，2009；semenza，2010)。在人乳腺癌(zhang等，2005)、胰腺導(dǎo)管腺癌(hwang等，2006)、抗放射性星形細(xì)胞瘤(yan等，2012)和多重耐藥性卵巢癌細(xì)胞(duan等，2002)中以及在轉(zhuǎn)移性胃癌、結(jié)腸癌和肝細(xì)胞癌細(xì)胞(zieker等，2010；ahmad等，2013；ai等，2011)中pgk1表達(dá)被上調(diào)。盡管其在許多類型的人癌癥中過表達(dá)，但是pgk1除了其在催化糖酵解反應(yīng)中的作用之外是否具有其他功能以及pgk1促進(jìn)的腫瘤發(fā)生的機(jī)制在很大程度上仍不清楚。

發(fā)明概述

如本文中所教導(dǎo)的，缺氧、egfr的活化和k-rasg12v和b-rafv600e的表達(dá)誘導(dǎo)erk1/2磷酸化依賴性和pin1順-反異構(gòu)化(cis-transisomerization)調(diào)節(jié)的pgk1線粒體易位。充當(dāng)?shù)鞍准っ傅木€粒體pgk1磷酸化并活化pdhk1。不受理論的束縛，這種磷酸化抑制線粒體丙酮酸代謝和ros產(chǎn)生并增強(qiáng)糖酵解和谷氨酰胺分解驅(qū)動的脂質(zhì)合成，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

在一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的組合物，所述癌癥被確定包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平。例如，這樣的組合物可包含有效量的pgk1抑制劑、mek/erk抑制劑、egfr抑制劑、pin1抑制劑或其組合。在一些方面中，所述組合物可包含至少第二治療。

在一些方面中，pgk1抑制劑可以是小分子pgk1抑制劑。這樣的小分子抑制劑可選擇性抑制pgk1的激酶活性。在一些方面中，pgk1抑制劑可包含與pgk1基因的全部或一部分互補(bǔ)的抑制性多核苷酸。這樣的抑制性多核苷酸可以是sirna。

在一些方面中，mek/erk抑制劑可以是u0126、azd6244、pd98059、gsk1120212、gdc-0973、rdea119、pd18416、ci1040或fr180204。在一些方面中，egfr抑制劑可以是ag1478。

在一些實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平；以及(b)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。因此，在一個相關(guān)實施方案中，提供了包含pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療的組合物用于治療患有癌癥的患者，所述癌癥被確定包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平。

在另一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比升高的pgk1s203磷酸化水平；以及(ii)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。

在另一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比升高的pgk1y324磷酸化水平；以及(ii)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。

在另一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比升高的pdhk1t338磷酸化水平；以及(ii)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。

在另一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比升高的pdhs293磷酸化水平；以及(ii)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。

在另一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比升高的cdc45s386磷酸化水平；以及(ii)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。

在另一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比升高的組蛋白h3s10磷酸化水平；以及(ii)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。

在另一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比升高的beclin-1s30磷酸化水平；以及(ii)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。

在另一個實施方案中，提供了用于治療患有癌癥的患者的方法，其包括(a)選擇這樣的患者，其癌細(xì)胞已被確定包含與參考水平相比升高的線粒體定位的pgk1水平；以及(ii)用pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療和/或pin1抑制劑治療來治療所述患者。

在一些實施方案中，提供了選擇患有癌癥的患者進(jìn)行pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療的的方法，其包括確定所述患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平，其中如果患者包含升高的水平，則選擇患者進(jìn)行pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療。因此，在一些方面中，提供了選擇患有癌癥的患者進(jìn)行pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療的方法，其包括：(a)確定患者的癌細(xì)胞是否包含升高水平的1、2、3、4、5和/或6中的任一種；以及(b)如果患者的癌細(xì)胞包含升高水平的1、2、3、4、5和/或6中的任一種，則選擇患者進(jìn)行pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療。

在一個實施方案中，提供了預(yù)測患有癌癥的患者中對pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療之響應(yīng)的方法，其包括確定所述患者的癌細(xì)胞是否包含：與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高水平的組蛋白h3s10磷酸化；或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平，其中如果來自患者的癌細(xì)胞包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平，則預(yù)測患者對pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療具有有利的響應(yīng)；或者其中如果來自患者的癌細(xì)胞不包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平，則預(yù)測患者不對pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療具有有利的響應(yīng)。在一些方面中，提供了預(yù)測患有癌癥的患者中對pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療之響應(yīng)的方法，其包括(a)確定患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比升高水平的1、2、3、4、5和/或6中的任一種；以及(b)如果來自患者的癌細(xì)胞包含升高水平的1、2、3、4、5和/或6中的任一種，則將患者鑒定為預(yù)測對pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療具有有利的響應(yīng)；或者如果來自患者的癌細(xì)胞不包含升高水平的1、2、3、4、5和/或6中的任一種，則將患者鑒定為預(yù)測不對pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療具有有利的響應(yīng)。

如在一些實施方案的方法的上下文中使用的，對治療(例如pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療)的“有利的響應(yīng)”可包括腫瘤尺寸或負(fù)荷減小、腫瘤生長阻滯、腫瘤相關(guān)疼痛減輕、癌癥相關(guān)病理狀況減輕、癌癥相關(guān)癥狀減輕、癌癥無進(jìn)展、無病間期(diseasefreeinterval)延長、進(jìn)展時間延長、誘導(dǎo)緩解、轉(zhuǎn)移降低、患者存活延長和/或腫瘤對抗癌治療的敏感性提高。

在一些方面中，預(yù)測響應(yīng)的方法還包括報告患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化；(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平。在另一些方面中，方法可包括報告癌癥是否被預(yù)測為對pgk1抑制劑治療、mek/erk抑制劑治療、egfr抑制劑治療或pin1抑制劑治療有響應(yīng)。在某些方面中，一些實施方案的方法包括例如通過提供書面、電子或口頭報告來報告結(jié)果。在一些方面中，向患者提供報告。在另一些方面中，向第三方(例如保險公司或衛(wèi)生保健提供者(如醫(yī)生或醫(yī)院))提供報告。

在一些實施方案中，提供了用于確定患有癌癥的患者中預(yù)后的方法，其包括確定患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平，其中如果癌細(xì)胞包含(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平，則預(yù)測所述患者患有侵襲性癌癥(aggressivecancer)。在一些方面中，提供了用于確定患有癌癥的患者中預(yù)后的方法，其包括確定患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平，其中如果癌細(xì)胞包含(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平，則預(yù)測所述患者患有侵襲性癌癥。在一些方面中，提供了用于確定患有癌癥的患者中預(yù)后的方法，其包括(a)確定患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比升高水平的1、2、3、4、5、6、7或8中的任一種；以及(b)如果來自患者的癌細(xì)胞包含升高水平的1、2、3、4、5、6、7或8中任一種，則將患者鑒定為預(yù)測患有侵襲性癌癥；或者如果來自患者的癌細(xì)胞不包含升高水平的1、2、3、4、5、6、7或8中的任一種，則將患者鑒定為預(yù)測不患有侵襲性癌癥。

在一些實施方案中，提供了用于確定患有癌癥的患者中預(yù)后的方法，其包括確定患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化水平或(2)升高的pdhk1t338磷酸化水平，其中如果癌細(xì)胞包含(1)升高的pgk1s203磷酸化或y324磷酸化水平或(2)升高的pdhk1t338磷酸化水平，則預(yù)測患者患有侵襲性癌癥。在一些方面中，提供了用于確定患有癌癥的患者中預(yù)后的方法，其包括確定患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比(1)升高的pgk1s203磷酸化或y324磷酸化水平、(2)升高的pdhk1t338磷酸化水平，其中如果癌細(xì)胞包含(1)升高的pgk1s203磷酸化或y324磷酸化水平和(2)升高的pdhk1t338磷酸化水平，則預(yù)測患者患有侵襲性癌癥。因此，在一些方面中，提供了用于確定患有癌癥的患者中預(yù)后的方法，其包括：(a)確定患者的癌細(xì)胞是否包含與參考水平相比升高的pgk1s203磷酸化水平、升高的pgk1y324磷酸化水平、升高的pdhk1t338磷酸化水平、升高的pdhs293磷酸化水平、升高的cdc45s386磷酸化水平、升高的組蛋白h3s10磷酸化水平；以及(b)如果來自患者的癌細(xì)胞包含升高的水平，則將患者鑒定為預(yù)測患有侵襲性癌癥，或者如果來自患者的癌細(xì)胞不包含升高的水平，則將患者鑒定為預(yù)測不患有侵襲性癌癥。

在一些方面中，確定預(yù)后的方法可包括確定癌癥的等級或癌癥將轉(zhuǎn)移的可能性。在某些方面中，確定預(yù)后的方法還包括報告來自患者的癌細(xì)胞是否包含(1)升高的pgk1s203磷酸化水平、(2)升高的pgk1y324磷酸化水平、(3)升高的pdhk1t338磷酸化水平、(4)升高的pdhs293磷酸化水平、(5)升高的cdc45s386磷酸化水平、(6)升高的組蛋白h3s10磷酸化水平、或(7)升高的beclin-1s30磷酸化水平。在另一些方面中，方法可包括報告癌癥是否為侵襲性癌癥或報告癌癥的等級。在某些方面中，一些實施方案的方法包括例如通過提供書面、電子或口頭報告來報告結(jié)果。在一些方面，向患者提供報告。在另一些方面中，向第三方(例如保險公司或衛(wèi)生保健提供者(如醫(yī)生或醫(yī)院))提供報告。

在一些方面中，如果預(yù)測患者患有侵襲性癌癥，則確定預(yù)后的方法還可包括向患者施用一種或更多種抗癌治療。在一些方面中，參考水平可以是來自非癌細(xì)胞的水平或來自早期或低度癌細(xì)胞的水平。

在另一個實施方案中，提供了用于篩選候選抗癌劑(例如小分子藥劑)的方法，其包括在藥劑存在或不存在下確定pgk1與pdhk1(或其片段)的結(jié)合和/或通過pgk1的pdhk1磷酸化，其中破壞pgk1與pdhk1(或其片段)的結(jié)合和/或破壞通過pgk1的pdhk1磷酸化的藥劑是候選pgk1抑制劑或抗癌劑。在另一個實施方案中，提供了用于篩選候選pgk1抑制劑或抗癌劑的方法，其包括(a)在藥劑存在或不存在下確定pgk1與pdhk1(或其片段)的結(jié)合和/或通過pgk1的pdhk1磷酸化；以及(b)基于破壞pgk1與pdhk1(或其片段)的結(jié)合和/或破壞通過pgk1的pdhk1磷酸化的藥劑，選擇候選pgk1抑制劑或抗癌劑。在某些方面中，一些實施方案的用于篩選的方法可涉及篩選小分子、肽和/或多肽(例如，抗體)。在某些方面中，篩選方法可以在無細(xì)胞系統(tǒng)中。在另一些方面中，篩選在細(xì)胞中(例如，生物體中包含的細(xì)胞)進(jìn)行。在一些情況下，在篩選測定中可包含另外的組分，例如但不限于另外的多肽、脂質(zhì)、糖類、atp、緩沖劑、螯合劑等。

在一些實施方案中，提供了用于預(yù)測患者中癌癥嚴(yán)重程度的方法，其包括(a)確定患者樣品中pgk1活性的水平、pgk1s203磷酸化的水平、pgk1y324磷酸化的水平或pgk1線粒體定位的水平；以及(b)基于pgk1活性的水平、pgk1s203磷酸化的水平、pgk1y324磷酸化的水平或pgk1線粒體定位的水平，預(yù)測對象中癌癥嚴(yán)重程度，其中相對于參考水平的升高的pgk1活性、pgk1s203磷酸化或pgk1線粒體定位的水平表示更嚴(yán)重的癌癥。在某些方面中，確定pgk1活性的水平可包括確定pdhk1t338磷酸化的水平。

一些實施方案的多個方面涉及確定β-聯(lián)蛋白(β-catenin)活性的水平；pgk1s203磷酸化的水平；pgk1y324磷酸化的水平；pdhk1t338磷酸化的水平；pdhs293磷酸化的水平；cdc45s386磷酸化的水平；組蛋白h3s10磷酸化的水平；beclin-1s30磷酸化的水平；pgk1線粒體定位的水平；pgk1異構(gòu)化的水平；和/或pgk1活化的水平。在某些方面中，這種確定可包括進(jìn)行elisa、免疫測定、放射免疫測定(ria)、免疫組織化學(xué)、免疫放射測定、熒光免疫測定、化學(xué)發(fā)光測定、生物發(fā)光測定、凝膠電泳、western印跡分析、southern印跡、流式細(xì)胞術(shù)、原位雜交、正電子發(fā)射斷層顯像(positronemissiontomography，pet)、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像(singlephotonemissioncomputedtomography，spect)成像)或顯微測定。例如，在一些情況下，使用磷酸化特異性抗體來確定pgk1、pdhk1、pdh、cdc45、組蛋白h3或beclin-1磷酸化的水平。在一些方面中，磷酸化的水平被確定為同一樣品中磷酸化蛋白質(zhì)：未磷酸化蛋白質(zhì)的比例。在一些方面中，一些實施方案的方法被限定為體外方法，在另一些方面中，方法可在體內(nèi)進(jìn)行(例如通過體內(nèi)成像)。

一些實施方案的一些方面涉及相對于參考水平確定pgk1s203磷酸化的水平；pgk1y324磷酸化的水平；pdhk1t338磷酸化的水平；pdhs293磷酸化的水平；cdc45s386磷酸化的水平；組蛋白h3s10磷酸化的水平；beclin-1s30磷酸化的水平；pgk1線粒體定位的水平；pgk1異構(gòu)化的水平；和/或pgk1活化的水平。這樣的參考水平可以是來自非癌細(xì)胞的水平(例如，來自健康患者)或來自早期或低度癌細(xì)胞的水平。

一些實施方案的一些方面涉及患者，例如患有癌癥的患者。本文中使用的患者可以是人或非人的動物患者(例如，狗、貓、小鼠、馬等)。在某些方面中，所述患者患有癌癥，例如口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸系統(tǒng)癌癥(respiratorycancer)、泌尿生殖系統(tǒng)癌癥(urogenitalcancer)、胃腸癌、中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織癌(centralorperipheralnervoussystemtissuecancer)、內(nèi)分泌或神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥(endocrineorneuroendocrinecancer)或造血系統(tǒng)癌癥(hematopoieticcancer)、膠質(zhì)瘤、肉瘤、上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、黑素瘤、纖維瘤、腦脊膜瘤、腦癌、口咽癌、鼻咽癌、腎癌、膽道系統(tǒng)癌癥(biliarycancer)、嗜鉻細(xì)胞瘤、胰島細(xì)胞癌、利-弗勞梅尼瘤(li-fraumenitumor)、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、垂體瘤、腎上腺瘤、骨源性肉瘤腫瘤(osteogenicsarcomatumor)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、肺癌、頭頸癌(headandneckcancer)、前列腺癌、食管癌、氣管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、睪丸癌、結(jié)腸癌、直腸癌或皮膚癌。在一些方面中，癌癥為膠質(zhì)瘤。在一些方面中，癌癥為致癌性egfr、致癌性k-ras或致癌性b-raf陽性癌癥。

一些實施方案的一些方面涉及患者樣品，例如組織樣品、流體樣品(例如，血液、尿或糞便)或腫瘤活檢樣品。這樣的樣品可直接從患者獲得或可通過第三方獲得。

本文說明書中使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個/種或更多個/種。本文權(quán)利要求書中使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞，當(dāng)與詞語“包含/包括”結(jié)合使用時可表示一個/種或更多個/種。

除非明確地指出僅僅是指替代方案或替代方案是相互排斥的，否則在權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“或/或者”用于意指“和/或”，盡管本公開內(nèi)容支持僅指替代方案和“和/或”的定義。如本文中使用的“另一個/種”可意指至少第二個/種或更多個/種。

貫穿本申請，術(shù)語“約/大約”用于表示這樣的值，其包括用于確定所述值所用的設(shè)備、方法中誤差的固有差異或研究主題之間存在的差異。

從下面的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的另一些目的、特征和優(yōu)點將變得明顯。然而，應(yīng)理解，雖然指示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是詳細(xì)描述進(jìn)和具體實施例僅以示例說明的方式給出，因為對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)該詳細(xì)描述，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修改將變得明顯。

附圖簡述

以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分，并且被包括在內(nèi)以進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。通過結(jié)合本文中給出的具體實施方案的詳細(xì)描述來參考這些附圖中的一個或更多個可以更好地理解本發(fā)明。

圖1a至i.缺氧以及egfr、k-ras和b-raf的活化誘導(dǎo)的pgk1線粒體易位由erk1/2依賴性pgk1s203磷酸化介導(dǎo)。圖1b和d至i.使用針對指示的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行免疫印跡和免疫沉淀分析。圖1a.將u87細(xì)胞缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激并用抗pgk1抗體、mitotracker和dapi進(jìn)行染色。圖1b.將u87和u251細(xì)胞缺氧刺激6小時。分離來自線粒體外膜(outermembrane，om)、膜間隙(intermembranespace，ims)、內(nèi)膜(innermembrane，im)和基質(zhì)(matrix，ma)的蛋白質(zhì)。圖1c.將u87細(xì)胞在缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。用抗pgk1抗體進(jìn)行電子顯微鏡免疫金分析。箭頭表示線粒體pgk1的代表性染色。虛線圓表示線粒體。圖1d.由u87細(xì)胞制備線粒體級分和總細(xì)胞裂解物，所述u87細(xì)胞用sp600125(25μm)、sb203580(10μm)或u0126(20μm)預(yù)處理30分鐘，隨后缺氧處理6小時。使用微管蛋白作為胞質(zhì)溶膠蛋白標(biāo)志物。圖1e.將經(jīng)u0126(20μm)預(yù)處理30分鐘的egfr過表達(dá)的u87(u87/egfr)細(xì)胞用egf(100ng/ml)刺激6小時或不用egf刺激。制備線粒體級分和總細(xì)胞裂解物。圖1f.用表達(dá)v5-krasg12v和所指示flag-erk2蛋白的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染bxpc-3細(xì)胞或不用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染(左圖)。用表達(dá)v5-brafv600e和所指示flag-erk2蛋白的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染chl1細(xì)胞或不用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染(右圖)。制備線粒體級分和總細(xì)胞裂解物。圖1g.在[γ³²p]atp存下，通過將純化的活性erk2與純化的wtgst-pgk1或gst-pgk1s203a混合進(jìn)行體外激酶測定。分離反應(yīng)混合物用于放射自顯影術(shù)和免疫印跡分析。圖1h.將用表達(dá)所指示的sfb標(biāo)記的pgk1蛋白的載體轉(zhuǎn)染的u87細(xì)胞用u0126(20μm)預(yù)處理30分鐘或不用其進(jìn)行預(yù)處理，隨后缺氧刺激6小時。使用鏈霉親和素瓊脂糖珠拉下sfb標(biāo)記的蛋白。圖1i.將轉(zhuǎn)染有表達(dá)所指示的v5標(biāo)記的pgk1蛋白的載體的u87細(xì)胞在缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。制備線粒體級分和總細(xì)胞裂解物。

圖2a至2i.pin1與磷酸化pgk1結(jié)合并將其順-反異構(gòu)化以用于pgk1線粒體易位。圖2a至f和h至i.使用針對所指示蛋白的抗體進(jìn)行免疫印跡和免疫沉淀分析。圖2a.將u87細(xì)胞用u0126(20μm)預(yù)處理30分鐘或不用其進(jìn)行預(yù)處理，隨后缺氧刺激6小時。圖2b.將u87細(xì)胞缺氧刺激處理6小時或不進(jìn)行缺氧刺激處理。用所指示的gst蛋白進(jìn)行g(shù)st拉下測定(gstpull-downassay)。圖2c.將表達(dá)所指示pgk1蛋白的u87細(xì)胞缺氧刺激處理6小時或不進(jìn)行缺氧刺激處理。用gst-pin1蛋白進(jìn)行g(shù)st拉下測定。圖2d.通過將純化的重組pgk1與純化的活性his-erk2混合或不與其混合來進(jìn)行體外蛋白激酶測定，然后用所指示的gst蛋白進(jìn)行g(shù)st拉下測定測定。圖2e.通過將gst-pin1和所指示的純化的重組pgk1蛋白混合進(jìn)行g(shù)st拉下測定。圖2f.將表達(dá)所指示的sfb標(biāo)記的pgk1蛋白的u87細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。使用鏈霉親和素瓊脂糖珠拉下sfb標(biāo)記的蛋白。圖2g.通過將合成的磷酸化或非磷酸化的包含s203p204基序的pgk1的寡肽或包含d203p204基序的pgk1的寡肽與純化的野生型gst-pin1或gst-pin1c113a突變體混合進(jìn)行順-反異構(gòu)化測定。數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的平均值±sd。圖2h.重建pin1^-/-細(xì)胞以表達(dá)所指示的pin1蛋白(左圖)。由缺氧處理6小時或未進(jìn)行缺氧處理的所指示細(xì)胞制備總細(xì)胞裂解物和線粒體級分(右圖)。圖2i.在pin1^+/+細(xì)胞和pin1^-/-細(xì)胞(具有或不具有重建的wtpin1或pin1c113a)中表達(dá)v5-pgk1s203d。制備總細(xì)胞裂解物和細(xì)胞線粒體級分。

