本發(fā)明涉及醫(yī)療技術領域，具體涉及一種臍帶血干細胞治療肌營養(yǎng)不良癥的方法。
背景技術：
肌營養(yǎng)不良癥(MD)是指人體運動肌肉變弱的一組遺傳性的肌肉疾病，肌營養(yǎng)不良癥特點是進行性骨骼肌無力、肌肉蛋白缺陷、肌肉細胞和組織死死亡等。
假肥大性肌營養(yǎng)不良(DMD)，也稱Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(DMD)，是一類兒童最常見的進行性肌營養(yǎng)不良癥，當一個孩子開始走路時，就有很明顯的臨床表現(xiàn)，患者通常在10到12歲不能正常行走，需要坐輪椅，一般死于十幾歲到二十幾歲之間。在男性中，Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(DMD)的發(fā)病率為1/3500。
在基因治療領域，盡管加強動物實驗或臨床前的研究，但是肌營養(yǎng)不良癥還沒有辦法治愈。目前主要的治療方法有兩種：一種是反義寡核苷酸療法，另一種是使用腺相關病毒經(jīng)行治療。然而，無論是利用反義寡核苷酸法或全身性腺病毒法經(jīng)行治療，都只能產出一個短暫的效果。由于免疫反應和高昂的費用，要想長期使用是不可能的。
治療肌營養(yǎng)不良癥，干細胞療法是最具有應用前景的一種治療方法。對于自體干細胞療法，一是iPS細胞可以產生和再分化成肌肉干細胞并通過同源重組校正患病的基因，這種方法的主要障礙是：耗時、費力和要把iPS細胞衍生的肌肉干細胞移植到體內。二是純化供者提供的肌肉干細胞或成血管干細胞然后回輸?shù)交颊唧w內，然而，異基因的即使是造血干細胞移植也需要長期使用免疫抑制劑來阻止免疫排異反應。
目前，還沒有治愈MD的方法，在不久的將來，基因治療方法，如反義寡核苷酸或AAV能夠用于臨床試驗。然而，這些治療不能修正遺傳突變，只能產生一個短暫的影響。更重要的是，反復的運用反義寡核苷酸或AAV會引起強烈的免疫反應，因此，要避免長期使用。
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技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種可將造血干細胞轉化成肌干細胞，由臍血造血干細胞分化而來的肌肉干細胞進行移植，具有更好的移植能力的臍帶血干細胞治療肌營養(yǎng)不良癥的方法。
為了解決背景技術所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術方案：一種臍帶血干細胞治療肌營養(yǎng)不良癥的方法，它包含以下步驟：
(S1)獲得HLA相合的臍帶血；
(S2)按照免疫磁珠法富集CD34+細胞；
(S3)非清髓處理后，將50％的CD34+細胞和所有CD34-細胞移植入病人體內；
(S4)剩余50％的CD34+細胞通過因子組合增加轉化效率，將臍帶血干細胞轉化成肌肉干細胞；
(S5)將中間干細胞移植給患者；
(S6)移植的肌肉干細胞分化成有功能的肌肉干細胞；
(S7)肌肉干細胞繁殖并分化成肌肉組織。
作為本發(fā)明的進一步改進；所述的步驟(S1)-步驟(S2)中，HLA相合的臍帶血可以從臍血庫中獲取，若不能得到HLA相合臍帶血的情況下，6個位點有1到2個不匹配時依舊可以使用，解凍后的臍帶血將按照免疫磁珠法的標準純化富集CD34+細胞。