圖3a至h.pin1調(diào)節(jié)pgk1與tom復(fù)合物的結(jié)合。圖3a至g.使用針對指示蛋白的抗體進(jìn)行免疫印跡和免疫沉淀分析。圖3a.將u87細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。制備總細(xì)胞裂解物。圖3b.將pin1^+/+和所指示的pin1^-/-細(xì)胞缺氧刺激6小時。圖3c.在純化的his-pin1存在或不存在下，通過將純化的重組gst-pgk1wt或gst-pgk1s203d與his-tom20混合進(jìn)行g(shù)st拉下測定。圖3d至e.將表達(dá)所指示sfb標(biāo)記的pgk1蛋白的u87細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。使用鏈親和霉素瓊脂糖珠拉下sfb標(biāo)記的蛋白。圖3f至g.將表達(dá)所指示的v5標(biāo)記的pgk1蛋白的u87細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。制備總細(xì)胞裂解物、胞質(zhì)溶膠級分和線粒體級分。圖3h.將表達(dá)所指示v5-pgk1蛋白的u87細(xì)胞缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激并使用抗v5抗體、mitotracker和dapi進(jìn)行染色。

圖4a至4f.線粒體pgk1使pdhk1磷酸化。圖4a至c和e至g.使用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖4a.將u87細(xì)胞(具有或不具有pgk1shrna且具有或不具有wtrpgk1或rpgk1s203a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。制備細(xì)胞的線粒體級分，并測量pdh復(fù)合物介導(dǎo)的¹⁴c標(biāo)記的丙酮酸向¹⁴c標(biāo)記的co2轉(zhuǎn)化的活性。數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的平均值±sd。^＊p＜0.01。圖4b.將u87細(xì)胞缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。制備這些細(xì)胞的線粒體級分。使用抗pgk1抗體進(jìn)行免疫沉淀分析。圖4c.通過將細(xì)菌純化的sumo-pdhk1蛋白與經(jīng)純化的在谷胱甘肽瓊脂糖珠上固化的gst或gst-pgk1混合進(jìn)行g(shù)st拉下分析。圖4d.在atp存在下通過將細(xì)菌純化的his-pgk1和sumo-pdhk1混合進(jìn)行體外磷酸化分析。在m/z756.346處的肽的片段譜的質(zhì)譜結(jié)果(質(zhì)量誤差，±4.2ppm)與雙電荷肽331-lfnymyp(st)aprpr-343(seqidno：10)匹配，這表明s337或t338被磷酸化。mascot評分為49，期望值：4.7e-004；該匹配的sequest評分為xcorr＝3.5。圖4e.在[γ³²p]atp存在下通過將純化的wtpgk1或pgk1t378p與純化的wtpdhk1或pdhk1t338a混合使用放射自顯影術(shù)進(jìn)行體外磷酸化分析。圖4f.將u251和u87細(xì)胞(具有或不具有pgk1shrna且具有或不具有wtrpgk1或rpgk1s203a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。

圖5a至e.通過pgk1的pdhk1磷酸化使pdhk1活化。使用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖5a.將具有純化的wtpdhk1或pdhk1t338a的細(xì)菌純化的his-pdh與純化的wtpgk1或pgk1t378p混合。進(jìn)行體外磷酸化分析。圖5b.將表達(dá)pgk1shrna的u87和u251細(xì)胞(具有或不具有wtrpgk1或rpgk1s203a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。圖5c.將表達(dá)pdhk1shrna的u87和u251細(xì)胞(具有或不具有wtrpdhk1或rpdhk1t338a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。圖5d.將表達(dá)pgk1shrna的u87/egfr細(xì)胞(具有或不具有wtrpgk1或rpgk1s203a的重建表達(dá))用egf(100ng/ml)刺激6小時或不用egf刺激。圖5e.用表達(dá)v5-krasg12v和所指示flag-erk2蛋白的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染bxpc-3細(xì)胞或不用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染(左圖)。用表達(dá)v5-brafv600e和所指示flag-erk2蛋白的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染chl1細(xì)胞或不用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染(右圖)。

圖6a至g.pgk1介導(dǎo)的pdhk1磷酸化抑制線粒體丙酮酸代謝、誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的ros產(chǎn)生并促進(jìn)糖酵解。圖6a至e.數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的平均值±sd。^＊p＜0.01，#p＜0.05。圖6a.將表達(dá)pdhk1shrna的u87細(xì)胞(具有或不具有wtrpdhk1或rpdhk1t338a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。制備細(xì)胞的線粒體級分并測量pdh復(fù)合物介導(dǎo)的¹⁴c標(biāo)記的丙酮酸向¹⁴c標(biāo)記的co2轉(zhuǎn)化的活性。圖6b.將表達(dá)pdhk1shrna的u87細(xì)胞(具有或不具有wtrpdhk1或rpdhk1t338a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。測量線粒體乙酰輔酶a的水平。圖6c.將表達(dá)pdhk1shrna的u87細(xì)胞(具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))缺氧刺激24小時或不進(jìn)行缺氧刺激。測量線粒體ros的水平。圖6d.將表達(dá)pgk1shrna(左圖)或pdhk1shrna(右圖)的u87細(xì)胞(具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。測量胞質(zhì)溶膠丙酮酸的水平。圖6e.將表達(dá)pgk1shrna(左圖)或pdhk1shrna(右圖)的u87細(xì)胞(具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))在缺氧期間在無血清dmem中培養(yǎng)6小時。收集介質(zhì)用于分析乳酸產(chǎn)生。圖6f.將用egf(100ng/ml)刺激24小時或未用egf刺激的u87/egfr細(xì)胞用d-[6-¹⁴c]-葡萄糖或l-[u-¹⁴c]-谷氨酰胺標(biāo)記2小時。檢查細(xì)胞的脂質(zhì)合成。圖6g.將具有wtrpgk1或rpgk1s203d之重建表達(dá)的內(nèi)源性pgk1耗竭的u87細(xì)胞用l-[u-¹⁴c]-谷氨酰胺標(biāo)記2小時。檢查細(xì)胞的脂質(zhì)合成。

圖7a至d.線粒體pgk1依賴性pdhk1磷酸化促進(jìn)細(xì)胞增殖和腦腫瘤發(fā)生并指示gbm患者中的差的預(yù)后。圖7a至b.數(shù)據(jù)表示為三次獨立實驗的平均值±sd。圖7a.在缺氧條件下將總共2×10⁵個u87細(xì)胞(具有或不具有pgk1shrna或pdhk1shrna表達(dá)且具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))平板接種(plate)4天。然后收集細(xì)胞并計數(shù)。圖7b.將總共1×10⁶個u87細(xì)胞(具有或不具有pgk1shrna或pdhk1shrna表達(dá)且具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))顱內(nèi)注射到無胸腺的裸小鼠中(每組n＝7只小鼠)。在28天后，處死小鼠并檢查腫瘤生長。h&e染色的冠狀腦切片顯示代表性腫瘤異種移植物。使用長a和寬b計算腫瘤體積：v＝ab²/2。圖7c.對50份人原發(fā)性gbm標(biāo)本用抗磷酸化pgk1s203、抗磷酸化pdhk1t338和抗磷酸化pdhs293抗體進(jìn)行ihc染色。示出了四個腫瘤的代表性照片。圖7d.比較50位患者的存活時間，所述患者具有低(1至4染色評分，頂部曲線)相對于高(4.1至8染色評分，底部曲線)的pgk1s203(低，14位患者；高，36位患者)和pdhk1t338(低，16位患者；高，34位患者)的磷酸化水平。該表顯示在調(diào)整患者年齡后的多變量分析結(jié)果，這表明pgk1s203(p＝0.016)和pdhk1t338(p＝0.017)磷酸化與患者存活的關(guān)聯(lián)的顯著性水平?？招膱A表示來自最后一次臨床隨訪時活著的患者的刪失數(shù)據(jù)。

圖8.在腫瘤發(fā)生中線粒體pgk1協(xié)調(diào)的糖酵解和tca循環(huán)的機(jī)制。缺氧或egfr、k-ras和b-raf的活化誘導(dǎo)erk磷酸化和pin1順-反異構(gòu)化依賴性pgk1向線粒體中的易位，其中pgk1使pdhk1在t338處磷酸化，導(dǎo)致增強(qiáng)通過pdhk1的pdhs293磷酸化并隨后抑制pdh依賴性線粒體丙酮酸代謝和ros產(chǎn)生并提高糖酵解。這種代謝性改變促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。虛線箭頭：抑制的方向或反應(yīng)。

圖9a至e.缺氧誘導(dǎo)pgk1的線粒體易位。圖9a.由缺氧刺激6小時或未進(jìn)行缺氧刺激的u87和u251細(xì)胞制備總細(xì)胞裂解物、胞質(zhì)溶膠和線粒體級分。用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。缺氧誘導(dǎo)的hif1α表達(dá)(左圖)是缺氧刺激的對照。wcl：總細(xì)胞裂解物；cyto：胞質(zhì)溶膠；mito：線粒體；wb：western印跡。圖9b.由缺氧刺激6小時的u87和u251細(xì)胞制備胞質(zhì)溶膠和線粒體級分。用指示的抗體進(jìn)行相同百分比的胞質(zhì)溶膠和線粒體級分的免疫印跡分析。wcl：總細(xì)胞裂解物；cyto：胞質(zhì)溶膠；mito：線粒體。用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。通過掃描光密度法對圖像進(jìn)行定量。圖9c.用hif1αsirna或亂序sirna轉(zhuǎn)染u87細(xì)胞，隨后缺氧刺激6小時。制備線粒體級分。用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖9d.在tritonx-100存在或不存在下，使用蛋白酶k對從缺氧刺激6小時或未進(jìn)行缺氧刺激的u87或u251細(xì)胞分離的線粒體進(jìn)行處理，然后使用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖9e.在毛地黃皂苷(digitonin)(100μm)存在或不存在下，用蛋白酶k對從缺氧刺激6小時或未進(jìn)行缺氧刺激的u87或u251細(xì)胞分離的線粒體進(jìn)行處理，然后使用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。timm22(線粒體內(nèi)膜蛋白)為對照。

圖10a至i.pgk1線粒體易位依賴于erk1/2介導(dǎo)的pgk1磷酸化。圖10a.從u87細(xì)胞制備總細(xì)胞裂解物，該u87細(xì)胞用sp600125(25μm)、sb203580(10μm)或u0126(20μm)預(yù)處理30分鐘，隨后缺氧處理6小時。用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖10b.從用u0126(20μm)預(yù)處理30分鐘、隨后缺氧處理6小時的u251細(xì)胞制備線粒體級分。使用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖10c.將u87細(xì)胞用u0126(20μm)預(yù)處理30分鐘或不用其進(jìn)行預(yù)處理，隨后缺氧處理6小時。使用抗pgk1抗體、mitotracker和dapi進(jìn)行免疫熒光分析。圖10d.將用載體或flag-erk2k52穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的u87細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。制備線粒體級分和總細(xì)胞裂解物。圖10e.用表達(dá)具有所指示flag-erk2蛋白的ha-mek1q56p的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染u87細(xì)胞或不用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染。制備線粒體級分和總細(xì)胞裂解物。使用所指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖10f.將u87細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。使用針對指示蛋白的抗體進(jìn)行免疫印跡和免疫沉淀分析。圖10g.用純化的重組his-erk2孵育固化的gst或gst-pgk1蛋白。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖10h.將表達(dá)指示的flag標(biāo)記的erk2蛋白的u87細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。使用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖10i.將轉(zhuǎn)染有表達(dá)指示的sfb標(biāo)記的pgk1蛋白的載體的u87細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。使用鏈霉親和素瓊脂糖珠拉下sfb標(biāo)記的蛋白質(zhì)。使用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。

圖11a至j.erk1/2介導(dǎo)的pgk1s203磷酸化是pgk1線粒體易位所需的。用指示的抗體進(jìn)行免疫熒光、免疫沉淀和免疫印跡分析。圖11a.將缺氧刺激6小時或未進(jìn)行缺氧刺激的u87細(xì)胞用指示的抗體、mitotracker和dapi進(jìn)行染色。圖11b.將轉(zhuǎn)染有表達(dá)指示的sfb標(biāo)記的pgk1蛋白的載體的u87細(xì)胞用u0126(20μm)或sp600125(25μm)預(yù)處理30分鐘或不用其進(jìn)行預(yù)處理，隨后缺氧刺激6小時。使用鏈霉親和素瓊脂糖珠拉下sfb標(biāo)記的蛋白。圖11c.用表達(dá)具有所指示flag-erk2蛋白的ha-mek1q56p的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染u87細(xì)胞或不用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染。制備總細(xì)胞裂解物。圖11d.將表達(dá)所指示pgk1蛋白的u87細(xì)胞缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激，并使用抗v5抗體、mitotracker和dapi進(jìn)行染色。圖11e.使用抗pgk1ps203抗體耗竭來自總細(xì)胞裂解物的磷酸化pgk1，該總細(xì)胞裂解物是從缺氧處理6小時或未進(jìn)行缺氧處理的u87細(xì)胞制備的。通過掃描光密度法對圖像進(jìn)行定量。圖11f至g.從用ag1478(100nm)或dmso預(yù)處理30分鐘、隨后缺氧處理6小時的u87細(xì)胞制備總細(xì)胞裂解物。圖11h.將穩(wěn)定表達(dá)指示的sfb標(biāo)記的pgk1蛋白的u87/egfr細(xì)胞用egf(100ng/ml)刺激6小時或不用egf刺激。使用鏈霉親和素瓊脂糖珠拉下sfb標(biāo)記的蛋白。圖11i.將穩(wěn)定表達(dá)指示的v5標(biāo)記的pgk1蛋白的u87/egfr細(xì)胞用egf(100ng/ml)刺激6小時或不用egf刺激。制備線粒體級分和總細(xì)胞裂解物。圖11j.用表達(dá)v5-krasg12v和指示的flag-erk2蛋白的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染bxpc-3細(xì)胞或不用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染(上圖)。用表達(dá)v5-brafv600e和指示的flag-erk2蛋白的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染chl1細(xì)胞或不用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染(下圖)。

圖12a至c.pin1與磷酸化pgk1結(jié)合。圖12a.使用在線zdock服務(wù)器(萬維網(wǎng)網(wǎng)址：zdock.umassmed.edu/)進(jìn)行pgk1(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫id：2zgv)和pin1蛋白(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫id：3tcz)的分子建模分析。pgk1的s203用黃色球表示。pin1的k63和r69用紅色帶狀物表示。圖12b.用純化的野生型gst-pin1孵育固定化的his標(biāo)記的合成的磷酸化或非磷酸化的包含s203p204基序的pgk1的寡肽或包含d203p204基序的pgk1的寡肽。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖12c.從轉(zhuǎn)染有表達(dá)v5標(biāo)記的pgk1s203d蛋白之載體的u87細(xì)胞制備胞質(zhì)溶膠級分和線粒體級分。用指示的抗體對相同百分比的總細(xì)胞裂解物、胞質(zhì)溶膠級分和線粒體級分進(jìn)行免疫印跡分析。wcl：總細(xì)胞裂解物；cyto：胞質(zhì)溶膠；mito：線粒體。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。通過掃描光密度法對圖像進(jìn)行定量。

圖13a至d.pgk1的前序列中的r39/k41是pgk1線粒體易位所需的。圖13a.pgk1的示意性結(jié)構(gòu)示出pgk1的n末端α螺旋中帶正電荷的r39、k41和k48。圖13b.將表達(dá)指示的v5標(biāo)記的pgk1蛋白的u251細(xì)胞缺氧處理6小時或不進(jìn)行缺氧處理。制備線粒體級分和總細(xì)胞裂解物。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖13c.pgk1(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫id：2zgv)的結(jié)構(gòu)示出pgk1r39/k41殘基(黃色球)未暴露在pgk1蛋白的表面上。圖13d.將純化的gst-pgk1s203d與純化的pin1混合或不與其混合，然后用識別38-qrikaa-43的特異性抗pgk1抗體進(jìn)行免疫沉淀。用抗gst抗體進(jìn)行免疫印跡分析。

圖14a至p.線粒體pgk1使pdhk1在t338處磷酸化。圖14a.將u87細(xì)胞(具有或不具有pgk1shrna且具有或不具有wtrpgk1或rpgk1r39/k41a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。制備細(xì)胞的線粒體級分并測量pdh復(fù)合物介導(dǎo)的¹⁴c標(biāo)記的丙酮酸向¹⁴c標(biāo)記的co2轉(zhuǎn)化的活性。數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的平均值±sd。^＊p＜0.01。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14b.將表達(dá)pgk1shrna的u87細(xì)胞(左圖)或u87/egfr細(xì)胞(右圖)(具有或不具有wtrpgk1和所指示突變體的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激(左圖)，或者用egf(100ng/ml)刺激6小時或不用egf進(jìn)行刺激(右圖)。將這些細(xì)胞用[1-¹⁴c]-丙酮酸孵育2小時。測量[1-¹⁴c]co2產(chǎn)生速率。圖14c.將表達(dá)sfb-pdhk1、sfb-pdhk2、sfb-pdhk3或sfb-pdhk4的u87細(xì)胞缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。制備這些細(xì)胞的線粒體級分。用鏈霉親和素瓊脂糖珠進(jìn)行sfb拉下分析。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14d.通過在[γ³²p]atp存在下在激酶測定條件下將細(xì)菌純化的his-pgk1和sumo-pdhk1混合進(jìn)行體外磷酸化分析。進(jìn)行凝膠分離的³²p磷酸化的sumo-pdhk1的磷酸化-氨基酸分析。左側(cè)圖示出了經(jīng)染色的磷酸化-氨基酸標(biāo)志物。在右側(cè)圖的放射自顯影圖上，綠色圓表示pser；紅色圓表示pthr；黑色圓表示ptyr。圖14e.在[γ³²p]atp存在下通過將純化的wtpgk1或pgk1t378p與純化的wtpdhk1、pdhk1s337a或pdhk1t338a混合用放射自顯影術(shù)進(jìn)行體外磷酸化分析。圖14f.通過在3-pg(0.5mm)存在或不存在下將純化的pgk1與純化的pdhk1混合進(jìn)行體外磷酸化分析。使用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14g.通過在甘油醛3-磷酸、nad+和甘油醛磷酸脫氫酶(gapdh)存在下將純化的wtpgk1或pgk1t378p與純化的pdhk1混合進(jìn)行體外磷酸化分析。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14h.將從u87細(xì)胞制備的線粒體級分用atp酶(1單元/mg裂解物蛋白質(zhì))處理或不用其進(jìn)行處理，隨后用純化的wtpgk1孵育。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14i.pgk1的km和1/v相對于1/[atp]的代表性圖。圖14j.測量從缺氧處理6小時或未進(jìn)行缺氧處理的u87或u251細(xì)胞分離的線粒內(nèi)膜體(mitoplast)中的atp濃度。圖14k.用抗pdhk1pt338抗體免疫耗竭缺氧處理6小時或未進(jìn)行缺氧處理的u87細(xì)胞的線粒體級分或者不用所述抗體進(jìn)行免疫耗竭。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14l.重建表達(dá)pgk1shrna的u87和u251細(xì)胞以表達(dá)wtrpgk1或rpgk1t378p。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14m至n.將u87和u251細(xì)胞(具有pgk1shrna且具有wtrpgk1或rpgk1t378p的重建表達(dá))的缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。制備線粒體級分。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14o.測量細(xì)菌純化的wtpgk1、pgk1t378p、pgk1s203a和pgk1r39/k41a的糖酵解活性。數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的平均值±sd。用抗pgk1抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖14p.將u87細(xì)胞缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。用指示的抗體進(jìn)行線粒體裂解物的免疫印跡分析。

圖15a至c.線粒體pgk1以pdhk1t338磷酸化依賴性方式導(dǎo)致增強(qiáng)的pdh磷酸化。圖15a.將表達(dá)pgk1shrna的u87和u251細(xì)胞(具有或不具有wtrpgk1或rpgk1t378p的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。使用指示的抗體進(jìn)行線粒體裂解物的免疫印跡分析。圖15b.將表達(dá)pgk1shrna的u87(具有或不具有wtrpgk1或rpgk1r39/k41a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。用指示的抗體進(jìn)行線粒體裂解物的免疫印跡分析。圖15c.將表達(dá)pgk1shrna的u87(具有wtrpgk1或rpgk1r39/k41a的重建表達(dá))缺氧刺激24小時或不進(jìn)行缺氧刺激。用指示的抗體進(jìn)行線粒體裂解物的免疫印跡分析。