作為本發(fā)明的進一步改進；所述的步驟(S3)中，非清髓預處理的標準是：氟達拉濱(180mg/mm)+二甲磺酸丁酯(8-16mg/kg)或ATG抗胸腺細胞球蛋白(10-50mg/kg)或者是2-3Gy劑量的非全身照射，移植后，給予病人標準護理。CD34+細胞含有造血干細胞，能重建造血和免疫系統(tǒng)，CD34-細胞中存在免疫細胞，能夠阻止移植排異反應。
作為本發(fā)明的進一步改進；所述的步驟(S4)中的因子組合是OCT4+PAX7，PAX3和/或MyoD，可以增加轉化效率。這幾個基因同在一個2a肽表達載體上，另外，在分化的早期階段，將單獨使用Oct4基因。而在分化后期，會用到多個基因。
基因瞬時表達載體：以EB病毒核抗原(EBNA1)為基礎的游離性載體，在轉染后的3周，只有1％的細胞可以檢測到這種載體。輔助非依賴型載體Ad5/35，能夠有效的感染人臍血細胞和中胚層干細胞，轉染后的幾天，基因可以維持高水平的表達。每3-5天，重新進行轉染以維持基因的表達水平。
基因調控：把一個Tet-on調控原件整合到上述載體中以提高其安全性。
作為本發(fā)明的進一步改進；所述的步驟(S5)中，為了增加中間干細胞的移植，對其轉染因子CXCR4和/或在缺氧條件下誘導CXCR4的表達；或者使用肌肉損傷的藥物以增加可用的干細胞龕。
采用上述技術方案后，本發(fā)明具有以下有益效果：
1、臍帶血是最容易獲得的干細胞移植來源。
2、造血干細胞移植是能夠誘導中樞免疫耐受的唯一證明方法，防止移植的同種異體細胞、組織和器官的排斥反應。
3、可將造血干細胞轉化成肌干細胞。
4、中間干細胞用于移植是最好的，并且與成體干細胞相比由臍血造血干細胞分化而來的肌肉干細胞進行移植具有更好的移植能力。
5、臍帶血移植為正常的異基因肌肉干細胞的移植提供了中樞免疫耐受的環(huán)境。
6、由胎兒的血細胞轉化而來的中間干細胞具有超凡的自我更新能力。在移植入肌肉干細胞龕中后，細胞經(jīng)行增殖和植入，并且它們會轉變成全功能的肌肉干細胞。
附圖說明
圖1為本發(fā)明所提供的實施例的流程圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合具體實施方式，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施方式僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
請參閱圖1，本具體實施方式采用以下技術方案：一種臍帶血干細胞治療肌營養(yǎng)不良癥的方法，它包含以下步驟：
(S1)獲得HLA相合的臍帶血；
(S2)按照免疫磁珠法富集CD34+細胞；
(S3)非清髓處理后，將50％的CD34+細胞和所有CD34-細胞移植入病人體內；
(S4)剩余50％的CD34+細胞通過因子組合增加轉化效率，將臍帶血干細胞轉化成肌肉干細胞；
(S5)將中間干細胞移植給患者；
(S6)移植的肌肉干細胞分化成有功能的肌肉干細胞；
(S7)肌肉干細胞繁殖并分化成肌肉組織。
本具體實施方式的具體實施方法及原理如下：
1、臍帶血干細胞：
大部分情況下，HLA相合的臍帶血可以從臍血庫中獲取。如果不能得到HLA相合臍帶血的情況下，6個位點有1到2個不匹配時依舊可以使用，解凍后臍帶血的將按照免疫磁珠法的標準純化富集CD34+細胞。
2、臍血移植：
非清髓預處理后，將一半CD34+細胞和所有的CD34-細胞移植入病人體內。CD34+細胞含有造血干細胞，能重建造血和免疫系統(tǒng)，CD34-細胞中存在免疫細胞，能夠阻止移植排異反應。