圖16a至m.pgk1介導(dǎo)的pdhk1磷酸化抑制線粒體丙酮酸代謝并促進(jìn)糖酵解。圖16a至k.數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的平均值±sd。^＊p＜0.01。圖16a.將表達(dá)pgk1shrna的u87細(xì)胞(左圖)或u87/egfr細(xì)胞(右圖)(具有或不具有wtrpgk1和所指示突變體的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激(左圖)，或者用egf(100ng/ml)刺激6小時或不用egf進(jìn)行刺激(右圖)。將這些細(xì)胞用[1-¹⁴c]-丙酮酸孵育2小時。測量[1-¹⁴c]co2產(chǎn)生速率。圖16b.將表達(dá)pdhk1shrna的u251細(xì)胞(具有或不具有wtrpdhk1或rpdhk1t338a的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。測量線粒體乙酰輔酶a的水平。圖16c.將表達(dá)pdhk1shrna的u251細(xì)胞(具有或不具有wtrpdhk1或rpdhk1t338a的重建表達(dá))缺氧刺激24小時或不進(jìn)行缺氧刺激。測量線粒體ros的水平。圖16d.用不同表達(dá)水平的wtrpdhk1或rpdhk1t338a重建內(nèi)源性pdhk1耗竭的u87細(xì)胞(左圖)，并缺氧刺激24小時。在缺氧條件下測量細(xì)胞的線粒體ros產(chǎn)生(右圖)。l：低表達(dá)；h：高表達(dá)。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖16e.將內(nèi)源性pgk1耗竭的u87細(xì)胞(具有wtrpgk1或rpgk1r39/k41a的重建表達(dá))缺氧刺激24小時或不進(jìn)行缺氧刺激。測量線粒體ros的水平。圖16f.將具有或不具有pgk1耗竭的u87細(xì)胞缺氧刺激6小時。向分離的線粒體中添加指定濃度的丙酮酸。測量線粒體ros的水平。圖16g.將具有或不具有pgk1耗竭的u87細(xì)胞缺氧刺激6小時。向分離的線粒體中添加指定濃度的丙酮酸。測量線粒體膜電位的水平。aψm：線粒體膜電位。圖16h.將內(nèi)源性pgk1耗竭的u87/egfr細(xì)胞(具有wtrpgk1或rpgk1s203a的重建表達(dá))用dca(5mm)預(yù)處理1小時，隨后用egf(100ng/ml)刺激6小時。測量線粒體ocr。圖16i.將表達(dá)pgk1shrna(左圖)或pdhk1shrna(右圖)的u251細(xì)胞(具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))缺氧刺激6小時或不進(jìn)行缺氧刺激。測量胞質(zhì)溶膠丙酮酸的水平。圖16j.將表達(dá)pgk1shrna(左圖)或pdhk1shrna(右圖)的u251細(xì)胞(具有或或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))在缺氧期間在無血清dmem中培養(yǎng)6小時。收集介質(zhì)用于分析乳酸產(chǎn)生。圖16k.將表達(dá)pgk1shrna的u251細(xì)胞(具有或或不具有wtrpgk1或rpgk1s203d的重建表達(dá))在正常氧條件下在無血清dmem中培養(yǎng)6小時。收集介質(zhì)用于分析乳酸產(chǎn)生。圖16l.將表達(dá)pgk1shrna(左圖)或pdhk1shrna(右圖)的u87/egfr細(xì)胞(具有或或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))用egf(100ng/ml)刺激6小時或不用egf刺激。制備線粒體級分并測量pdh復(fù)合物介導(dǎo)的¹⁴c標(biāo)記的丙酮酸向¹⁴c標(biāo)記的co2轉(zhuǎn)化的活性。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。圖16m.將表達(dá)pgk1shrna(左圖)或pdhk1shrna(右圖)的u87/egfr(具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))在egf(100ng/ml)刺激期間在無血清dmem中培養(yǎng)6小時。收集介質(zhì)用于分析乳酸產(chǎn)生。

圖17a至h.線粒體pgk1依賴性pdhk1磷酸化促進(jìn)細(xì)胞增殖和腦腫瘤發(fā)生。圖17a至c.數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的平均值±sd。圖17a.將總共2×10⁵個u251細(xì)胞(具有或不具有pgk1shrna(左圖)或pdhk1shrna(右圖)表達(dá)且具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))在缺氧條件下平板接種4天。然后收集細(xì)胞并計數(shù)。圖17b.將具有wtrpgk1或rpgk1r39/k41a的重建表達(dá)的總共2×10⁵個內(nèi)源性pgk1耗竭的u87細(xì)胞平板接種，并在缺氧期間用dtt(1mm)處理4天或不用dtt處理。然后收集細(xì)胞并計數(shù)。圖17c.制備來自具有wtrpgk1或rpgk1s203a的重建表達(dá)的內(nèi)源性pgk1耗竭的u87/egfrviii細(xì)胞的線粒體級分和總細(xì)胞裂解物。用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析(左圖)。將指示的u87/egfrviii細(xì)胞(2×10⁵)平板接種3天并計數(shù)(右圖)。圖17d.將具有wtrpgk1或rpgk1s203d的重建表達(dá)的總共2×10⁵個內(nèi)源性pgk1耗竭的u87細(xì)胞平板接種并用谷氨酰胺饑餓處理3天或不用其進(jìn)行饑餓處理。然后收集細(xì)胞并計數(shù)。#p＜0.05。圖17e.具有pgk1shrna(上圖)或pdhk1shrna(下圖)表達(dá)的gsc11細(xì)胞重建表達(dá)其wt對應(yīng)物和所指示突變體。用指示的抗體進(jìn)行總細(xì)胞裂解物的免疫印跡分析。圖17f.將總共1×10⁶個gsc11細(xì)胞(具有或不具有pgk1shrna(上圖)或pdhk1shrna(下圖)表達(dá)且具有或不具有其wt對應(yīng)物和所指示突變體的重建表達(dá))顱內(nèi)注射到每組的無胸腺裸小鼠中。在21天后，處死小鼠并檢查腫瘤生長。h&e染色的冠狀腦切片示出了代表性腫瘤異種移植物。采用長a和寬b計算腫瘤體積：v＝ab²/2。圖17g.使用抗ki67抗體進(jìn)行腫瘤組織的ihc分析。在10個顯微鏡視野中定量ki67陽性細(xì)胞。圖17h.進(jìn)行指示的腫瘤組織的tunel分析。將凋亡的細(xì)胞染成褐色。在10個顯微鏡視野中對凋亡的細(xì)胞進(jìn)行定量。

圖18.erk介導(dǎo)的pgk1磷酸化和pgk1依賴性pdhk1磷酸化與pdh磷酸相關(guān)聯(lián)。用抗磷酸化pgk1s203、抗磷酸化pdhk1t338和抗磷酸化pdhs293抗體對50份人原發(fā)性gbm標(biāo)本進(jìn)行ihc染色。進(jìn)行半定量評分(級別，1至8)(皮爾遜積差相關(guān)檢驗；左上圖，r＝0.66，p＜0.01；右上圖，r＝0.71，p＜0.01；下圖，r＝0.73，p＜0.01)。注意圖上的一些點表示多于一個標(biāo)本(即，一些評分重疊)。

圖19a至c.pgk1使組蛋白h3、cdc45和beclin-1磷酸化。圖19a.組蛋白h3ps10的western印跡示出pgk1使組蛋白h3在s10處磷酸化。在對照條件下，egf刺激組蛋白h3在s10處的磷酸化，然而，這種作用通過使用shrna敲減pgk1而大幅減弱。圖19b.cdc45的western印跡和放射自顯影術(shù)印跡示出pgk1使cdc45在ps386處磷酸化。在[γ³²p]-atp存在下，純化的野生型pgk1而非pgk1激酶失活(kinase-dead，kd)突變體使純化的野生型cdc45而非cdc45s386a磷酸化。圖19c.beclin-1的western印跡和放射自顯影術(shù)印跡示出pgk1使beclin-1在s30處磷酸化。在[γ³²p]-atp存在下，純化的pgk1使野生型beclin-1磷酸化。beclin-1s30a突變體在很大程度上抵抗通過pgk1的磷酸化。

圖20a至c.圖20a至b.通過將純化的重組pgk1wt、y324f或t378p與[γ³²p]-atp混合進(jìn)行體外蛋白激酶測定。通過放射自顯影術(shù)(圖20a)或pgk1py324抗體(圖20b)檢測pgk1y324磷酸化。圖20c.pgk1酶活性測定。將純化的重組pgk1wt、y324f或t378p在25℃下在96孔板中在100μl反應(yīng)緩沖液中(50mmtris-hcl[ph7.5]、5mmmgcl2、5mmatp、0.2mmnadh、10mm甘油-3-磷酸酯和10u的gapdh)孵育并在動力學(xué)模式下在339nm處讀取5分鐘。

具體實施方式

瓦博格效應(yīng)的特征在于與抑制的線粒體丙酮酸代謝組合的提高的葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生。然而，胞質(zhì)溶膠糖酵解與線粒體代謝協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)的機(jī)制尚未闡明。缺氧、egfr活化以及k-rasg12v和b-rafv600e的表達(dá)誘導(dǎo)磷酸甘油酸激酶1(pgk1)的線粒體易位；這是通過pgk1在s203處的erk依賴性磷酸化和隨后的ps203.p204的pin1介導(dǎo)的順-反異構(gòu)化介導(dǎo)的，允許pgk1n末端α螺旋中的r39/k41與tom復(fù)合物相互作用。在線粒體中，pgk1充當(dāng)?shù)鞍准っ竵硎贡崦摎涿讣っ?(pdhk1)在t338處磷酸化，這使pdhk1活化以磷酸化并抑制丙酮酸脫氫酶(pdh)復(fù)合物。這種pgk1介導(dǎo)的pdh抑制降低丙酮酸在線粒體中的利用、抑制活性氧類產(chǎn)生并且提高糖酵解和谷氨酰胺分解驅(qū)動的脂質(zhì)合成，導(dǎo)致提高的腫瘤發(fā)生。此外，pgk1s203和pdhk1t338磷酸化水平與pdhs293磷酸化水平和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)揭露了pgk1作為蛋白激酶在協(xié)調(diào)糖酵解和tca循環(huán)中的功能，這有助于癌癥代謝和腫瘤發(fā)生。

本發(fā)明說明了pgk1是包含可以靶向用于癌癥治療的蛋白激酶活性的代謝酶。pgk1是用于腫瘤發(fā)生的蛋白激酶；磷酸化事件pgk1ps203、pdhkpt338、cdc45ps386、beclin1ps30和組蛋白h3ps10是用于預(yù)后和個性化治療的生物標(biāo)志物。

i.本發(fā)明的一些方面

由于遠(yuǎn)離脈管系統(tǒng)的大量擴(kuò)增，最初在血管環(huán)境中發(fā)生的腫瘤細(xì)胞團(tuán)可變得嚴(yán)重缺氧(brahimi-hom等，2007)。為了在這種缺氧應(yīng)激下存活以及為了支持腫瘤細(xì)胞生長，腫瘤細(xì)胞上調(diào)糖酵解并抑制線粒體中的丙酮酸代謝和氧化磷酸化，使得丙酮酸在胞質(zhì)溶膠中轉(zhuǎn)化為乳酸(gatenby和gillies，2004)。在正常氧條件下，受體酪氨酸激酶的活化或存在普遍的k-ras和b-raf突變促進(jìn)瓦博格效應(yīng)(yang等，2012；yaffe等，1997；tani等，1985)。不受理論的束縛，本文中證明的是先前未知的通過糖酵解酶pgk1的亞細(xì)胞區(qū)室依賴性調(diào)節(jié)之協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)糖酵解和tca循環(huán)的機(jī)制：缺氧應(yīng)激、egfr的活化或者k-rasg12v或b-rafv600e的表達(dá)導(dǎo)致pgk1在s203處erk1/2依賴性磷酸化，導(dǎo)致pin1依賴性pgk1順-反異構(gòu)化、pgk1與tom復(fù)合物的結(jié)合以及隨后的pgk1線粒體易位。在線粒體中，pgk1直接與pdhk1在t338處相互作用并使其磷酸化。這種磷酸化導(dǎo)致增強(qiáng)的pdhk1活性和pdhk1介導(dǎo)的pdh磷酸化，這導(dǎo)致抑制線粒體中的pdh依賴性丙酮酸利用和ros產(chǎn)生，并提高糖酵解以及egf誘導(dǎo)的和谷氨酰胺分解促進(jìn)的脂質(zhì)合成。這種代謝性改變促進(jìn)了細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生(圖8)。連同pkm2發(fā)揮組蛋白激酶功能作用的先前發(fā)現(xiàn)(yang等，2012)，pgk1發(fā)揮蛋白激酶功能作用的證明突出了pgk1和pkm2的雙重作用，這在細(xì)胞代謝和增殖中充當(dāng)糖酵解酶和蛋白激酶二者，擴(kuò)展了重要家族分支的激酶組(kinome)，并且極大地影響了對具有“多面”的蛋白酶在控制細(xì)胞功能方面的理解。

缺氧細(xì)胞提高糖酵解以及抑制細(xì)胞呼吸。提高的糖酵解主要歸因于hif1α-或hif2α-依賴性糖酵解酶表達(dá)，而抑制細(xì)胞呼吸被認(rèn)為是由于接受來自線粒體呼吸鏈的電子所需的氧的缺乏以及由于線粒體丙酮酸代謝和呼吸的抑制，這可受多種機(jī)制(包括hif1α上調(diào)的pdhk1表達(dá))調(diào)節(jié)(kim等，2006；semenza，2008)。通過表達(dá)pgk1r39/k41a誘導(dǎo)的pgk1線粒體易位的缺陷(其對缺氧增強(qiáng)的pdhk1表達(dá)沒有影響)很大程度上降低缺氧誘導(dǎo)的pdh磷酸化。這些結(jié)果表明pdhk1通過自身的過表達(dá)不足以使其在線粒體中的細(xì)胞活性最大化，并且pgk1介導(dǎo)的pdhk1的磷酸化和缺氧增強(qiáng)的pdhk1表達(dá)對調(diào)節(jié)pdhk1活性具有協(xié)同作用。

盡管腫瘤細(xì)胞可在缺氧條件下通過hif調(diào)節(jié)的糖酵解基因表達(dá)和線粒體酶同時調(diào)節(jié)糖酵解和線粒體，但是這種調(diào)節(jié)(其在正常氧條件下不發(fā)生)是慢性反應(yīng)并且需要調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。在正常氧條件下egfr、k-ras和b-raf的活化或缺氧刺激誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞通過pgk1的迅速線粒體易位的立即或急性響應(yīng)，這導(dǎo)致抑制線粒體丙酮酸代謝、線粒體丙酮酸穿梭至胞質(zhì)溶膠用于乳酸產(chǎn)生、以及提高谷氨酰胺分解促進(jìn)的脂肪酸合成。因此，這些發(fā)現(xiàn)提供了糖酵解、tca循環(huán)和谷氨酰胺分解的綜合調(diào)節(jié)的新概念，并且提供了對于由普遍存在的癌基因(例如egfr、k-ras和b-raf)誘導(dǎo)的瓦博格效應(yīng)之關(guān)鍵的新見解。鑒于pgk1表達(dá)在人癌癥中上調(diào)并且與腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān)(zhang等，2005；hwang等，2006；duan等，2002；zieker等，2010；ahmad等，2013；ai等，2011)，這些證明了pgk1依賴性pdhk1t338磷酸化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生以及pgk1s203和pdhk1t338磷酸化水平與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后相關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)提供了用于改進(jìn)診斷和治療人癌癥的分子基礎(chǔ)。

ii.檢測方法

在某些實施方案中，所述方法包括以下步驟：從待測試的哺乳動物獲得生物樣品；檢測樣品中pgk1、pdhk1、pdh、cdc45、組蛋白h3或beclin-1蛋白的磷酸化水平。在一個實施方案中，生物樣品是來自哺乳動物中腫瘤的細(xì)胞樣品。如本文中使用的短語“選擇性測量”是指其中僅在樣品中測量有限數(shù)量的蛋白質(zhì)磷酸化事件而非測定基本上所有蛋白質(zhì)磷酸化的方法。例如，在一些方面中，“選擇性測量”蛋白質(zhì)磷酸化事件可指測量不多于100、75、50、25、15、10、5或2個不同的蛋白質(zhì)磷酸化事件。

在本文中描述的方法的另一個實施方案中，檢測從個體獲得的生物樣品中磷酸化蛋白質(zhì)的存在包括確定樣品中磷酸化多肽的水平。磷酸化蛋白質(zhì)的水平可通過使樣品與特異性結(jié)合磷酸化多肽的抗體接觸并確定結(jié)合的抗體的量來確定(例如通過檢測或測量抗體與多肽之間復(fù)合物的形成)?？贵w可被標(biāo)記(例如，放射性、熒光、生物素化或hrp綴合)以便于檢測復(fù)合物。用于檢測多肽水平的合適的測定系統(tǒng)包括但不限于：流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、競爭elisa測定、放射免疫測定(ria)、免疫熒光、凝膠電泳、western印跡和化學(xué)發(fā)光測定、生物發(fā)光測定、涉及使用對多肽產(chǎn)物具有特異性的抗體在樣品中測定磷酸化蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)測定。用于本發(fā)明的檢測和分析的多種方法和設(shè)備是技術(shù)人員熟知的。關(guān)于受試樣品中的多肽或蛋白質(zhì)，經(jīng)常使用免疫測定設(shè)備和方法。這些設(shè)備和方法可以以多種夾心、競爭性或非競爭性測定方式利用標(biāo)記分子以產(chǎn)生與目的分析物的存在或量有關(guān)的信號。另外地，可以使用某些方法和設(shè)備(例如但不限于生物傳感器和光學(xué)免疫測定)在無需標(biāo)記的分子的情況下確定分析物的存在或量。

或者，可使用質(zhì)譜分析檢測pgk1、pdhk1、pdh、cdc45、組蛋白h3或beclin-1多肽的磷酸化水平。已經(jīng)使用質(zhì)譜分析來檢測血清樣品中的蛋白質(zhì)。質(zhì)譜方法包括表面增強(qiáng)激光解吸電離(surfaceenhancedlaserdesorptionionization，seldi)質(zhì)譜(ms)、seldi飛行時間質(zhì)譜(tof-ms)、maldiqqtof、ms/ms、tof-tof、esi-q-tof和ion-trap。

可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式中任一種對多肽進(jìn)行檢測和定量，包括分析生物化學(xué)方法，例如電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(“hplc”)、薄層色譜(“tlc”)、高擴(kuò)散色譜等；或多種免疫學(xué)方法，例如流體或凝膠沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散(單向或雙向)、免疫電泳、放射免疫測定(“ria”)、酶聯(lián)免疫吸附測定(“elisa”)、免疫熒光測定、流式細(xì)胞術(shù)、facs、western印跡等。

還可使用免疫組織化學(xué)染色來測量多種生物標(biāo)志物的差異表達(dá)。這種方法能夠通過蛋白質(zhì)與特異性抗體的相互作用來定位組織切片的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。為此，可將組織固定在甲醛或其他合適的固定劑中，包埋在石蠟或塑料中并使用切片機(jī)將其切成薄切片(約0.1mm至數(shù)mm厚)?；蛘?，可使用低溫恒溫器將組織冷凍并切成薄切片?？蓪⒔M織的切片排列在固體表面上并附著于其上(即，組織微陣列)。將組織切片與針對目的抗原的一抗一起孵育，然后洗滌以除去未結(jié)合的抗體?？蓪⒁豢古c檢測系統(tǒng)偶聯(lián)，或可用與檢測系統(tǒng)偶聯(lián)的二抗檢測一抗。檢測系統(tǒng)可以是熒光團(tuán)或其可以是酶(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)，其可將底物轉(zhuǎn)化成比色、熒光或化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物。通常在顯微鏡下掃描經(jīng)染色的組織切片。因為來自患有癌癥的對象的組織樣品可以是異質(zhì)的，即一些細(xì)胞可以是正常并且另一些細(xì)胞可以是癌性的，所以可確定組織中陽性染色細(xì)胞的百分比?？梢允褂眠@種測量與染色強(qiáng)度定量一起來生成生物標(biāo)志物的表示值。

可以使用酶聯(lián)免疫吸附測定或elisa來測量多種生物標(biāo)志物的差異表達(dá)。存在多種變化形式的elisa測定。所有都基于抗原或抗體在固體表面(通常是微量滴定板)上的固定化。最初的elisa方法包括制備包含目的生物標(biāo)志物蛋白的樣品，用樣品包被微量滴定板的孔，用識別特異性抗原的一抗孵育每個孔，洗掉未結(jié)合的抗體，然后檢測抗體-抗原復(fù)合物?？芍苯訖z測抗體-抗原復(fù)合物。為此，將一抗與檢測系統(tǒng)(例如產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶)偶聯(lián)。可間接檢測抗體-抗原復(fù)合物。為此，如上所述通過與檢測系統(tǒng)偶聯(lián)的二抗檢測一抗。然后掃描微量滴定板并且可使用本領(lǐng)域已知的方法將原始強(qiáng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成表示值。

還可使用抗體微陣列來測量多種生物標(biāo)志物的差異表達(dá)。為此，將多種抗體排列并共價地附著至微陣列或生物芯片的表面。通常用熒光染料標(biāo)記包含目的生物標(biāo)志物蛋白的蛋白質(zhì)提取物。將標(biāo)記的生物標(biāo)志物蛋白與抗體微陣列一起孵育。在洗滌以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，掃描微陣列。可以使用本領(lǐng)域已知的方式將原始熒光強(qiáng)度據(jù)轉(zhuǎn)化成表示值。

iii.治療方法

本發(fā)明的某些方面可用于基于pgk1的s203、pgk1的y324、pdhk1的t338、pdh的s293、cdc45的s386、組蛋白h3的s10和/或beclin-1的s30的磷酸化狀態(tài)用來鑒定和/或治療疾病或病癥。本發(fā)明的另一些方面提供了用pgk1、mek/erk、egfr和/或pin1抑制劑治療癌癥患者。

本文中使用的術(shù)語“對象”或“患者”是指對其執(zhí)行主題方法的任何個體。盡管如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，患者通常是人，但是患者可以是動物。因此，在患者的定義中包括其他動物，包括哺乳動物，例如嚙齒動物(包括小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠)、貓、狗、兔、農(nóng)場動物(包括牛、馬、山羊、綿羊、豬等)和靈長類(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。

“治療”是指為了獲得疾病或健康相關(guān)病癥的治療益處而向?qū)ο笫┯没蚴┘又委焺┗驅(qū)ο髨?zhí)行某種方法或方式。例如，治療可包括施用化學(xué)治療、免疫治療、放射治療、進(jìn)行手術(shù)或其任意組合。

貫穿本申請使用的術(shù)語“治療益處”或“治療有效的”是指就藥物治療該病癥而言促進(jìn)或增強(qiáng)對象健康的任何情況。這包括但不限于疾病的體征或癥狀的頻率或嚴(yán)重程度降低。例如，癌癥的治療可涉及例如腫瘤侵襲性降低、癌癥生長速率降低或阻止轉(zhuǎn)移。癌癥的治療還可指患癌癥對象存活的延長。

包括組合治療的方法和組合物增強(qiáng)治療或預(yù)防效果，和/或提高其他抗癌或抗過度增殖治療的治療效果?？梢砸杂行崿F(xiàn)期望效果的組合量提供治療和預(yù)防的方法和組合物?？梢允菇M織、腫瘤或細(xì)胞與包含一種或更多種藥劑的一種或更多種組合物或藥理學(xué)制劑接觸，或者通過使組織、腫瘤和/或細(xì)胞與兩種或更多種不同的組合物或制劑接觸。此外，考慮這樣的組合治療可與化學(xué)治療、放射治療、手術(shù)治療或免疫治療聯(lián)合使用。

當(dāng)應(yīng)用于細(xì)胞時，在本文中使用的術(shù)語“接觸”或“暴露”用于描述通過其治療構(gòu)建體和化學(xué)治療劑或放射治療劑被遞送至靶細(xì)胞或被置于與靶細(xì)胞的直接臨近處的方法。為了實現(xiàn)細(xì)胞殺傷，例如這兩種藥劑以有效殺傷細(xì)胞或阻止其分裂的組合量遞送至細(xì)胞。

本文中描述的方法可用于治療癌癥。通常來說，術(shù)語“癌癥”或“癌性的”是指或描述哺乳動物中以細(xì)胞生長失控為典型特征的生理學(xué)狀態(tài)。更具體地，使用任意一種或更多種pgk1、mek/erk、egfr和/或pin1抑制劑或其變體并結(jié)合本文中提供的方法治療的癌癥包括但不限于實體腫瘤、轉(zhuǎn)移癌或非轉(zhuǎn)移癌。在某些實施方案中，癌癥可以起源于膀胱、血液、骨、骨髓、腦、乳腺、結(jié)腸、食管、十二指腸、小腸、大腸、結(jié)腸、直腸、肛門、牙齦(gum)、頭、腎、肝、肺、鼻咽、頸、卵巢、胰腺、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌或子宮。

癌癥可以具體地具有以下組織學(xué)類型，但其不限于這些：惡性贅生物；上皮癌；淋巴瘤；母細(xì)胞瘤；肉瘤；未分化的上皮癌；腦脊膜瘤；腦癌；口咽癌；鼻咽癌；腎癌；膽道系統(tǒng)癌癥；嗜鉻細(xì)胞瘤；胰島細(xì)胞癌；利-弗勞梅尼瘤；甲狀腺癌；甲狀旁腺癌；垂體瘤；腎上腺瘤；骨源性肉瘤腫瘤；神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤；乳腺癌；肺癌；頭頸癌；前列腺癌；食管癌；氣管癌；肝癌；膀胱癌；胃癌；胰腺癌；卵巢癌；子宮癌；宮頸癌；睪丸癌；結(jié)腸癌；直腸癌；皮膚癌；巨細(xì)胞和梭狀細(xì)胞癌；小細(xì)胞癌；小細(xì)胞肺癌；非小細(xì)胞肺癌；乳頭狀癌；口腔癌；口咽癌；鼻咽癌；呼吸系統(tǒng)癌癥；泌尿生殖系統(tǒng)癌癥；鱗狀細(xì)胞癌；淋巴上皮癌；基底細(xì)胞癌；毛母質(zhì)癌；移行細(xì)胞癌；乳頭狀移行細(xì)胞癌；腺癌；胃腸癌；惡性胃泌素瘤；膽管癌；肝細(xì)胞癌；聯(lián)合肝細(xì)胞癌和膽管癌；小梁腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉中的腺瘤；腺癌，家族性結(jié)腸息肉?。粚嶓w癌；惡性類癌腫瘤；分支肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細(xì)胞癌；嗜酸性癌；嗜酸性腺癌；嗜堿性癌；透明細(xì)胞腺癌；顆粒細(xì)胞癌；濾泡腺癌；乳頭狀腺癌和濾泡狀腺癌；非包囊硬化性癌(nonencapsulatingsclerosingcarcinoma)；腎上腺皮質(zhì)癌；子宮內(nèi)膜癌；皮膚附屬器癌；大汗腺癌(apocrineadenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聹腺癌(ceruminousadenocarcinoma)；黏液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌(papillaryserouscystadenocarcinoma)；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒細(xì)胞癌；浸潤性導(dǎo)管癌；髓質(zhì)癌；小葉癌；炎性癌；乳腺佩吉特癌；腺泡細(xì)胞癌；腺鱗癌；腺癌伴鱗狀化生(adenocarcinomawithsquamousmetaplasia)；惡性胸腺瘤；惡性卵巢基質(zhì)瘤；惡性卵泡膜細(xì)胞瘤(thecoma)；惡性顆粒細(xì)胞瘤；惡性睪丸母細(xì)胞瘤(androblastoma)；賽托利細(xì)胞癌(sertolicellcarcinoma)；惡性萊迪希細(xì)胞瘤(leydigcelltumor)；惡性脂質(zhì)細(xì)胞瘤；惡性副神經(jīng)節(jié)瘤；惡性乳腺外副神經(jīng)節(jié)瘤；嗜鉻細(xì)胞瘤；腎小球肉瘤(glomangiosarcoma)；惡性黑素瘤；無色素性黑素瘤；淺表擴(kuò)散性黑素瘤；巨型色素痣中的惡性黑素瘤；惡性雀斑樣痣黑素瘤(lentigomalignamelanoma)；肢端雀斑樣痣黑素瘤(acrallentiginousmelanoma)；結(jié)節(jié)性黑素瘤；上皮樣細(xì)胞黑素瘤；惡性藍(lán)色痣；肉瘤；纖維肉瘤；惡性纖維組織細(xì)胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；肺泡橫紋肌肉瘤；基質(zhì)肉瘤；惡性混合瘤；苗勒氏混合腫瘤(mullerianmixedtumor)；腎母細(xì)胞瘤；肝母細(xì)胞瘤；癌肉瘤；惡性間質(zhì)瘤；惡性布倫納瘤；惡性葉狀瘤(phyllodestumor)；滑膜肉瘤；惡性間皮瘤；無性細(xì)胞瘤；胚胎癌；惡性畸胎瘤；惡性卵巢甲狀腺瘤(strumaovarii)；絨毛膜癌；惡性中腎瘤；血管肉瘤；惡性血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤；卡波西肉瘤；惡性血管外皮細(xì)胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮質(zhì)骨肉瘤(juxtacorticalosteosarcoma)；軟骨肉瘤；惡性軟骨母細(xì)胞瘤；間充質(zhì)軟骨肉瘤(mesenchymalchondrosarcoma)；骨巨細(xì)胞瘤；尤因肉瘤；惡性牙肉瘤(odontosarcoma)；成釉細(xì)胞牙肉瘤；惡性成釉細(xì)胞瘤；成釉細(xì)胞纖維肉瘤；內(nèi)分泌或神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥或造血系統(tǒng)癌癥；惡性松果體瘤；脊索瘤；中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織癌；惡性膠質(zhì)瘤；室管膜瘤；星形細(xì)胞瘤；原生質(zhì)型星形細(xì)胞瘤；纖維性星形細(xì)胞瘤；星形母細(xì)胞瘤；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；少突神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤；少突膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤；小腦肉瘤；神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；嗅神經(jīng)源性腫瘤；惡性腦脊膜瘤；神經(jīng)纖維肉瘤；惡性神經(jīng)鞘瘤；惡性顆粒細(xì)胞瘤；b細(xì)胞淋巴瘤；惡性淋巴瘤；霍奇金?。换羝娼鸩。坏投?濾泡性非霍奇金淋巴瘤；副肉芽腫；小淋巴細(xì)胞惡性淋巴瘤；大細(xì)胞彌漫性惡性淋巴瘤；濾泡性惡性淋巴瘤；蕈樣肉芽腫(mycosisfungoides)；套細(xì)胞淋巴瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(waldenstrom’smacroglobulinemia)；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；惡性組織細(xì)胞增生癥；多發(fā)性骨髓瘤；肥大細(xì)胞肉瘤；免疫增生性小腸疾??；白血?。涣馨托园籽?；漿細(xì)胞白血??；紅白血?。涣馨腿饬黾?xì)胞白血??；髓性白血?。皇葔A性白血?。皇人崃＜?xì)胞白血??；單核細(xì)胞白血?。环蚀蠹?xì)胞白血??；巨核細(xì)胞白血??；骨髓肉瘤；慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)；急性淋巴細(xì)胞白血病(all)；毛細(xì)胞白血?。宦粤＜?xì)胞白血?。缓兔?xì)胞白血病。

患者對治療的有效響應(yīng)或患者對治療的“響應(yīng)性”是指給予處于疾病或病癥風(fēng)險或遭受疾病或病癥的患者的臨床或治療益處。這樣的益處可以包括細(xì)胞或生物學(xué)響應(yīng)、完全響應(yīng)、部分響應(yīng)、穩(wěn)定疾病(沒有進(jìn)展或復(fù)發(fā))或具有較晚復(fù)發(fā)的響應(yīng)。例如，在診斷患有癌癥的患者中有效響應(yīng)可以是減小的腫瘤尺寸或無進(jìn)展存活。

關(guān)于腫瘤病癥治療，根據(jù)腫瘤病癥的階段，腫瘤病癥治療涉及以下治療中的一種或組合：除去腫瘤組織的手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療。其他治療方案可以與施用抗癌劑(例如，治療組合物和化學(xué)治療劑)組合。例如，待用這樣的抗癌劑治療的患者還可接受放射治療和/或可經(jīng)歷手術(shù)。

為了預(yù)防或治療疾病，治療組合物(例如，pgk1、mek/erk、egfr和/或pin1抑制劑)的合適劑量取決于如以上限定的待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程、施用藥劑是為了預(yù)防還是治療目的、先前的治療、患者臨床病史和對藥劑的反應(yīng)和醫(yī)師的判斷。以一次或一系列的治療向患者適當(dāng)?shù)厥┯盟巹?/p>

iv實施方案的治療劑

實施方案的某些方面涉及向確定包含一種或更多種實施方案的生物標(biāo)志物的患者施用靶向治療。在一些方面中，向被鑒定為具有表達(dá)活化的pgk2(或其生物標(biāo)志物)的癌癥的患者施用pgk1抑制劑、mek/erk抑制劑、egfr抑制劑或pin1抑制劑治療中的一種或更多種。以下提供了根據(jù)實施方案使用的一些特異性靶向治療。

a.mek/erk激酶抑制劑

可在實施方案的某些方面中使用mek抑制劑，其包括促分裂原活化的蛋白激酶激酶(mapk/erk激酶或mek)或其相關(guān)信號途徑(如mapk級聯(lián)反應(yīng))的抑制劑。促分裂原活化的蛋白激酶激酶(sic)是使促分裂原活化的蛋白激酶磷酸化的激酶酶。其還被稱為map2k。細(xì)胞外刺激通過信號級聯(lián)(“mapk級聯(lián)”)導(dǎo)致map激酶活化，所述信號級聯(lián)由map激酶、map激酶激酶(mek、mkk、mekk或map2k)和map激酶激酶激酶(mkkk或map3k)構(gòu)成。

本文中的mek抑制劑通常是指mek抑制劑。因此，mek抑制劑是指蛋白激酶的mek家族成員的任何抑制劑，包括mek1、mek2和mek5。還提及了mek1、mek2和mek5抑制劑。本領(lǐng)域已知的合適的mek抑制劑的實例包括mek1抑制劑pd184352和pd98059、mek1和mek2抑制劑u0126和sl327以及davies等(2000)中討論的那些。

特別地，當(dāng)與其他已知的mek抑制劑相比時，已發(fā)現(xiàn)pd184352和pd0325901具有高度的特異性和效力(bain等，2007)。zhang等(2000)中描述了其他的mek抑制劑和mek抑制劑類別。

mek的抑制劑可包括抗體、顯性負(fù)變體以及抑制mek表達(dá)的sirna和反義核酸。mek抑制劑的具體實例包括但不限于：pd0325901(參見例如，rinehart等，2004)、pd98059(例如，可從cellsignalingtechnology得到)、u0126(例如，可從cellsignalingtechnology得到)、sl327(例如，可從sigma-aldrich得到)、arry-162(例如，可從arraybiopharma得到)、pd184161(參見例如，klein等，2006)、pd184352(ci-1040)(參見例如，mattingly等，2006)、舒尼替尼(azd6244/arry-142886/arry-886；參見例如，voss等，us2008/004287通過引用并入本文)、索拉非尼(參見上文voss)、凡德他尼(參見上文voss)、帕唑帕尼(參見例如上文voss)、阿西替尼(參見上文voss)、ptk787(參見上文voss)、refametinib(bay-86-9766/rdea-119)、pimasertib(也稱為as703026或msc1936369b)和曲美替尼(trametinib)(gsk-1120212)。

目前，若干種mek抑制劑正在經(jīng)歷臨床試驗評價。ci-1040已經(jīng)在癌癥的i期和ii期臨床試驗中進(jìn)行了評價(參見例如，rinehart等，2004)。正在評價(例如，在臨床試驗中)的其他mek/erk抑制劑包括pd184352(參見例如english和cobb，2002)、bay43-9006(參見例如chow等，2001)、pd-325901(也稱為pd0325901)、arry-438162、rdeal19、rdea-436、ro5126766、xl518、azd8330(也稱為arry-704)、gdc-0973、rdea119、pd18416、sch900353、rg-7167、wx-554、e-6201、as-703988、bi-847325、tak-733、rg-7304或fr180204。

b.pin1抑制劑

實施方案的另外一些方面涉及pin1抑制劑以及此類抑制劑的施用。pin1的抑制劑的實例包括但不限于tme-001(2-(3-氯-4-氟-苯基)-異噻唑-3-酮；參見mori等，2011)、5’-硝基-靛玉紅肟(indirubinoxime)(yoon等，2012)和環(huán)己基酮底物類似物抑制劑，例如ac-pser-ψ[c＝och]-pip-色胺(xu等，2012)。xu等(2011)還描述了具有r-pser-ψ[ch2n]-pro-2-(吲哚-3-基)乙胺結(jié)構(gòu)的pin1抑制劑，其中r為芴基甲氧基羰基(fmoc)或ac。肽(例如二硫化物-環(huán)化肽)也已被證明是有效的pin1抑制劑，并且可根據(jù)本發(fā)明實施方案進(jìn)行使用(參見例如，duncan等(2011)，通過引用并入本文)。

c.另外的靶向抑制劑

使用靶向抑制性rna治療(例如，通過向特定基因或途徑施用或表達(dá)微小rna(mirna)或小干擾rna(sirna))同樣可實現(xiàn)靶向抑制。使用rna介導(dǎo)的干擾可方便地實現(xiàn)例如pgk1、mek/erk、egfr或pin1的抑制。通常來說，將與靶mrna的全部或一部分互補(bǔ)的雙鏈rna分子引入癌細(xì)胞，從而促進(jìn)mrna分子的特異性降解。該轉(zhuǎn)錄后機(jī)制導(dǎo)致靶向mrna和相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)降低或消除。

此外，已知了用于鑒定新的靶向抑制劑(包括，例如pgk1、mek/erk、egfr或pin1抑制劑)的許多測定。例如，davies等(2000)描述了其中在肽底物和放射性標(biāo)記的atp存在下孵育激酶的激酶測定。通過激酶磷酸化底物導(dǎo)致將標(biāo)記并入底物。將每個反應(yīng)的等分試樣固定化在磷酸纖維素紙上，并在磷酸中洗滌以除去游離atp。然后測量孵育后的底物活性并提供激酶活性的指示。使用這種測定可容易地確定候選激酶抑制劑存在和不存在下的相對激酶活性。downey等(1996)還描述了可用于鑒定根據(jù)一些實施方案可使用的激酶抑制劑的激酶活性的測定。

d.前藥

化合物(例如本實施方案的靶向抑制劑)還可以以前藥的形式存在。由于已知前藥提高藥物的許多期望的品質(zhì)(例如，溶解性、生物利用度、制備等)，因此如果期望的話，本發(fā)明的一些方法中使用的化合物可以以前藥的形式遞送。通常來說，這樣的前藥將是實施方案的代謝途徑抑制劑的功能性衍生物。例如在“designofprodrugs”，編輯h.bundgaard，elsevier，1985；huttunen等，2011；以及hsieh等，2009中描述了用于選擇和制備合適的前藥衍生物的常規(guī)方法，其各自通過引用整體并入本文。

前藥可以是生物活性抑制劑(“母體藥物”或“母體分子”)的藥理上無活性的衍生物，其需要在體內(nèi)轉(zhuǎn)化以釋放活性藥物，并且相對于母體藥物分子具有改善的遞送特性。體內(nèi)的轉(zhuǎn)化可以是例如一些代謝過程的結(jié)果，例如羧酸酯、磷酸酯或硫酸酯的化學(xué)或酶水解，或者敏感功能性的還原或氧化。因此，實施方案中使用的化合物的前藥可通過修飾化合物中存在的官能團(tuán)進(jìn)行制備，以這樣的方式使得修飾物在常規(guī)操作中或在體內(nèi)切割為母體化合物。前藥包括例如其中羥基、氨基或羧基鍵合到任何基團(tuán)的本文中所述的化合物，使得將當(dāng)前藥向?qū)ο笫┯脮r，所述化合物切割以分別形成羥基、氨基或羧酸。因此，本發(fā)明考慮本發(fā)明化合物的前藥以及遞送前藥的方法。

e.抑制性寡核苷酸

抑制性寡核苷酸可抑制細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。寡核苷酸可以是5至50個或更多個核苷酸長，并且在某些實施方案中為7至30個核苷酸長。在某些實施方案中，寡核苷酸可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長。寡核苷酸可包含核酸和/或核酸類似物。通常來說，抑制性寡核苷酸將抑制細(xì)胞內(nèi)單個基因(例如，pgk1)的翻譯；然而，在某些實施方案中，抑制性寡核苷酸可抑制細(xì)胞內(nèi)的多于一種基因的翻譯。

在寡核苷酸內(nèi)，寡核苷酸的組分不需要全部是相同類型或同質(zhì)的(例如，寡核苷酸可包含核苷酸和核酸或核苷酸類似物)。在本發(fā)明的某些實施方案中，寡核苷酸可僅包含單個核酸或核酸類似物。抑制性寡核苷酸可包含與互補(bǔ)核酸雜交以形成雙鏈結(jié)構(gòu)的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30個或更多個連續(xù)的核酸堿基(nucleobase)，包括其間的所有范圍。

iii組合治療

包括組合治療的方法和組合物提高治療和保護(hù)效果，和/或提高其他抗癌或抗增殖治療的治療效果。治療和預(yù)防方法和組合物可以以有效實現(xiàn)期望效果(例如殺傷癌細(xì)胞和/或抑制細(xì)胞過度增殖)的組合量來提供。組織、腫瘤或細(xì)胞可與包含一種或更多種藥劑的一種或更多種組合物或藥物制劑接觸，或者通過使組織、腫瘤和/或細(xì)胞與兩種或更多種不同的組合物或制劑接觸。此外，考慮這樣的組合治療可與放射治療、手術(shù)治療或免疫治療結(jié)合使用。

組合施用可包括同時施用兩種或更多種相同劑型的藥劑、同時施用不同的劑型以及分開施用。即，該主題治療組合物與其他治療劑可以以相同劑型一起配制并同時施用?；蛘?，主題治療組合物與其他治療劑可同時施用，其中兩種藥劑均存在于單獨的制劑中。在另一個替代方案中，可在其他治療劑之后緊接著施用治療劑，反之亦然。在分開的施用方案中，主題治療組合物和其他治療劑可以間隔幾分鐘、或間隔幾小時、或間隔幾天施用。

第一抗癌治療可在相對于第二抗癌治療之前、期間、之后或以多種組合施用。施用可以以同時至間隔數(shù)分鐘至數(shù)天至數(shù)周進(jìn)行。在其中向患者分開提供第一治療與第二治療的實施方案中，通常將確保在每次遞送時間之間的相當(dāng)長的一段時間內(nèi)不會失效，使得兩種化合物仍然能夠?qū)颊甙l(fā)揮有利的組合效應(yīng)。在這種情況下，考慮在彼此相隔約12小時至24小時或72小時內(nèi)，更特別地在相隔約6小時至12小時內(nèi)可為患者提供第一治療和第二治療。在一些情況下，可能期望顯著地延長治療的時間周期，其中各自施用之間的間隔由數(shù)天(2、3、4、5、6或7)延長至數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

在某些實施方案中，治療過程將持續(xù)1至90天或更長(該范圍包括間隔天數(shù))?？紤]可在第1天至第90天(該范圍包括間隔天數(shù))或其任意組合的任一天給予一種藥劑，并且在第1天至第90天(該范圍包括間隔天數(shù))或其任意組合的任一天給予另一種藥劑。在一天內(nèi)(24小時期間)，可給予患者一次或多次藥劑施用。此外，在治療過程之后，考慮存在不施用抗癌治療的一段時間。該時間段可持續(xù)1至7天，和/或1至5周，和/或1至12個月或更長(該范圍包括間隔天數(shù))，這取決于患者的狀況，例如其預(yù)后、強(qiáng)度、健康等。預(yù)期如果必要將重復(fù)治療周期。

可以使用多種組合。例如，以下pgk1、mek/erk、egfr、和/或pin1抑制劑為“a”，且另一種抗癌治療為“b”。

a/b/ab/a/bb/b/aa/a/ba/b/bb/a/aa/b/b/bb/a/b/b

b/b/b/ab/b/a/ba/a/b/ba/b/a/ba/b/b/ab/b/a/a

b/a/b/ab/a/a/ba/a/a/bb/a/a/aa/b/a/aa/a/b/a

考慮到藥劑的毒性(如果有的話)，向患者施用本發(fā)明的任何化合物或治療將遵循用于施用此類化合物的一般方案。因此，在一些實施方案中，存在可歸因于組合治療的監(jiān)測毒性的步驟。

a.化學(xué)治療

根據(jù)本發(fā)明可使用多種化學(xué)治療劑。術(shù)語“化學(xué)治療”是指使用藥物來治療癌癥?！盎瘜W(xué)治療劑”用于意指在癌癥治療中施用的化合物或組合物。通過這些藥劑或藥物在細(xì)胞內(nèi)的活性模式(例如，它們是否影響細(xì)胞周期或在哪個階段影響細(xì)胞周期)對其進(jìn)行分類?；蛘?，可以基于藥劑直接交聯(lián)dna、插入dna或通過影響核酸合成來誘導(dǎo)染色體和有絲分裂畸變的能力來對其進(jìn)行表征。

化學(xué)治療劑的實例包括烷化劑，例如噻替派和環(huán)磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶類，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(包括合成類似物拓?fù)涮婵?；苔蘚抑素；callystatin；cc-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；隱藻素類(cryptophycin)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他??；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成類似物kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯膦酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類(nitrosureas)，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素類，例如烯二炔類抗生素(enediyneantibiotic)(例如，加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1i和加利車霉素ωi1；達(dá)內(nèi)霉素(dynemicin)，包括達(dá)內(nèi)霉素a；二膦酸鹽類(bisphosphonate)，例如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)生色團(tuán)及相關(guān)的色蛋白烯二炔類抗生素生色團(tuán)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、重氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素、放線菌素c(cactinomycin)、卡洛比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放線菌素d(dactinomycin)、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(包括嗎啉代-多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星、伊索比星、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(例如絲裂霉素c)、霉酚酸、諾加霉素(nogalarnycin)、橄欖霉素、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfimromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁和佐柔比星；抗代謝物類，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，例如二甲葉酸、蝶羅呤和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、脫氧氟尿苷、依諾他濱和氟尿苷；雄激素，例如卡魯睪酮、丙酸甲雄烷酮(dromostanolonepropionate)、環(huán)硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷和睪內(nèi)酯；抗腎上腺，例如米托坦(mitotane)和曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，例如亞葉酸(frolinicacid)；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；貝塔布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌(diaziquone)；伊弗尼辛(elformithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidainine)；美登素生物堿類(maytansinoid)，例如美登素和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；噴司他??；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；psk多糖復(fù)合物)；雷佐生(razoxane)；根毒素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢霉烯類(trichothecene)(尤其是t-2毒素、疣孢菌素a(verracurina)、桿孢菌素a和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；環(huán)磷酰胺；紫杉烷類，例如紫杉醇和多西他賽(doxetaxel)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑配位復(fù)合物，例如順鉑、奧沙利鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(vp-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾肖靈(novantrone)；替尼泊苷；依達(dá)曲沙(edatrexate)；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda)；伊班膦酸(ibandronate)；伊立替康(例如，cpt-11)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；類視黃醇a，例如視黃酸；卡培他濱；卡鉑、丙卡巴肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他濱(gemcitabien)、諾維本(navelbine)、法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉑(transplatinum)；以及上述任一種的可藥用鹽、酸或衍生物。

b.放射治療

導(dǎo)致dna損傷并已廣泛使用的其他因素包括通常被稱為γ射線、x射線的那些和/或向腫瘤細(xì)胞定向遞送放射性同位素。還考慮了其他形式的dna損傷因素，例如微波、質(zhì)子束照射(美國專利5,760,395和4,870,287)和uv輻照。最有可能所有這些因素對dna、dna前體、dna的復(fù)制和修復(fù)以及染色體的組裝和維持引起寬范圍的損害。x射線的劑量范圍以50至200倫琴日劑量持續(xù)一段長時間(3至4周)至2000至6000倫琴的單劑量。放射性同位素的劑量范圍變化很大，且取決于同位素的半衰期、放射輻射的強(qiáng)度和類型以及贅生性細(xì)胞的攝取。

c.免疫治療

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，另外的免疫治療可與本發(fā)明的方法結(jié)合或組合使用。在癌癥治療的背景下，免疫治療通常依賴于使用免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子來靶向并破壞癌細(xì)胞。利妥昔單抗()就是這樣一個實例。免疫效應(yīng)物可以是例如對腫瘤細(xì)胞表面上的一些標(biāo)志物特異的抗體?？贵w單獨可充當(dāng)治療的效應(yīng)物，或者其可募集其他細(xì)胞以實際影響細(xì)胞殺死?？贵w還可與藥物或毒素(化學(xué)治療性、放射性核素、蓖麻毒素a鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)綴合并且僅充當(dāng)靶向劑?；蛘撸?yīng)物可以是直接或間接地與腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)相互作用的攜帶表面分子的淋巴細(xì)胞。多種效應(yīng)物細(xì)胞包括細(xì)胞毒性t細(xì)胞和nk細(xì)胞。

在免疫治療的一個方面中，腫瘤細(xì)胞必須具有進(jìn)行靶向的一些標(biāo)志物，即，不存在于大多數(shù)其他細(xì)胞上。存在許多腫瘤標(biāo)志物，并且這些腫瘤標(biāo)志物中的任何一種可能適于本發(fā)明的上下文中的靶向。常見的腫瘤標(biāo)志物包括cd20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、tag-72、hmfg、唾液酸化的路易斯抗原、muca、mucb、plap、層黏連蛋白受體、erbb和p155。免疫治療的一個替代方面是將抗癌作用與免疫刺激作用相結(jié)合。還存在免疫刺激分子，包括：細(xì)胞因子，例如il-2、il-4、il-12、gm-csf、γ-ifn，趨化因子例如mip-1、mcp-1、il-8和生長因子，例如flt3配體。

目前正在研究或正在使用的免疫治療的實例是免疫佐劑，例如，牛分枝桿菌(mycobacteriumbovis)、惡性瘧原蟲(plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美國專利5,801,005和5,739,169；hui和hashimoto，1998；christodoulides等，1998)；細(xì)胞因子治療，例如干擾素α、β和γ、il-1、gm-csf和tnf(bukowski等，1998；davidson等，1998；hellstrand等，1998)；基因治療，例如tnf、il-1、il-2和p53(qin等，1998；austin-ward和villaseca，1998；美國專利5,830,880和5,846,945)；以及單克隆抗體，例如抗cd20、抗神經(jīng)節(jié)苷脂gm2和抗p185(hanibuchi等，1998；美國專利5,824,311)?？紤]一種或更多種抗癌治療可與本文中所述的抗體治療一起使用。

d.手術(shù)

約60％患有癌癥的人將經(jīng)歷某種類型的手術(shù)，其包括預(yù)防性、診斷性或分期、治療性和緩解性手術(shù)。治愈性手術(shù)包括其中全部或一部分癌組織被物理去除、切除和/或破壞的切除術(shù)，并且可以與其他治療(例如本發(fā)明的治療、化學(xué)治療、放射治療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或替代治療)結(jié)合使用。腫瘤切除術(shù)是指物理去除至少一部分腫瘤。除腫瘤切除術(shù)之外，通過手術(shù)的治療包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電外科手術(shù)和用顯微鏡控制的手術(shù)(莫氏手術(shù)(mohs’surgery))。

在切除一部分或全部癌性細(xì)胞、組織或腫瘤之后，可以在體內(nèi)形成腔。治療可通過灌注、直接注射或向該區(qū)域局部施用另外的抗癌治療來實現(xiàn)。這樣的治療可以重復(fù)，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月。這些治療也可具有不同的劑量。

e.另外的藥劑

考慮可以將另外的藥劑與本發(fā)明的某些方面組合使用以改善治療的治療效力。這些另外的藥劑包括影響細(xì)胞表面受體與gap連接的增量調(diào)節(jié)的藥劑、細(xì)胞抑制劑和分化劑、細(xì)胞黏附抑制劑、提高過度增殖細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或其他生物藥劑的敏感性的試劑。通過提高gap連接數(shù)提高細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將會提高相鄰過度增殖細(xì)胞群的抗過度增殖性效應(yīng)。在另一些實施方案中，細(xì)胞抑制劑或分化劑可與本發(fā)明的某些方面組合使用以改善治療的抗過度增殖效力?？紤]細(xì)胞黏附抑制劑以改善本發(fā)明的效力。細(xì)胞黏附抑制劑的實例是黏著斑激酶(focaladhesionkinase，fak)抑制劑和洛伐他汀。進(jìn)一步考慮提高過度增殖細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的敏感性的其他試劑(例如抗體c225)可以與本發(fā)明的某些方面組合使用以提高治療效力。

iv.藥盒和診斷

在本發(fā)明的多個方面中，預(yù)期包含診斷劑、治療劑和/或其他治療劑和遞送劑的藥盒(kit)。在一些實施方案中，本發(fā)明考慮用于制備和/或施用本發(fā)明治療的藥盒。藥盒可包含能夠用于施用本發(fā)明的活性劑或有效劑的試劑。藥盒的試劑可包含至少一種基因表達(dá)的抑制劑，組合治療的一種或更多種抗癌組分，以及用于制備、配制和/或施用本發(fā)明的組分或者實施本發(fā)明方法的一個或更多個步驟的試劑。

在一些實施方案中，藥盒還可包含合適的容器設(shè)備，其是不與藥盒的組分起反應(yīng)的容器，例如eppendorf管、測定板、注射器、瓶或管。容器可以由可滅菌材料(例如塑料或玻璃)制成。

藥盒還可包含概述方法之程序步驟的說明書，其將遵循與本文中所述基本上相同的程序或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的程序。

v.實施例

包括以下實施例以說明本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以下實施例中公開的技術(shù)表示發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實踐中運行良好的技術(shù)，并因此可認(rèn)為構(gòu)成用于其實施的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對所公開的具體實施方案中進(jìn)行許多改變，并且仍然獲得相似或類似的結(jié)果。

材料和方法

材料。識別pgk1、pgk138-qrikaa-43、磷酸-pgk1s203、pdhk1、磷酸-pdhk1t338、磷酸-pdhk1y243、egfr、磷酸-egfry1172和ha的兔多克隆抗體獲自signalwayantibody(collegepark，maryland)。魚藤酮，識別pgk1、pdhk1、coxiv、timm22、v5、pdhe1α、pdhe1αps293的兔多克隆抗體以及識別具有天然構(gòu)象的兔igg的小鼠單克隆抗體獲自abcam(cambridge，ma)。識別mapk/apk2、mapk/apk2pt222、c-jun和c-junps73的兔多克隆抗體購自cellsignalingtechnology(danvers，ma)。識別hif1α、細(xì)胞色素c和磷酸絲氨酸的小鼠抗體獲自bdbiosciences(bedford，ma)。針對gst、微管蛋白、erk1/2、perk1/2、pin1和磷酸-蘇氨酸的單克隆抗體購自santacruzbiotechnology(santacruz，ca)?；钚愿视腿?-磷酸脫氫酶(gapdh)重組蛋白、flag的小鼠單克隆抗體、tritonx-100、α-胰凝乳蛋白酶、甘油醛3-磷酸、氯化鋰、丙酮酸、蘋果酸、egta、atpase、egf、二氯乙酸鹽(dca)、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、adp、nadh和nad⁺購自sigma(st.louis，mo)。識別mnsod和tom20的兔多克隆抗體、u0126、sp600125、sb203580、ag1478、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素和無dnase的rnasea購自emdbiosciences(sandiego，ca)。蛋白酶k和mitotrackerredcmxros購自invitrogen(carlsbad，california)。針對tom20和ki67的單克隆抗體購自millipore(sandiego，ca)。hyfect轉(zhuǎn)染試劑來自denvillescientific(metuchen，nj)。純化的his-pdhe1α重組蛋白質(zhì)來自signalchem(richmond，canada)。免疫金標(biāo)記的抗兔二抗購自tedpella(redding，ca)。含有s203/p204基序的pgk1的合成磷酸化的(hhhhhhlepsper-pna；seqidno：1)和非磷酸化的(hhhhhhlesper-pna[seqidno：1]和hhhhhhledper-pna[seqidno：2])寡肽購自selleckchemicals(houston，tx)。[γ³²p]atp購自mpbiochemicals(santaana，ca)。[1-¹⁴c]-丙酮酸購自americanradiolabeledchemicals(st.louis，mo)。dapi、alexafluor488山羊抗兔抗體、海胺氫氧化物(hyaminehydroxide)、閃爍管和靶向hif1α的sirna購自thermofisherscientific(pittsburgh，pa)。鏈霉親和素珠購自pierce(rockford，il)。

細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)條件。將u87、u87/egfr和u251人gbm細(xì)胞、bxpc-3人胰腺癌細(xì)胞、chl1人黑素瘤細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryofibroblast，mef)維持在不含丙酮酸的補(bǔ)充有10％經(jīng)透析的小牛血清(hyclone，logan，ut)的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)中。將人原代gsc11gbm細(xì)胞維持在補(bǔ)充有b27(invitrogen，carlsbad，california)、表皮生長因子(10ng/ml)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(10ng/ml)的dmem/f-1250/50中。細(xì)胞在正常氧(20％氧氣)或缺氧(1％氧氣)的條件下培養(yǎng)。對于egf處理，通過使細(xì)胞培養(yǎng)物生長至匯合而使其靜止，并每天用含有0.5％血清的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。使用終濃度為100ng/ml的egf進(jìn)行細(xì)胞刺激。

轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前18小時，以4×10⁵/60mm平皿的密度將細(xì)胞進(jìn)行平板接種。如前所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染(xia等，2007)。

亞細(xì)胞分級。使用來自biovision(mountainview，ca)的線粒體/胞質(zhì)溶膠分級試劑盒來分離線粒體級分和胞質(zhì)溶膠級分。線粒體蛋白質(zhì)和胞質(zhì)溶膠蛋白質(zhì)用于免疫印跡分析。對于蛋白酶k保護(hù)測定，使線粒體沉淀重懸于低張緩沖液(10mmhepes-koh[ph7.4]和1mmedta)中，并用含有或不含1％tritonx-100或毛地黃皂苷(100μm)的蛋白酶k(200mg/ml)在冰上消化20分鐘。然后將消化物用三氯乙酸沉淀，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)和免疫印跡進(jìn)行分析。如先前所述進(jìn)行線粒體亞分級(subfractionation)(she等，2011)。簡言之，將經(jīng)分離的線粒體重懸于10μmkh2po4(ph7.4)中在冰上保持20分鐘。添加等體積的等滲溶液(32％蔗糖、30％甘油、10mmmgcl2)，并在10,000g和4℃下離心10分鐘。將上清液在15,000g和4℃下離心1小時；沉淀和上清液分別含有外膜蛋白質(zhì)和膜間隙蛋白質(zhì)。然后，將來自第一次離心的沉淀重懸于10μmkh2po4(ph7.4)中在冰上保持20分鐘，添加等滲溶液，然后在15,000g和4℃下離心1小時；沉淀和上清液分別含有內(nèi)膜蛋白質(zhì)和基質(zhì)蛋白。

線粒體[1-¹⁴c]-丙酮酸轉(zhuǎn)化測定。按照先前所述(pezzato等，2009)并稍加修改進(jìn)行[1-¹⁴c]-丙酮酸轉(zhuǎn)化測定。簡言之，使用分離的線粒體(1mg)在1ml含有[1-¹⁴c]-丙酮酸(0.1μci/ml)的線粒體重懸緩沖液(200mm蔗糖、10mmhepes[ph7.4]、5mm蘋果酸、2mm磷酸二氫鈉、2mmadp、1mmegta)中測量通過pdh復(fù)合物的¹⁴co2產(chǎn)生。將2mleppendorf管中的孵育混合物置于帶有箔襯里螺帽的20ml閃爍管的底部并維持?jǐn)嚢?。孵育期間產(chǎn)生的¹⁴co2在閃爍管的底部被1ml海胺氫氧化物捕獲。將反應(yīng)混合物從閃爍管中移出并用0.5ml的50％三氯乙酸封閉1小時。然后，向每個閃爍管中添加19ml閃爍液(scintillatorliquid)，并在閃爍計數(shù)器上測量放射性。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，基于通過bradford測定法測量的線粒體蛋白質(zhì)水平將結(jié)果歸一化。

免疫金透射電子顯微術(shù)。將固定的樣品在0.1m二甲砷酸鹽緩沖液中洗滌，并用0.1％微孔過濾緩沖的單寧酸進(jìn)行處理，隨后用1％緩沖的四氧化鋨固定30分鐘，并用1％微孔過濾的乙酸雙氧鈾(uranylacetate)整體(enbloc)染色。將樣品在水中洗滌若干次，在濃度遞增的乙醇中進(jìn)行脫水，浸潤并包埋在lx-112培養(yǎng)基(laddresearch，williston，vt)中。使樣品在60℃烘箱中聚合2天。用leicaultracut切片機(jī)(deerfield，il)切割超薄切片，在leicaem染色機(jī)中用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用jem1010透射電子顯微鏡(jeol，usa，inc.，peabody，ma)在80kv的加速電壓下檢查。使用先進(jìn)顯微技術(shù)成像系統(tǒng)(advancedmicroscopytechniquesimagingsystem)(danvers，ma)獲得數(shù)字圖像。

體外異構(gòu)化測定。用通過異構(gòu)體特異性蛋白質(zhì)水解測定的順式肽含量顯示異構(gòu)化速率。通過將肽與α-胰凝乳蛋白酶在0℃下孵育2分鐘以完全水解4-硝基苯胺鍵處的反式異構(gòu)體以獲得純的順式肽來制備順式肽。使純的順式肽保持重新平衡。隨著異構(gòu)化的進(jìn)行，在指定的時間取出等分試樣。添加胰凝乳蛋白酶抑制劑(chymostatin)以滅活胰凝乳蛋白酶。在390nm處測量釋放的4-硝基苯胺的吸光度。

ros的測量。將收獲的細(xì)胞在td緩沖液(25mmtris[ph7.4]、5mmkcl、400μmna2hpo4和150mmnacl)中洗滌，然后在37℃下，在含有5mmmitosox(紅色線粒體超氧化物指示劑)(invitrogen，m36008)的td緩沖液中重懸15分鐘。用td緩沖液進(jìn)一步洗滌后，將細(xì)胞在96孔板上進(jìn)行平板接種，并且用synergyht微孔板讀數(shù)器(biotek，winooski，vt)在485/590nm處進(jìn)行測量。將重懸的分離的線粒體在含有不同濃度的丙酮酸的緩沖液(200mm蔗糖、10mmhepes[ph7.4]、5mm蘋果酸、2mm磷酸二氫鈉、2mmadp、1mmegta)中在20℃下孵育30分鐘。根據(jù)對所收獲細(xì)胞的描述進(jìn)行線粒體ros的測量。

線粒體膜電位的測量。將分離的線粒體(1mg)在含有不同濃度的丙酮酸的重懸緩沖液(200mm蔗糖、10mmhepes[ph7.4]、5mm蘋果酸、2mm磷酸二氫鈉、2mmadp、1mmegta)中在20℃下孵育30分鐘。使用線粒體膜電位測定試劑盒(abcam，cambridge，ma)測量線粒體膜電位。

乳酸產(chǎn)生的測量。將細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，6小時后用無血清dmem更換培養(yǎng)基。將細(xì)胞孵育6小時，然后收集培養(yǎng)基用于測量乳酸濃度。使用biovision乳酸測定試劑盒(biovision，milpitas，ca)來確定乳酸水平。

胞質(zhì)溶膠丙酮酸和線粒體乙酰輔酶a濃度的測量。將細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中并在正常氧或缺氧期間培養(yǎng)6小時。通過使用丙酮酸比色測定試劑盒(biovision)和乙酰輔酶a熒光測定試劑盒(biovision)分別測量胞質(zhì)溶膠丙酮酸和線粒體乙酰輔酶a的濃度。

pgk1活性的測量。在96孔板中，將經(jīng)純化的重組wt或突變體pgk1(1ng)在100μl反應(yīng)緩沖液(5mmkh2po4、ph7.0、1mmgap、0.3mmβ-nad、0.2mmadp、5mmmgso4、100mm甘氨酸、5ng/μlgapdh)中在25℃下孵育，并且在動力學(xué)模式下在339nm讀取5分鐘。

質(zhì)譜分析。用200ng測序級改良的胰蛋白酶(promega，madison，wi)將經(jīng)純化的pdhk1的體外pgk1磷酸化的樣品在含有rapigest(waterscorp.，milford，ma)的50mm碳酸氫銨緩沖液中在凝膠中于37℃下消化過夜。在obitrap-elite質(zhì)譜儀(thermofisherscientific，waltham，ma)上通過lc-ms/ms分析消化物。通過proteomediscoverersoftwarev.1.4(thermofisherscientific)，使用mascotserverv.2.3(matrixscience，london，uk)和sequestv.1.27(universityofwashington，seattle，wa)，通過針對swissprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ebi)的片段譜的數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定蛋白質(zhì)。通過使用在proteomediscoverer中執(zhí)行的phosphors算法來分析磷酸肽匹配并進(jìn)行人工驗證(curated)(taus等，2011)。

免疫沉淀和免疫印跡分析。用改良的緩沖液從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，隨后如先前所述用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡(lu等，1998)。

鏈霉親和素和gst拉下測定。將鏈霉親和素或谷胱甘肽瓊脂糖珠與細(xì)胞裂解物(1mg/ml)或經(jīng)純化的蛋白質(zhì)孵育12小時。將所述珠用裂解物緩沖液洗滌三次。

細(xì)胞增殖測定。在缺氧期間將共計2×10⁵個細(xì)胞平板接種并在接種至具有10％經(jīng)透析的小牛血清的dmem中之后4天進(jìn)行計數(shù)。數(shù)據(jù)表示3個獨立實驗的平均值±sd。

dna構(gòu)建體和誘變。將聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)擴(kuò)增的人pgk1、tom20、pdhk1、pdhk2、pdhk3、pdhk4、k-rasg12v或b-rafv600e克隆至pcoldi、pgex-4t-1、pe-sumo、pcdna6/hisv5或pcdna6/sfb載體。pcdna6/hisv5pdhk1t338a、pe-sumopdhk1t338a、pgex-4t-1pgk1s203a、pgex-4t-1pgk1s203d、pgex-4t-1pgk1r39/k41a、pgex-4t-1pgk1s203dr39/k41a、pcoldipgk1s203a、pcoldipgk1s203d、pcoldipgk1t378p、pcoldipgk1r39/k41a、pcdna6/hisv5pgk1s203a、pcdna6/hisv5pgk1s203d、pcdna6/hisv5pgk1t378p、pcdna6/hisv5pgk1r39/k41a、pcdna6/hisv5pgk1k48a、pcdna6/sfbpgk1r39/k41a、pcdna6/sfbpgk1k48a、pcdna6/sfbpgk1v81/83a、pcdna6/sfbpgk1v177/179a和pcdna6/sfbpgk1v278a/i280r/l282r通過使用quickchange定點誘變試劑盒(stratagene，lajolla，ca)來制備。pcdna6/hisv5rpgk1含有c652g、t655c、c658g和t661c的無義突變。pcdna6/hisv5rpdhk1含有c848t、a850g、a853g、c854t和t856g的無義突變。

用對照寡核苷酸gcttctaacaccggaggtctt(seqidno：3)形成pgipz對照。分別用ggatgtctatgtcaatgatgc(seqidno：4)和ccgaactagaacttgaaga(seqidno：5)形成pgipzpgk1shrna和pdhk1shrna。

重組蛋白質(zhì)的純化。如先前所述使wt和突變體his-pgk1、gst-pgk1、his-tom20、his-pin1、gst-pin1和sumo-pdhk1在細(xì)菌中表達(dá)并純化(xia等，2007)。

體外激酶測定和磷酸氨基酸分析(paa)。如先前所述進(jìn)行激酶反應(yīng)(fang等，2007)。簡言之，將經(jīng)細(xì)菌純化的重組pgk1(10ng)與pdhk1(100ng)在25μl激酶緩沖液(50mmtris-hcl[ph7.5]、100mmkcl、50mmmgcl2、1mmna3vo4、1mmdtt、5％甘油、0.5mmatp和10μci[γ³²p]atp)中在25℃下孵育1小時。對于使用1，3-二磷酸甘油酸酯(1，3-bpg)作為磷酸供體的測定，將活性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(200ng)與pgk1(100ng)和pdhk1(100ng)在25μl反應(yīng)緩沖液(5mmkh2po4[ph7.0]、1mmgap、0.3mmβ-nad、5mmmgso4、100mm甘氨酸、1mmna3vo4、1mmdtt)中在25℃下孵育1小時。通過添加sds-page加樣緩沖液終止反應(yīng)并加熱至100℃。然后使反應(yīng)混合物進(jìn)行sds-page分析。

對于paa，通過sds-page來分離激酶反應(yīng)混合物，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并切除與磷酸化的pdhk1的移動性一致的膜。如先前所述進(jìn)行在薄層纖維素板上使用二維電泳的paa(vandergeer和hunter，1994)。

免疫熒光分析。如先前所述進(jìn)行免疫熒光分析(fang等，2007)。

分子建模分析。使用在線zdock服務(wù)器(在萬維網(wǎng)網(wǎng)址zdock.umassmed.edu/上)進(jìn)行pgk1和pin1蛋白質(zhì)的分子對接分析。選擇pgk1的s203和pin1(k63和r69)的ww結(jié)構(gòu)域用于對接。

丙酮酸氧化速率的測量。將在具有補(bǔ)充有10％bcs、20mmhepes、5mm葡萄糖和1mm丙酮酸的不含碳酸氫鈉的dmem的25-cm²斜頸培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的u87細(xì)胞(2×10⁶)不進(jìn)行缺氧處理或缺氧處理6小時，然后添加0.2μci的[1-¹⁴c]-丙酮酸(americanradiolabeledchemicals)。用浸泡在海胺氫氧化物中的濾紙覆蓋燒瓶的出口，并在37℃下孵育2小時。移除濾紙，并使用ls6500多功能閃爍計數(shù)器(beckmancounter)測定放射性。丙酮酸氧化速率表示為歸一化為細(xì)胞數(shù)目的樣品的放射性水平。對于egf處理，將在補(bǔ)充有0.5％bcs、20mmhepes、5mm葡萄糖、1mm丙酮酸的不含碳酸氫鈉的dmem的25-cm²斜頸培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的2×10⁶個u87/egfr細(xì)胞不用egf處理或用egf(100ng/ml)處理6小時，然后添加0.2μci的[1-¹⁴c]-丙酮酸。

氧消耗速率的測量。將細(xì)胞(3×10⁴)平板接種到dmem(0.5％bcs、25mm葡萄糖、2mm谷氨酰胺)(seahorsebioscience，northbillerica，ma)中的xf24板上，并在37℃、5％co2下孵育過夜，用5mm二氯乙酸鹽預(yù)處理1小時，并隨后用egf(100ng/ml)刺激6小時或不用egf刺激。然后用補(bǔ)充有2mm谷氨酰胺、25mm葡萄糖(使用0.5mm氫氧化鈉將ph調(diào)節(jié)至7.4)的675μl未緩沖的測定培養(yǎng)基(seahorsebioscience)替換該培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞置于37℃的無co2的培養(yǎng)箱中30分鐘。使用xf24板讀數(shù)器記錄基礎(chǔ)氧消耗速率(basaloxygen-consumptionrate，ocr)。計算線粒體ocr(δocr值為1μm的魚藤酮處理前后的ocr差異)，并用細(xì)胞數(shù)目歸一化。

¹⁴c-脂質(zhì)合成測定。測量來源于¹⁴c-葡萄糖或¹⁴c-谷氨酰胺的¹⁴c-脂質(zhì)。將接種在6孔板上的半?yún)R合(subconfluent)細(xì)胞與egf(100ng/ml)預(yù)孵育24小時或不與其預(yù)孵育。然后將這些細(xì)胞在含有1μci的d-[6-¹⁴c]-葡萄糖(americanradiolabeledchemicals)或l-[u-¹⁴c]-谷氨酰胺(perkinelmer)的新鮮培養(yǎng)基中孵育2小時，然后進(jìn)行pbs洗滌。通過添加500μl己烷∶異丙醇(3∶2v/v)提取脂質(zhì)。將細(xì)胞與另外500μl己烷∶異丙醇溶液一起孵育。合并脂質(zhì)提取物并加熱空氣干燥。將提取的脂質(zhì)重懸于50μl氯仿中并進(jìn)行閃爍計數(shù)。用細(xì)胞數(shù)目將閃爍計數(shù)歸一化。

確定pgk1的km。將經(jīng)純化的重組wtpgk1(0.2ng)在100μl具有指定atp濃度的反應(yīng)緩沖液(50mmtris-hcl[ph7.5]、600ng/μlsumo-pdhk1、5mmmgso4、1mmna3vo4、1mmdtt、1.8mm磷酸烯醇丙酮酸、7單位丙酮酸激酶、10單位乳酸脫氫酶、0.01mmnadh)中在96孔板中于37℃下孵育，并且通過多重檢測微板讀數(shù)器(bmglabtech，cary，nc)在動力學(xué)模式下在339nm處讀取5分鐘。通過測量作為時間之函數(shù)的產(chǎn)物濃度來獲得反應(yīng)速度(v)。根據(jù)lineweaver-burke繪圖模型，由1/v相對于1/[atp]的圖計算km。數(shù)據(jù)表示3個獨立實驗的平均值±sd。

線粒體基質(zhì)中atp濃度的測量。將經(jīng)分離的線粒體(2mg)在洗滌緩沖液(200mm蔗糖、10mmhepes[ph7.4]、100μm毛地黃皂苷)中洗滌，并隨后在100μl測定緩沖液中裂解。使用10kda的離心柱(millipore)將樣品脫蛋白，并使用biovisionatp測定試劑盒(biovision)測定atp水平。

顱內(nèi)注射。將具有內(nèi)源性pgk1或pdhk1耗竭及其wt或突變體蛋白質(zhì)的重建表達(dá)的gbm細(xì)胞經(jīng)顱內(nèi)注射(5μldmem中1×10⁶個細(xì)胞/小鼠)到4周齡的雌性無胸腺裸小鼠中。如先前所述進(jìn)行注射(gomez-manzano等，2006)。在每個實驗中，每組使用7只小鼠。注射有u87或gsc11細(xì)胞的動物分別在注射膠質(zhì)瘤細(xì)胞之后28或21天處死。獲得每只小鼠的腦，固定在4％甲醛中，并包埋在石蠟中。通過h&e染色切片的組織學(xué)分析來確定腫瘤形成和表型。根據(jù)相關(guān)制度和國家指導(dǎo)方針和條例對動物進(jìn)行處理。動物的使用經(jīng)德克薩斯大學(xué)md安德森癌癥中心機(jī)構(gòu)審查委員會(institutionalreviewboardattheuniversityoftexasmdandersoncancercenter)批準(zhǔn)。

組織學(xué)評價和免疫組織化學(xué)染色。將小鼠腫瘤組織固定并準(zhǔn)備用于染色。用mayer的蘇木精以及隨后用曙紅(h&e)(biogenexlaboratories，sanramon，ca)對標(biāo)本進(jìn)行染色。此后，使用universalmount(researchgeneticshuntsville，al)固封載玻片。

用針對磷酸pgk1s203、磷酸pdhk1t338、磷酸pdhs293的抗體或非特異性igg作為陰性對照對來自石蠟包埋的人gbm標(biāo)本的組織切片進(jìn)行染色。如先前所定義的，根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度對組織切片定量評分(ji等，2009)。指定以下比例分?jǐn)?shù)：如果0％的腫瘤細(xì)胞顯示陽性染色則為0，如果0％至1％則為1，如果2％至10％則為2，如果11％至30％則為3，如果31％至70％則為4，如果71％至100％則為5。以0至3的等級評定染色強(qiáng)度：0，陰性；1，弱；2，中等；以及3，強(qiáng)。如先前所述，將比例和強(qiáng)度評分合并得到總評分(范圍，0至8)(ji等，2009)。將評分與總存活(定義為從診斷日期至死亡或最后一次已知的隨訪日期的時間)進(jìn)行比較。所有患者在手術(shù)后接受標(biāo)準(zhǔn)輔助性放射治療，隨后用烷化劑(多數(shù)情況下為替莫唑胺)進(jìn)行治療。人腦腫瘤標(biāo)本和數(shù)據(jù)庫的使用經(jīng)德克薩斯大學(xué)md安德森癌癥中心機(jī)構(gòu)審查委員會(institutionalreviewboardattheuniversityoftexasmdandersoncancercenter)批準(zhǔn)。

tunel測定。小鼠腫瘤組織被切成5μm厚度。根據(jù)制造商的說明書，通過使用deadend^tmtunelsystems(promega，madison，wi)來檢測凋亡細(xì)胞。

實施例1-通過erk1/2依賴性pgk1s203磷酸化介導(dǎo)缺氧以及egfr、k-ras和b-raf的活化誘導(dǎo)的pgk1線粒體易位

在實體瘤中，缺氧似乎與腫瘤生長和發(fā)展密切相關(guān)(koppenol等，2011；hockel和vaupel，2001；caims等，2011)。為了測試糖酵解途徑中的atp生成酶pgk1是否具有任何亞細(xì)胞區(qū)室依賴性功能，將細(xì)胞暴露于缺氧環(huán)境并檢測pgk1的細(xì)胞分布。將u87人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(gbm)細(xì)胞在缺氧條件下孵育6小時(圖1a)。用抗pgk1抗體進(jìn)行的免疫熒光分析顯示缺氧誘導(dǎo)pgk1的細(xì)胞核周圍積累。因為線粒體也定位在細(xì)胞核周圍區(qū)域，所以細(xì)胞與抗pgk1抗體和熒光線粒體染料mitotracker共染色。如圖1a所示，pgk1與線粒體共定位，表明在缺氧刺激后pgk1易位至線粒體。這一發(fā)現(xiàn)得到了包括線粒體標(biāo)志物coxiv和作為對照的胞質(zhì)溶膠微管蛋白的細(xì)胞分級分析的支持，這顯示導(dǎo)致hif1α積累(圖9a，左圖)的缺氧在u87和u251gbm細(xì)胞二者中均誘導(dǎo)pgk1線粒體易位(圖9a，右圖)。定量分析顯示，約10％的胞質(zhì)溶膠pgk1易位至線粒體(圖9b)。因為延長的缺氧刺激增強(qiáng)了由hif1α介導(dǎo)的pgk1表達(dá)(marin-hernandez等，2009；semenza，2010)，下一步將檢驗pgk1是否以hif1α依賴的方式易位至線粒體。通過sirna的hif1α耗竭不阻斷缺氧誘導(dǎo)的pgk1線粒體易位，表明該過程的發(fā)生獨立于hif1α(圖9c)。

為了確定pgk1是否與線粒體的外膜結(jié)合或與易位至其中，使用從經(jīng)缺氧刺激或未經(jīng)缺氧刺激的u87和u251細(xì)胞分離的線粒體進(jìn)行蛋白酶k保護(hù)測定。包括外膜標(biāo)志物tom20和線粒體內(nèi)標(biāo)志物coxiv在內(nèi)作為對照(hitosugi等，2011)。在不存在tritonx-100(其使線粒體的外膜和內(nèi)膜增溶)的情況下，tom20(而非pgk1和coxiv)被蛋白酶k處理完全消化，而tritonx-100的存在使得pgk1和coxiv能進(jìn)行蛋白酶k消化(圖9d)。相比之下，短暫的毛地黃皂苷處理(其損傷線粒體的外膜，但不損傷內(nèi)膜)對線粒體pgk1進(jìn)行蛋白酶k消化的可及性的影響有限(圖9e)。此外，線粒體亞分級顯示pgk1與線粒體基質(zhì)蛋白mnsod共分離，但不與內(nèi)膜蛋白質(zhì)timm22和膜間隙蛋白質(zhì)細(xì)胞色素c共分離(圖1b)，表明pgk1易位至線粒體基質(zhì)中。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步得到免疫金透射電子顯微術(shù)分析的支持，這表明缺氧誘導(dǎo)pgk1易位至線粒體中(圖1c)。

map激酶活化在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞活性中發(fā)揮工具性作用(kronblad等，2005；wykosky等，2011；riley等，1986)。用jnk抑制劑sp600125、p38抑制劑sb203580或mek/erk抑制劑u0126預(yù)處理u87細(xì)胞分別阻斷缺氧誘導(dǎo)的c-jun、mapk/apk2和erk1/2的磷酸化(圖10a)。免疫印跡分析顯示，只有mek/erk抑制顯著降低u87(圖1d)和u251細(xì)胞(圖10b)中缺氧誘導(dǎo)的pgk1線粒體易位。這些結(jié)果得到免疫熒光分析的結(jié)果的支持(圖10c)。此外，flag-erk2k52r激酶失活突變體的表達(dá)阻斷缺氧(圖10d)和活性ha-mek1q56p突變體(圖10e)誘導(dǎo)的pgk1線粒體易位。因此，erk1/2活化對pgk1線粒體易位是必要和充分的。與該結(jié)論一致，egf刺激(圖1e)或癌基因k-rasg12v在bxpc-3人胰腺癌細(xì)胞(無內(nèi)源性ras突變)中的表達(dá)以及b-rafv600e在chl1人黑素瘤細(xì)胞(無內(nèi)源性b-raf突變)中的表達(dá)(flockhart等，2009；yun等，2009)(圖1f)誘導(dǎo)pgk1線粒體易位；值得注意的是，這種易位被u0126處理或erk2k52r激酶失活突變體的表達(dá)阻斷。

為了檢驗erk1/2是否與pgk1相互作用，用抗erk1/2抗體進(jìn)行免疫沉淀的pgk1的免疫印跡分析，并顯示缺氧刺激后erk1/2與pgk1締合(圖10f)。此外，用經(jīng)純化的重組活性his-erk2與gst-pgk1孵育的體外gst拉下測定顯示這兩種蛋白質(zhì)彼此直接相互作用(圖10g)。

由共同對接(commondocking，cd)結(jié)構(gòu)域和谷氨酸/天冬氨酸(ed)位點組成的map激酶的對接槽(dockinggroove)用作多種map激酶相互作用分子的共同對接區(qū)域(lu和xu，2006)。cd結(jié)構(gòu)域中的d316和d319以及erk2的ed位點中的t157和t158對于其底物的識別是重要的(lu和xu，2006)。免疫共沉淀測定顯示內(nèi)源性pgk1與flag-erk2d316/d319n和flag-erk2t157/t158e的結(jié)合大幅降低，并且完全無法與具有cd結(jié)構(gòu)域和ed位點的組合突變的erk2突變體相互作用(圖10h)。這些結(jié)果表明pgk1與erk2對接槽結(jié)合。

erk底物通常具有對接結(jié)構(gòu)域，其特征在于一串堿性殘基，隨后是lxl基序(l表示亮氨酸，但也可以是異亮氨酸或纈氨酸；x表示任何氨基酸)(yang等，2012)。用scansite程序分析pgk1氨基酸序列鑒定該推定的erk結(jié)合序列74-dkyslepvave-84(seqidno：6)、170-hrahssmvgvn-180(seqidno：7)和273-aekngvkitlp-283(seqidno：8)，其在v81/v83、v177/v179和v278/i280/l282分別包含lxl基序。s-flag-biotin(sfb)-pgk1蛋白的鏈霉親和素拉下表明僅pgk1v278a/i280r/l282r突變顯著降低其與erk1/2的結(jié)合(圖10i)。這些結(jié)果表明erk2對接槽在v278/i280/l282處與pgk1中的對接結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

為了確定pgk1是否是erk1/2的底物，進(jìn)行了體外激酶測定，顯示經(jīng)純化和活性的erk2使經(jīng)細(xì)菌純化的pgk1磷酸化(圖1g)。erk1/2使其具有p-x-s/tp(其中x可以是任何氨基酸)共有序列的底物磷酸化(ji等，2009)。pgk1氨基酸序列的分析顯示pgk1僅具有一個erk1/2磷酸化基序，其在s203處。如通過放射自顯影測定和使用特異性抗pgk1ps203抗體的免疫印跡分析證實(圖1g)，s203至ala的突變在體外用[γ³²p]-atp消除erk2介導(dǎo)的pgk1磷酸化。免疫熒光分析顯示缺氧刺激導(dǎo)致線粒體中磷酸化pgk1s203的積累(圖11a)。此外，sfb標(biāo)記的野生型(wt)pgk1和pgk1s203a被鏈霉親和素瓊脂糖珠拉下表明，u0126處理和pgk1s203a突變(圖1h)而非sp600125處理(圖11b)，消除了u87細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)的pgk1s203磷酸化。與這些發(fā)現(xiàn)一致，erk2k52r激酶失活突變體的表達(dá)阻斷活性mek1q56p誘導(dǎo)的pgk1s203磷酸化(圖11c)。值得注意的是，pgk1s203a對缺氧誘導(dǎo)的線粒體易位有抗性(圖1i和11d)。相比之下，磷酸化-模擬pgk1s203d突變體能夠在不存在缺氧刺激下在線粒體中積累(圖1i和11d)，表明erk1/2介導(dǎo)的pgk1在s203處的磷酸化對于pgk1線粒體易位是必需的。使用抗磷酸pgk1s203抗體對具有或不具有免疫耗竭(immune-depletion)的胞質(zhì)溶膠pgk1的定量顯示，磷酸化pgk1的耗竭僅去除了總pgk1蛋白的約10％(圖11e)，這進(jìn)一步支持了僅小部分的pgk1易位至線粒體的發(fā)現(xiàn)。

缺氧導(dǎo)致egfr活化(michelson等，1985)。用egfr抑制劑ag1478處理阻斷了缺氧誘導(dǎo)的egfr磷酸化(圖11f)、erk活化以及pgk1的磷酸化和線粒體易位(圖11g)。這些結(jié)果表明缺氧通過活化egfr來誘導(dǎo)erk活化和pgk1線粒體易位。與這一發(fā)現(xiàn)一致，也觀察到egf誘導(dǎo)的pgk1s203磷酸化(圖11h)以及s203磷酸化依賴性pgk1線粒體易位(圖11i)。此外，erkk52r的表達(dá)阻斷了k-rasg12v和b-rafv600e誘導(dǎo)的pgk1s203磷酸化(圖11j)。這些發(fā)現(xiàn)表明缺氧、egfr的活化以及致癌性k-ras和b-raf的表達(dá)誘導(dǎo)erk依賴性磷酸化和pgk1線粒體易位。

實施例2-pin1與磷酸化pgk1結(jié)合并使其順-反異構(gòu)化用于pgk1線粒體易位

erk-磷酸化的ps/tp-肽序列中的ser或thr可被肽基脯氨酸異構(gòu)酶(與有絲分裂a(bǔ)1中的never相互作用的蛋白(proteininteractingwithneverinmitosisa1)(pin1)，其催化其順-反異構(gòu)化(lu和zhou，2007；zheng等，2009))識別。pin1調(diào)節(jié)其底物的亞細(xì)胞再分布(yang等，2012)。確定erk調(diào)節(jié)的pgk1磷酸化是否導(dǎo)致pgk1的pin1依賴性構(gòu)象變化以及隨后的pgk1線粒體易位。免疫共沉淀分析顯示，缺氧刺激顯著提高內(nèi)源性pin1與pgk1之間的相互作用，其被u0126處理阻斷(圖2a)。此外，缺氧刺激誘導(dǎo)內(nèi)源性pgk1與瓊脂糖珠固定化的wtgst-pin1而非gst-pin1ww結(jié)構(gòu)域突變體牢固結(jié)合，其防止pin1與ps/tp底物結(jié)合(圖2b)。與其wt對應(yīng)物相比，pgk1s203a無法與gst-pin1相互作用(圖2c)。pgk1和pin1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子建模分析顯示，pgk1的s203可鄰近ww結(jié)構(gòu)域中的k63和r69磷酸結(jié)合口袋(phosphobindingpocket)(圖12a)(michelson等，1985；yaffe等，1997)，表明pin1ww結(jié)構(gòu)域能夠與磷酸化的s203p結(jié)合。通過體外結(jié)合測定證實erk1/2需要pin1和pgk1之間相互作用，其顯示經(jīng)純化的his-pgk1僅在erk2和atp的存在下與經(jīng)純化的wtgst-pin1而非gst-pin1ww突變體結(jié)合(圖2d)。此外，經(jīng)純化的pgk1s203d而非pgk1s203a能夠在沒有缺氧刺激的情況下(圖2f)拉下u87細(xì)胞中的經(jīng)純化的gst-pin1(圖2e)或內(nèi)源性pin1。

為了進(jìn)一步檢驗pgk1的磷酸化s203/p204基序是否是pin1的底物，合成了含有磷酸化或非磷酸化s203/p204的pgk1寡肽。wtgst-pin1(而非無催化活性的gst-pin1c113a突變體)使磷酸化的s203/p204肽(圖2g，左圖)而非其非磷酸化的對應(yīng)物(圖2g，右圖)異構(gòu)化。此外，gst-pin1使磷酸化-模擬d203/p204肽異構(gòu)化，其以較磷酸化s203/p204肽更低的效率、但較非磷酸化的肽更高的效率發(fā)生(圖2g，左圖)。與該發(fā)現(xiàn)一致，his標(biāo)記的磷酸化-模擬d203/p204肽以比磷酸化肽更低的效率、但以比其非磷酸化的對應(yīng)物更高的親和力與gst-pin1結(jié)合(圖12b)。細(xì)胞級分分析顯示，約15％的pgk1s203d易位至線粒體中(圖12c)，這可反映了pgk1s203d.p204被pin1異構(gòu)化的效率低以及用于pgk1結(jié)合的可用pin1的量有限。這些結(jié)果表明pin1特異性地使pgk1內(nèi)的磷酸化s203/p204異構(gòu)化。

為了確定pin1在pgk1線粒體易位中的作用，使用缺氧來刺激具有wtpin1或pin1c113a突變體(圖2h，左圖)的重建表達(dá)的pin1^+/+、pin1^+/-或pin1^-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。pin1缺乏完全阻斷了缺氧誘導(dǎo)的pgk1線粒體易位，而該阻斷通過wtpin1而非pin1c113a突變體的重新表達(dá)被挽救(圖2h，右圖)。此外，pin1缺乏阻斷磷酸化-模擬pgk1s203d突變體的線粒體易位，并通過wtpin1而非pin1c113a突變體的重建表達(dá)挽救pgk1s203d易位的失敗(圖2i)。這些結(jié)果表明erk1/2介導(dǎo)的pgk1磷酸化導(dǎo)致pin1與pgk1的結(jié)合，其進(jìn)而導(dǎo)致pgk1的順-反異構(gòu)化和隨后的線粒體易位。

實施例3-pin1調(diào)節(jié)pgk1與tom復(fù)合物的結(jié)合

幾乎所有的線粒體前體蛋白質(zhì)(pre-protein)都是通過一般入口進(jìn)入的，所述入口是外膜的移位酶(tom)。三種受體蛋白tom20、tom70和tom22作為tom復(fù)合物的一部分發(fā)揮作用。tom20充當(dāng)一般入口受體，并且是具有前序列(presequence)的底物的初始識別位點(chacinska等，2009)。前序列通常位于前體蛋白質(zhì)的氨基端并形成帶正電荷的兩親性α螺旋，是線粒體靶向信號的經(jīng)典類型(chacinska等，2009)。pgk1的結(jié)構(gòu)分析顯示其在n-端包含α-螺旋(第38至53位氨基酸)(圖13a)。免疫共沉淀分析顯示缺氧刺激導(dǎo)致pgk1與tom20之間的相互作用(圖3a)。pin1缺乏消除了這種相互作用，其通過wtpin1而非pin1c113a突變體的重建表達(dá)(圖3b)被挽救。此外，在pin1存在或不存在下，經(jīng)純化的wtgst-pgk1或gst-pgk1s203d突變體與經(jīng)純化的his-tom20的孵育顯示，在pin1存在(而非不存在)下，gst-pgk1s203d而非wtgst-pgk1能夠與tom20結(jié)合(圖3c)。這些結(jié)果表明，pin1是磷酸化pgk1與tom復(fù)合物結(jié)合所需要的。

為了確定pgk1線粒體易位所需的pgk1的前序列，使包含α-螺旋的n-末端的1至57個氨基酸缺失，并且將該蛋白質(zhì)在u87細(xì)胞中表達(dá)為c末端sfb標(biāo)記的蛋白質(zhì)。與其wt對應(yīng)物不同，sfb-pgk1δ1-57喪失了與tom20相互作用的能力(圖3d)。α螺旋中帶正電荷的r39、k41和k48突變?yōu)閍la，表明pgk1r39/k41a而非pgk1k48a消除了pgk1與tom20的相互作用(圖3e)，這有力地表明r39/k41是參與與tom復(fù)合物結(jié)合的pgk1殘基。值得注意的是，如通過免疫印跡和免疫熒光分析所證明的(圖3h)，缺氧刺激u87細(xì)胞后，pgk1δ1-57突變體(圖3f)和pgk1r39/k41a突變體(圖3g至h)都不能易位至線粒體中(圖3f至g)。在u251細(xì)胞中觀察到pgk1r39/k41a的相似結(jié)果(圖13b)。鑒于pgk1r39/k41未暴露在pgk1蛋白結(jié)構(gòu)的表面(圖13c)，這些結(jié)果有力地表明pgk1中ps203.p204結(jié)合的pin1依賴性順-反異構(gòu)化暴露了包含pgk1的r39/k41殘基(用于被tom復(fù)合物識別)的線粒體靶向信號。為了進(jìn)一步支持這一結(jié)論，將經(jīng)純化的gst-pgk1s203d突變體與經(jīng)純化的pin1進(jìn)行孵育或不與其進(jìn)行孵育用于異構(gòu)化，然后用識別38-qrikaa-43(seqidno：9)的特異性抗pgk1抗體進(jìn)行免疫沉淀。用抗gst抗體的免疫印跡分析顯示，針對38-qrikaa-43的抗pgk1抗體在pin1的存在下成功識別gst-pgk1s203d，但在pin1不存在下不識別(圖13d)。這些結(jié)果表明，pin1調(diào)節(jié)的pgk1的異構(gòu)化暴露了38-qrikaa-43殘基，使得其可被肽特異性抗體識別。

實施例4-線粒體pgk1使pdhk1磷酸化

缺氧增強(qiáng)糖酵解途徑，并且導(dǎo)致丙酮酸被轉(zhuǎn)化成乳酸而不是用于線粒體氧化(vanderheiden等，2009；semenza，2010)。如所預(yù)期，在分離的線粒體中，缺氧降低¹⁴c標(biāo)記的丙酮酸向¹⁴c標(biāo)記的co2的轉(zhuǎn)化速率(圖4a)。為了確定線粒體pgk1是否調(diào)節(jié)pdh復(fù)合物介導(dǎo)的丙酮酸轉(zhuǎn)化為co2的速率，用短發(fā)夾狀rna(shrna)耗竭pgk1，并且在u87和u251細(xì)胞中重建rna抗(r)干擾v5標(biāo)記的wtpgk1、rpgk1s203a或rpgk1r39/k41a的表達(dá)。pgk1耗竭顯著抵消了缺氧誘導(dǎo)的丙酮酸向co2轉(zhuǎn)化的抑制，并且通過在u87細(xì)胞中wtrpgk1而非rpgk1s203a或rpgk1r39/k41a的重建表達(dá)來挽救該抑制(圖4a和14a)。對于用[1-¹⁴c]-丙酮酸孵育的缺氧或egf刺激的細(xì)胞也獲得類似的結(jié)果(圖14b)。這些結(jié)果表明線粒體pgk1調(diào)節(jié)pdh復(fù)合物的活性。

與這一發(fā)現(xiàn)一致，用抗pdhk1抗體對來自u87細(xì)胞的線粒體免疫沉淀的pgk1的免疫印跡分析顯示缺氧誘導(dǎo)內(nèi)源性pgk1與pdhk1的相互作用(圖4b)。此外，鏈霉親和素拉下測定顯示，在缺氧刺激后sfb標(biāo)記的pdhk1而非pdhk2、pdhk3或pdhk4與內(nèi)源性pgk1相互作用(圖14c)。此外，將其中經(jīng)細(xì)菌純化的sumo標(biāo)記的pdhk1蛋白與經(jīng)純化并固定化的gst或gst-pgk1混合的體外結(jié)合測定顯示pgk1與pdhk1直接結(jié)合(圖4c)。這些結(jié)果表明缺氧導(dǎo)致pgk1與pdhk1之間的直接相互作用。

在糖酵解途徑中，pkm2和pgk1催化僅兩種生成atp的反應(yīng)。pgk1催化的1，3-bpg轉(zhuǎn)化為3-pg和atp是可逆反應(yīng)(bernstein和hol，1998)，使得pgk1也可利用atp作為磷酸供體。pkm2發(fā)揮蛋白激酶的功能(yang等，2012)。為了測試pgk1是否可充當(dāng)使pdhk1磷酸化的蛋白激酶，通過將經(jīng)細(xì)菌純化的pgk1、pdhk1和atp混合來進(jìn)行體外磷酸化測定。pdhk1的胰蛋白酶消化物的液相色譜耦聯(lián)orbitrap質(zhì)譜(lc-ms/ms)分析顯示pgk1在s337或t338處使pdhk1磷酸化(圖4d)。具有[γ³²p]-atp的磷酸氨基酸分析顯示pgk1主要在蘇氨酸處使pdhk1磷酸化(圖14d)，表明pdhk1t338被磷酸化。此外，wtpgk1而非pgk1t378p激酶失活突變體(chiarelli等，2012)能夠在[γ³²p]-atp存在下使wtpdhk1而非pdhk1t338a磷酸化，其通過放射自顯影術(shù)和特異性抗磷酸pdhk1t338抗體二者進(jìn)行檢測(圖4e)。相比之下，相鄰pdhk1s337a的突變對pgk1介導(dǎo)的pdhk1磷酸化沒有影響(圖14e)。這種磷酸化通過與過量的3-pg孵育而被消除(圖14f)，這表明pdhk1和3-pg彼此競爭被pgk1磷酸化。此外，在孵育經(jīng)純化的pgk1、pdhk1和1，3-bpg(其通過將甘油醛磷酸脫氫酶(gapdh)與甘油醛-3-磷酸和nad⁺孵育產(chǎn)生)后，pdhk1t338被磷酸化(圖14g)。這些結(jié)果表明，atp和1，3-bpg二者均可以是體外pdhk1磷酸化的磷酸供體。

為了鑒定用于pgk1介導(dǎo)的pdhk1磷酸化的生理磷酸供體，提取線粒體并且將線粒體裂解物與經(jīng)純化的pgk1在外源性atpase存在或不存在下混合。如圖14h所示，與水解線粒體atp的atpase孵育消除了pgk1介導(dǎo)的pdhk1t338磷酸化。這些結(jié)果有力地表明在線粒體中pgk1利用atp作為磷酸供體以使pdhk1磷酸化。鑒于用于pgk1依賴性pdhk磷酸化的atp的km(0.56±0.053mm)比u87和u251細(xì)胞中atp的生理線粒體濃度(在正常氧和缺氧條件下為2.5至3.5mm(圖14j))低得多(圖14i)，這些結(jié)果表明在線粒體中pgk1能夠利用atp高效地磷酸化pdhk1。

使用pdhk1pt338抗體從線粒體提取物中耗竭磷酸化pdhk1大幅降低了線粒體中pdhk1的量，這表明在缺氧刺激后，大部分pdhk1被線粒體中的pgk1磷酸化(圖14k)。為了確定細(xì)胞中pgk1是否磷酸化pdhk1，在具有或不具有wtrpgk1或rpgk1t378p催化失活突變體的重建表達(dá)的情況下，在具有pgk1shrna的u87和u251細(xì)胞中耗竭pgk1表達(dá)(圖14l)。線粒體級分分析顯示rpgk1的無活性突變體和wtrpgk1二者均能夠易位到線粒體中(圖14m)。免疫印跡分析顯示pgk1耗竭阻斷缺氧誘導(dǎo)的pdhk1t338磷酸化，其通過wtrpgk1而非rpgk1t378p的重建表達(dá)被挽救(圖14n)。此外，與其wt對應(yīng)物具有相當(dāng)糖酵解活性的rpgk1s203a的重建表達(dá)(圖14o)在缺氧條件下無法誘導(dǎo)pdhk1t338磷酸化(圖4f)。已知pdhk1通過fop2-成纖維細(xì)胞生長因子受體(fop2-fibroblastgrowthfactorreceptor，fgfr)1(致癌的可溶性的fgfr1融合蛋白)在酪氨酸殘基處被磷酸化(hitosugi等，2011)。與先前的發(fā)現(xiàn)(hitosugi等，2011)一致，在缺氧刺激后，由活化的fop2-fgfr介導(dǎo)的pdhk1y243磷酸化沒有改變(圖14p)。鑒于用pdhk1pt338抗體在線粒體中耗竭磷酸化的pdhk1大幅降低了線粒體中pdhk1的量，這些結(jié)果表明在缺氧期間fgfr不參與pdhk1的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明pgk1發(fā)揮蛋白激酶的作用，并在缺氧條件下使線粒體中的pdhk1t338磷酸化。

實施例5-通過pgk1的pdhk1磷酸化使pdhk1活化

為了確定pgk1是否通過磷酸化調(diào)節(jié)pdhk1活性，通過進(jìn)行體外蛋白激酶測定來檢驗pgk1對pdhk1磷酸化的pdh的影響。在不存在或存在wtpgk1或pgk1t378p突變體和atp的情況下，將經(jīng)細(xì)菌純化的his-pdh與經(jīng)純化的wtpdhk1或pdhk1t338a混合顯示通過wtpgk1而非pgk1t378p顯著增強(qiáng)了在ser293處pdhk1依賴性pdh磷酸化(圖5a)。相比之下，基礎(chǔ)pdh磷酸化活性與wt對應(yīng)物相同的pdhk1t338a未表現(xiàn)出pgk1增強(qiáng)的pdh磷酸化(圖5a)。這些體外結(jié)果在u87和u251細(xì)胞中得到驗證，這表明pgk1shrna的表達(dá)阻斷缺氧誘導(dǎo)的pdh磷酸化，并且磷酸化中的該缺陷被wtrpgk1而非rpgk1s203a(圖5b)、rpgk1t378p(圖15a)或rpgk1r39/k41a(圖15b)(具有與其wt對應(yīng)物(圖14n)相當(dāng)?shù)奶墙徒饣钚?的重建表達(dá)挽救。值得注意到是，表達(dá)不易位到線粒體中的rpgk1r39/k41a的細(xì)胞用顯著增強(qiáng)pdhk1表達(dá)的長期缺氧刺激并沒有表現(xiàn)出增強(qiáng)的pdh磷酸化(圖15c)。這些結(jié)果表明，pdhk1的完全活化需要pgk1依賴性磷酸化。

為了進(jìn)一步檢驗在pdh調(diào)控下通過pgk1使pdhk1磷酸化的效果，從u87和u251細(xì)胞以及用wtrpdhk1或rpdhk1t338a重建的其表達(dá)中耗竭pdhk1(圖5c，左圖)。pdhk1耗竭阻斷缺氧誘導(dǎo)的pdh磷酸化，其通過wtrpdhk1而非rpdhk1t338a的重建表達(dá)被挽救(圖5c，右圖)。此外，egf處理(圖5d)或k-rasg12v和b-rafv600e的表達(dá)(圖5e)導(dǎo)致增強(qiáng)由rpgk1s203a的重建表達(dá)(圖5d)或激酶失活erkk52r的表達(dá)(圖5e)阻斷的pdhk1t338和pdhs293的磷酸化。這些結(jié)果表明，缺氧、egfr活化以及k-rasg12v和b-rafv600e的表達(dá)均導(dǎo)致pgk1介導(dǎo)的pdhk1磷酸化，其增強(qiáng)pdhk1對pdh磷酸化的活性。

實施例6-pgk1介導(dǎo)的pdhk1磷酸化抑制線粒體丙酮酸代謝并促進(jìn)糖酵解和谷氨酰胺分解驅(qū)動的脂質(zhì)合成

pdhk1磷酸化pdh并抑制其活性(holness和sugden，2003；kim等，2006)。為了確定pgk1依賴性pdhk1磷酸化在調(diào)節(jié)線粒體功能中的作用，將¹⁴c標(biāo)記的丙酮酸與來自缺氧刺激的u87細(xì)胞(具有或不具有pdhk1耗竭以及wtrpdhk1或rpdhk1t338a的重建表達(dá))分離的線粒體混合(參見圖5c)。pdhk1耗竭發(fā)揮類似于rpgk1s203a表達(dá)(圖4a)的作用，這顯著增強(qiáng)了¹⁴c標(biāo)記的丙酮酸向¹⁴c標(biāo)記的co2的轉(zhuǎn)化速率，并抵消了由缺氧誘導(dǎo)的抑制(圖6a)。這些作用被wtrpdhk1的重建表達(dá)所消除。相比之下，rpdhk1t338a表達(dá)不能抑制缺氧誘導(dǎo)的pdh依賴性丙酮酸代謝(圖6a)。用[1-¹⁴c]-丙酮酸孵育的缺氧或egf刺激的u87細(xì)胞也獲得了類似的結(jié)果(圖16a)。與這一發(fā)現(xiàn)一致，u87細(xì)胞(圖6b)和u251細(xì)胞(圖16b)的線粒體中乙酰輔酶a水平的產(chǎn)生被缺氧抑制，并且這種抑制通過pdhk1的耗竭消除，并通過wtrpdhk1而非rpdhk1t338a的重建表達(dá)恢復(fù)。值得注意的是，u87(圖6c)和u251細(xì)胞(圖16c)缺氧刺激24小時增強(qiáng)ros產(chǎn)生，其通過pdhk1耗竭進(jìn)一步提高。與rpdhk1t338a的表達(dá)相比，wtrpdhk1的重建表達(dá)極大地抑制了ros產(chǎn)生(圖6c和16c)。此外，wtrpdhk1的表達(dá)提高(其導(dǎo)致pdhk1t338磷酸化提高)(圖16d，左圖)引起在缺氧條件下對ros產(chǎn)生的抑制顯著提高。相比之下，僅rpdhk1t338a的表達(dá)提高對缺氧誘導(dǎo)的ros產(chǎn)生的影響有限(圖16d，右圖)，表明pdhk1t338磷酸化在pdhk1線粒體功能中的關(guān)鍵作用。與這一發(fā)現(xiàn)一致，與wtrpgk1的表達(dá)相比，rpgk1r39/k41a表達(dá)增強(qiáng)了ros產(chǎn)生(圖16e)。此外，pgk1耗竭誘導(dǎo)更高的ros產(chǎn)生(圖16f)和線粒體膜電位抑制(圖16g)(其通過添加外源丙酮酸進(jìn)一步增強(qiáng))。與這些發(fā)現(xiàn)一致，egf處理抑制了氧消耗速率(ocr)，并且通過用二氯乙酸(dca)pdhk抑制劑或pgk1s203a的重建表達(dá)處理細(xì)胞來減輕這種效應(yīng)(圖16h)。這些結(jié)果表明線粒體pgk1介導(dǎo)的pdhk1磷酸化有助于抑制pdh活性依賴性的丙酮酸代謝以及缺氧或egf誘導(dǎo)的線粒體ros產(chǎn)生和呼吸作用。

與缺氧增強(qiáng)糖酵解的概念一致(kim等，2006；papndreou等，2006)，用短期缺氧刺激檢測到提高的胞質(zhì)溶膠丙酮酸水平(圖6d和161)以及u87(圖5d至e)和u251(圖16i至j)細(xì)胞中乳酸的產(chǎn)生(圖6e和16j)，這不改變pgk1的表達(dá)水平和pdhk1的表達(dá)(圖1d和4g)。值得注意的是，這種提高被pgk1(左圖)或pdhk1(右圖)的耗竭所阻斷，其分別通過wtrpgk1或rpdhk1而非rpgk1s203a或rpdhk1t338a的重建表達(dá)而完全恢復(fù)。此外，與wtrpgk1的重建表達(dá)相比，rpgk1s203d的重建表達(dá)增強(qiáng)了乳酸的產(chǎn)生(圖16k)。

egfr活化導(dǎo)致pgk1介導(dǎo)的磷酸化和pdhk1活化以及隨后的pdh磷酸化。如所預(yù)期，egf刺激抑制丙酮酸向co2的轉(zhuǎn)化(圖16l)并提高乳酸產(chǎn)生(圖16m)；這些作用可通過pgk1或pdhk1的耗竭而減輕，這可通過wtrpgk1或wtrpdhk1而非rpgk1s203a或rpdhk1t338a的重建表達(dá)來挽救。這些結(jié)果表明線粒體pgk1介導(dǎo)的pdhk1磷酸化通過減弱線粒體丙酮酸代謝來促進(jìn)胞質(zhì)溶膠糖酵解。

糖酵解和谷氨酰胺分解通過用于脂肪酸合成的tca循環(huán)產(chǎn)生檸檬酸。胞質(zhì)溶膠丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化的增強(qiáng)以及線粒體丙酮酸代謝的抑制可影響由糖酵解和谷氨酰胺水解引起的脂肪酸合成的動力學(xué)。與先前的報道一致，egfr活化使得用于谷氨酰胺代謝的谷氨酰胺酶活化(thangavelu等，2012)，圖6f顯示egf處理抑制來源于d-[6-¹⁴c]葡萄糖的¹⁴c標(biāo)記的脂肪酸合成，但大幅提高了l-[u-¹⁴c]谷氨酰胺來源的脂質(zhì)合成。重要的是，與wtpgk1的重表達(dá)相比，通過rpgk1s203d的重建表達(dá)，谷氨酰胺分解促進(jìn)的脂質(zhì)合成顯著增強(qiáng)(圖6g)。這些結(jié)果有力地表明egfr活化通過抑制線粒體丙酮酸代謝并增強(qiáng)谷氨酰胺分解促進(jìn)的脂質(zhì)合成來減弱糖酵解來源的脂肪酸合成。

實施例7-線粒體pgk1依賴性pdhk1磷酸化促進(jìn)細(xì)胞增殖和腦腫瘤發(fā)生并指示gbm患者的不良預(yù)后

線粒體pgk1調(diào)節(jié)的細(xì)胞代謝和ros產(chǎn)生可能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。如所預(yù)期，在缺氧條件下培養(yǎng)4天的u87和u251細(xì)胞中pgk1和pdhk1的耗竭抑制增殖(圖7a和17a)。wtrpgk1或rpdhk1的重建表達(dá)恢復(fù)細(xì)胞增殖。相比之下，rpgk1s203a(其維持了胞質(zhì)溶膠而非線粒體功能)和rpdhk1t338a(其具有基礎(chǔ)的但非pgk1增強(qiáng)的活性)的重建表達(dá)僅導(dǎo)致部分挽救這些對細(xì)胞有害的影響。與先前公開的結(jié)果一致(anastasiou等，2011)，降低線粒體中缺氧誘導(dǎo)的ros產(chǎn)生的dtt處理部分挽救了具有wtpgk1或pgk1r39/k41a突變體的重建表達(dá)的u87細(xì)胞的缺氧誘導(dǎo)的生長抑制(圖17b)。在正常氧條件下，表達(dá)活性egfrviii突變體的u87細(xì)胞中pgk1的耗竭抑制細(xì)胞增殖，其通過wtrpgk1而非rpgk1s203a的重建表達(dá)被挽救(圖17c)。相比之下，從表達(dá)rpgk1s203d的細(xì)胞中觀察到增強(qiáng)的細(xì)胞增殖，這也使細(xì)胞對谷氨酰胺剝奪(glutaminedeprivation)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制更敏感(圖17d)。這些結(jié)果表明線粒體pgk1依賴性pdhk1磷酸化在缺氧和正常氧條件下均促進(jìn)細(xì)胞增殖。

為了確定pgk1在腦腫瘤發(fā)展中可能的線粒體功能，將具有或不具有耗竭的pgk1或pdhk1及其wt對應(yīng)物、rpgk1s203a、rpgk1s203d、rpgk1r39/k41a或rpdhk1t338a的重建表達(dá)的u87或gsc11人原代gbm細(xì)胞經(jīng)顱內(nèi)注射入無胸腺裸小鼠中(圖17e)。腦的解剖顯示注射有u87細(xì)胞(圖7b)或gsc11細(xì)胞(圖17f)的所有動物中的腫瘤生長。相比之下，在分別注射有具有耗竭的pgk1或pdhk1的細(xì)胞的小鼠的腦中沒有檢測到腫瘤生長或檢測到小得多的腫瘤。在內(nèi)源性pgk1或pdhk1耗竭的細(xì)胞中，wtrpgk1或rpdhk1而非rpgk1s203a、rpgk1r39/k41a或rpdhk1t338的重建表達(dá)恢復(fù)了腫瘤生長，同時觀察到rpgk1s203d增強(qiáng)的腫瘤生長(圖7b和17f)。免疫組織化學(xué)(ihc)染色顯示在具有其wt對應(yīng)物的重組表達(dá)(而非具有rpgk1s203a或rpdhk1t338a的重建表達(dá))的u87細(xì)胞中pgk1s203和pdhk1t338的強(qiáng)磷酸化。在具有wtrpgk1或rpdhk1的重建表達(dá)的情況下，腫瘤組織的ki67染色(圖17g)和用tunel測定分析(圖17h)顯示迅速的細(xì)胞增殖和很少的凋亡細(xì)胞，相比之下，在具有rpgk1s203a或rpdhk1t338a重建表達(dá)的情況下，顯示緩慢的細(xì)胞增殖和更多凋亡細(xì)胞。這些結(jié)果表明線粒體pgk1依賴性pdhk1磷酸化促進(jìn)腦腫瘤發(fā)生。

為了確定線粒體pgk1依賴性pdhk1磷酸化調(diào)節(jié)pdh活性的發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性，用具有抗磷酸pgk1s203、抗磷酸pdhk1t338和抗磷酸pdhs293抗體的50份人原代gbm標(biāo)本(worldhealthorganizationiv級)進(jìn)行ihc分析。通過使用具有特異性阻斷肽進(jìn)行ihc分析驗證抗體特異性(kaplon等，2013)。如圖6c所示，pgk1s203、pdhk1t338和pdhs293的磷酸化水平彼此相互關(guān)聯(lián)。染色的定量顯示這些相關(guān)是顯著的(圖18)。

將50名患者(全部在gbm的手術(shù)切除術(shù)后接受標(biāo)準(zhǔn)的輔助性放射治療，隨后用烷化劑(多數(shù)情況下為替莫唑胺)進(jìn)行治療)的存活時間與pgk1s203和pdhk1t338的腫瘤磷酸化水平進(jìn)行比較(低：染色評分0至4；高：染色評分4.1至8)。對于其腫瘤具有低pgk1s203和pdhk1t338磷酸化水平的患者，中值存活時間分別為201.3周和192.4周；對于腫瘤具有高pgk1s203和pdhk1t338磷酸化水平的患者，中值存活時間分別為90.2周和82.9周。在cox多變量模型中，pgk1s203和pdhk1t338磷酸化的ihc評分是患者年齡(其為相關(guān)的臨床協(xié)變量)調(diào)整后gbm患者存活的獨立預(yù)測因子(圖7d)。這些結(jié)果支持線粒體依賴性pgk1的pdhk1磷酸化在人gbm的臨床行為中的作用，并揭示了erk1/2依賴性pgk1磷酸化、pgk1依賴性pdhk1磷酸化和gbm臨床侵襲性之間的相關(guān)性。

實施例8-pgk1使組蛋白h2、cdc45和beclin-1磷酸化

如圖19a所示，pgk1使組蛋白h3在ser10處磷酸化。此外，u87細(xì)胞中pgk1shrna的表達(dá)阻斷egf誘導(dǎo)的組蛋白h3在ser10處的磷酸化，這對于基因轉(zhuǎn)錄和有絲分裂進(jìn)程是重要的。

cdc45是啟動dna復(fù)制所需的必要蛋白質(zhì)。在[γ³²p]-atp存在下，經(jīng)純化的野生型pgk1而非pgk1激酶失活(kd)突變體使經(jīng)純化的野生型cdc45而非cdc45s386a磷酸化(圖19b)。

beclin-1參與自噬的啟動。在[γ³²p]-atp存在下，經(jīng)純化的pgk1使經(jīng)純化的野生型beclin-1磷酸化(圖19c)。beclin-1s30a突變體很大程度上抵抗pgk1的磷酸化。

實施例9-pgk1在y324處的自磷酸化提高pgk1糖酵解酶活性

pgk1(在糖酵解中產(chǎn)生atp的糖酵解酶)發(fā)揮利用atp使其底物磷酸化的蛋白激酶的功能。除了使其他蛋白質(zhì)磷酸化外，pgk1可經(jīng)歷自磷酸化。質(zhì)譜分析將酪氨酸324(y324)鑒定為pgk1的自磷酸化位點。體外蛋白激酶測定顯示由酪氨酸324向苯丙氨酸(y324f)的替換阻止自磷酸化(圖20a至b)。pgk1酶活性測定顯示，相對于野生型(wt)酶，pgk1y324f突變體的糖酵解酶活性嚴(yán)重降低，且與破壞atp結(jié)合的酶失活突變體pgk1t378p相當(dāng)(圖20c)。

＊＊＊

根據(jù)本公開內(nèi)容的教導(dǎo)，不需要過度實驗就可以完成和實施本文中所公開和要求保護(hù)的所有方法。盡管已經(jīng)以一些優(yōu)選實施方案的方式描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是可改變本文中所述的方法以及所述方法的步驟或步驟順序而不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體地，顯而易見的是可以用化學(xué)和生理學(xué)上都相關(guān)的某些試劑替代本文中所述的試劑，同時實現(xiàn)相同或類似的結(jié)果。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有此類相似的替代和改變被視為在由所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。

參考文獻(xiàn)

以下參考文獻(xiàn)以為本文所述內(nèi)容提供示例性步驟或其他補(bǔ)充性細(xì)節(jié)的程度具體地通過引用并入本文。

美國專利4,870,287

美國專利5,739,169

美國專利5,760,395

美國專利5,801,005

美國專利5,824,311

美國專利5,830,880

美國專利5,846,945

美國專利公開2008/004287

ahmadetal.，phosphoglyceralekinaseiasapromoterofmetastasisincoloncancer.internationaljournalofoncoiogy，intcrnationaljournalofoncology，43：586-590，2013.

aietal.，flnaandpgkiaretwopotentialmarkersforprogressioninhepatocellularcarcinoma.cellularphysiologyandbiochemistry：internationaljournalofexperimentalcellularphysiology，biochemistry，andpharmacology，27：207-216，2011.

anastasiouetal.，inhibitionofpyruvatekinasem2byrenctivcoxygenspeciescontributestoccllularantioxidantresponses，science，334：1278-1283.2011.

austin-wardandvillasecn，revistsmedicadechilc，126(7)：838-845，1998.

bainetal.，theselectivilyofproteinkinaseinhibitors：afurtherupdate，biochem，j.，408:297-315，2007.

bcrnsteinandhol，crystalstructuresofsubstratesandproductsboundtothephosphoglyceratekinaseactivesiterevealthccatalyticmechanism，biochemistry，37：4429-4436.1998.

brahimi-hornetal.，nypoxiasignallingcontrolsmetabolicdemand.currentopinionincellbiology，19：223，229,2007.

brown，controlofrespirationandatpsynthesisinmammalianmitochondriaandcells，thebiochemicaljournal，284：1-13，1992.

bukowskietal.，clinicalcancerres.，4(10)：2337-2347，1998.

cairnsetal.，regulationofcancercellmetabelismnaturereviews，cancer11：85-95，2011.

chacinskaetal.，importingmitochondrialproteins：machineriesandmechamisms，cell，138：628-644，2009.

chiarellietal.，moleeularinsightsonpathogenieeffectsofmutationscausingphosphoglyeeratekinasedeticieney，plosone，7：e32065，2012.

chowetal.，measurementofmapkinaseacrivationbyflowcytometryusingphospho-specificantibodiestomekanderk：potentialforpharmacodynamicmonitoringofsignaltransductioninhibitors，cytometry，46：72-78，2001.

christodoulidesetal.，microbiology，144(pt11)：3027-3037，1998.

davidsonetal.，j.immunether.，21(5)：389-398，1998.

daviesetal.，speciticityandmechanismofactionofsomecommonlyusedproteinkinaseinhibitors，biochem.j.，341：95-105，2000.

“designofprodrugs”，ed.h.bundgaard，elsevier，1985.

downeyetal.，chemotacticpeptide-inducedactivationofmek-2，thepredominantisoforminhumanneutrophils：inhibitionbywortmannin，j.biol.chem.，271:21005-21011，1996.

duncanetal.，discoveryandcharacterizationofanonphosphorylatedcyclicpeptideinhibitorofthepeptidylprolylisomerase，pinl，j.med.chem.，54：3854-3865，2011.

duanetal.，overexpressionofhumanphosphoglyceratekinase1(pgk1)inducesamultidrugresistancephenotype，anticancerresearch，22l1933-1941，2002.

englishandcobb，pharmtacologicalinhibitorsofmapkpathways，trendspharmacolsci.，23：40-45，2002.

fangetal.，phosphorylationofbeta-cateninbyaktpromotesbeta-catenintramseriptionalactivity，thejournalofbiologicalchemistry，282：11221-11229，2007.

floekhartetal.，nfatsignallingisanoveltargetofoncegenicbrafinmetastaticmelanoma，britishjournalofcancer，101：1448-1455，2009.

gaoetal.，c-mycsuppressionofmir-23a/benhancesmitochondrialglutnminaseexpressionandglutaminemetabolism，nature，458：762-765，2009.

gaoetal.，pyruvalekinasem2regulatesgenetranscriptionbyaetingasaproteinkinase，molecularcell，45：598-609，2012.

gatenbyandgillies，whydocancershavehighaerobicglycolysis？naturereviews，camcer，4：891-899，2004.

gomez-manzanoetal.，delta-24inereasestheexpressionandactivityoftopoisomeraseiandenhnncestheantigliomaeffectofirinotecan，clin.cuncerres.，12：556-562，2006.

hanibuchietal.，int.j，cancer，78(4)：480-485，1998.

hrllstrandetal.，actaoncolodiea，37(4)：347-353，1998.

hitosugietal.，tyrosinephosphorylationofmitochondrialpyruvatedehydrogenasekinase1isimportantforcancermetabolism，molecularcell，44：864-877，2011.

hockelandvaupel，tumorhypoxia；definitionsandeurrentclinical，biologic，andmoiecularaspects，journalofthenationalcancerinstiude，93：266-276，2001.

holnessandsugden，regulationofpyruvatedehydrogenasecomplexactivitybyreversiblephosphorylation，biochemicalsocietytransactions，31：1143-1151，2003.

hsiehetal.，currentprodrugdesignfordrugdiscovery，curr.pharm.des.，15：2236-2250，2009.

huiandhashimoto，infeetionimmun.，66(11)：5329-5336，1998，

huttunenelal.，prodrugs-fromserendipitytorationaldesign，pharmacologicalrev.，63：750-771，2011.

hwangetal.，overexpressionandelevatedserumlevelsofphosphoglyceratekinase1inpancreaticductaladenocareinoma，proteomics，6：2259-2272，2006.

jietal.，egf-inducederkactivationpromotesck2-mediateddisassociationofalpha-cateninfrombeta-cateninandtransactivationofbeta-catenin，molecularcell，36：547-559，2009.

jiangetal.，pkm2regulateschromosomesegregationandmitosisprogressionoftumorcells，molecularcell，53：75-87，2014.

kaplonetal.，akeyroleformitochondrialgatekeeperpyruvatedehydrogenaseinoncogene-inducedsenescence，nature，498：109-112，2013.

kimetal.，hif-1-mediatedexpressionofpyruvatedehydrogenasekinase：ametabolicswitchrequiredforcellularadaptationtohypoxia，cellmeiabolism，3：177-185，2006.

kieinetal.，theeffeetsofanovelmekinhibitorpd184161onmek-erksignalingandgrowthinhumanlivercancer，neoplasia，8：1-8，2006.

koppenoletal.，ouowarburg′scontributionstocnrrentconceptsofcancermetabolism，naturereviews，cancer，11：325-337，2011.

kronbladetal.，erk1/2inhibitionincreasesaatiestrogentreatmentefficacybyinterferingwithhypoxia-induceddownregulationoferalpha：acombinationtherapypotentiallytargetinghypoxicanddormanttumorcells，oncogene，24：6835-6841，2005.

loweryetal.，proteomicscreendefinesthepolo-boxdomaininteractomeandidentifiesrock2asaplk1substrate，theembojournal，26：2262-2273，2007.

luandxu，erk1/2mapkinasesincellsurvivalandapoptosis，iubmblife，58：621-631，2006.

luandzhou，theprolylisomerasepin1：apivotalnewtwistinphosphorylationsignallinganddisease，naturereviews，molecularcellbiology，8：904-916，2007.

luetal.，activationofproteinkinasectriggersitsubiquitinationanddegradation，molecularandcellularbiology，18：839-845，1998-marin.hernandezetal.，hif-1aiphamodulatesenergymetabolismincancercellsbyinducingover-expressionofspecificglgcolyticisoforms，minireviewsinmedicinalchemistry，9：1084-1101，2009.

mattinglyetal.，thenitogen-activatedproteinkinase/extracellularsignal-regulatedkinasekinaseinhibitorpd184352(ci-1040)selectivelyinducesapoptosisinmalignantcchwannomacelllines，j.pharmacol.exp.ther.，316：456-465，2006.

michelsonetal.，structineofthehumanphosphogluceratekinasegeneandtheintron-mediatedevolutionandofthenecleotide-bindingdomain，proceedingsofthenationatacademyofsciencesusa，82：6965-69691985.

morietal.，adualinhibitoragainstprolylisomerasepinlandcyclophilindiscoveredbyanovelreal-timefluorescencedetectionmethod，biochem.biophys，res.commin.，406：439-443，2011.

papandreouetal.，hif-imediatesadaptationtohypoxiabyactivelydown-regulatingmitochondrialoxygenconsumption，cellmetabolism，3：187-197，2006.

pezzatoetal.，ca²⁺-independenteffectsofsperminconpyruvatedehydrogenasecomplexactivityinenergizedratiivermitochondriaincubateeintheabsenceofexogenousca2⁺andmg²⁺，aminoacids，36：449-456，2009.

qinetal.，proc.natl.acad.sci.usa，95(24）：14411-14416，1998.

rileyetal.，chromatinstructureofactiveandinactivehumanx-linkedphosphoglyceratekinasegene，somaticcellandmolecidargenetics.12：73-80，1986.

rinehartetal.，multicenterphaseiistudyoftheoralmeknhibitor，ci-1040.inpatientswithadvancednon-small-celljung，breast，colon，andpancreaticcancer，j.clin.oncol.，22：4456-4462，2004.

rocheandhiromasa，pyruvatedehydrogenasekinaseregulitorymechanismsandinhibitioninrreatingdoabetes，heartischemia，andcancer，cellularandmolecularlifesciences：cmls.64：830-849，2007.

semenza，hypoxia-induciblefactoriandcancerpathogenesis，iubmblife，60：591-597，2008.

semenza，hif-1：upstreamanddownstreamofcancermetabolism.curremopinioningeneticsanddevelopment.20：51-56，2010.

sheetal.，directregulationofcomplexibymitochondrialmef2disdisruptedinamousemodelofparkinsondiseaseandinhumanpatients，thejournalofclinicalinvestigation，121：930-940，2011.

tanietal.，molecularcloningandstructureofanautosomalprocessedgeneforhumanphosphoglyceratekinase，gene，35：11-18，1985.

tausetal.，universalandconfidentphosphorylationsitelocalizationusingphosphors.journalofproteomeresearch，10：5354-5362，2011.

thangaveluetal.，strueturalbasisfortheallostericinhibitorymechanismofhumankidney-typeglutaminase(kga)anditsregulationbyraf-mek-erksignalingincancercellmetabolism，proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa，109：7705-7710，2012.

vandergeerandhunter，phospbopeptidemappingandphosphoaminoacidanalysisbyelectrophoresisandchromatographyonthin-layercelluloseplates，electrophoresis，15：544-554，1994.

vanderheidenetal.，understandingthewarburgeffect：themetabolicrequirementsofcellproliferation，science，324：1029-1033，2009.

wykoskyetal.，therapeutictargetingofepidermalgrowthfactorreceptorinhumancancer：successesandlimitations，chinesejournalofcancer，30：5-12，2011.

xiaetal.，c-jundown-regulationbyhdac3-dependenttranscriptionalrepressionpromotesosmoticstress-inducedcellapoptosis，molecularcell，25：259-232，2007.

xuetal.，recuced-amideinhibitorofpin1bindsinaconformationresemblingatwisted-amidetransitionstate，biochemistry，50：9545-9550，2011.

xuetal.，cyclohexylketoneinhibitorsofpin1dockinatrans-diaxialcyclohexaneconformation，plosone，7：e44226，2012.

yaffeetal.，sequence-specificandphosphorylation-dependentprolineisomerization：apotentialmitoticregulatorymechanism，scicnce，278：1957-1960，1997.

yanetal.over-espressionofcofilin-1andphosphoglyceratekirase1inastrocytomasinvolvedinpathogenesisofradioresistance，cnsneuroscienceandtherapeutics.18：729-736.2012.

yangetal.，erk1/2-dependentphosphorylationandnucleartranslocationofpkm2promotesthewarburgeffect，naturecellbiology，14：1295-1304，2012.

yangetal.，pkm2phosphorylateshistoneh3andpromotesgenetranscriptionandtumorigcncsis，cell，150：685-696，2012.

yoonetal，inhibitionofpik1andpin1by5′-nitro-indirubinoximesuppresseshumanlungcancercells，cancerlell.，316：97-104，2012.

yunelal.，glucosedeprivationcontributestothedevelopmentofkranpathwaymutationsintumorcells，science，325：1555-1559，2009.

zhangetal.，synthesisandstrueture-activityrelationshipsof3-cyano-4-(phenoxyanilino)quinolinesasmek(mapkk)inhibitors，bioorg.med.chem.lett.，10：2825-2828，2000.

zhangetal.，proteomicstudyrevealsthatproteinsinvolvedinmetabolicanddetoxiticationpathwaysarehighlyexpiessedinher-2/neu-positivebreastcancer，molecular&cellularproteontics：mcp，4：1686-1696，2005.

zhengetal.，fakphosphorylationbyerkprimesras-inducedtyrosinedephosphorykuionoffakmediatedbypin1andptp-pest，molecularcell，35：11-25，(2009).

ziekeretal，phosphoglyceratekinasriapromotingenzymeforperitonealdisseminationingastriccancer.internationaljournalofcancer，journalinternationalducancer，126：1513-1520，2010.

序列表

<110>得克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會

<120>作為用于癌癥治療和診斷之靶標(biāo)的磷酸甘油酸激酶1的蛋白激酶活性

<130>utfc.p1259wo

<140>尚未指定

<141>2016-01-05

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