非清髓預處理的標準是：如氟達拉濱(180mg/mm)+二甲磺酸丁酯(8-16mg/kg)或ATG抗胸腺細胞球蛋白(10-50mg/kg)或者是2-3Gy劑量的非全身照射，移植后，給予病人標準護理。
3、造血干細胞分化成成肌干細胞：
幾種因子組合的使用：
1)OCT4，能夠將血液干細胞轉化成中胚層干細胞并促進中胚層干細胞的增殖；
2)PAX3和PAX7，配對盒轉錄因子PAX7在胎兒發(fā)育過程中起著關鍵的作用，這種蛋白對肌肉干細胞的更新和維護是必不可少的。此外，在損耗其他間充質細胞系的情況下，PAX3可以促進間充質干細胞和成血管干細胞向肌源性細胞系分化；
3)MyoD，MyoD是主要的肌源性轉錄因子，這在肌肉衛(wèi)星細胞(肌肉干細胞)分化中起著重要作用。Pax7和MyoD表達與激活的衛(wèi)星細胞存在有關，在骨骼肌增生及肥厚性增生中也起著重要的作用。
最優(yōu)的因子組合是OCT4+PAX7，PAX3和/或MyoD可以增加轉化效率。這幾個基因同在一個2a肽表達載體上，另外，在分化的早期階段，將單獨使用OCT4基因。而在分化后期，會用到多個基因。
基因瞬時表達載體：
1)以EB病毒核抗原(EBNA1)為基礎的游離性載體。在轉染后的3周，只有1％的細胞可以檢測到這種載體；
2)輔助非依賴型載體Ad5/35，能夠有效的感染人臍血細胞和中胚層干細胞，轉染后的幾天，基因可以維持高水平的表達。每3-5天，重新進行轉染以維持基因的表達水平。
基因調控，即使是非整合型DNA載體，106個感染細胞中可能會有1-10個細胞發(fā)生非正常的基因整合，因此，把一個Tet-on調控原件整合到上述載體中以提高其安全性。
4、中間干細胞移植：
轉分化和增殖的干細胞是這些中間干細胞，OCT4基因存在的情況下，會阻止血液干細胞完全分化成肌肉干細胞。然而，移植幾天后，OCT4和其他因子表達水平降低，此時中間干細胞細胞可以分化成功能性的肌肉干細胞，這表明在受損的肌肉組織中，可以進一步加速中間干細胞向肌肉干細胞和祖細胞分化。一些移植的干細胞可能無法植入肌肉細胞，這些細胞最終死亡或轉變成間充質干細胞。
干細胞移植是外周血中的干細胞通過血管屏障遷移到干細胞生態(tài)位的過程，在靜止和增殖這兩種狀態(tài)下，分別占人類和小鼠68％和82％衛(wèi)星細胞，發(fā)現(xiàn)定位與從鄰近的毛細血管或血管內皮細胞5μm范圍內。類似于造血干細胞，像肌肉干細胞這類的干細胞的遷移是通過SDF1/CXCR4軸來實現(xiàn)的，受損或炎癥組織高水平表達配體SDF-1，吸引表達受體CXCR4細胞的遷移。
肌營養(yǎng)不良癥患者的肌肉不斷地被破壞，為了增加中間干細胞的移植，可以對其轉染因子CXCR4和/或在缺氧條件下誘導CXCR4的表達。也可以使用肌肉損傷的藥物以增加可用的干細胞龕。
對于嬰幼兒肌肉萎縮癥，一半的臍帶血進行移植以誘導中樞免疫耐受性，一半的臍帶血干細胞通過轉染一組主要的轉錄因子以將造血干細胞轉化成肌肉干細胞。這些注射的干細胞不是造血干細胞，不能形成肌肉，尚未成為肌肉干細胞，因為全身給藥后，全身肌肉組織移植是相當困難的。這些干細胞是具有造血干細胞和肌肉干細胞特性的中間的干細胞，它們處在中胚層干細胞或成血管細胞向成肌肉干細胞轉化的過程中。移植后，它們會遷移到損傷和炎癥部位，進一步分化轉移和將肌肉干細胞轉化為成熟的肌肉組織。
中間干細胞可以介導所有的器官和組織移植，然而，只有這些細胞移植在損傷肌肉中，它們才分泌多能因子完成轉分化過程、促進存活和增殖并分化成成熟的肌肉組織。移植后若干天后，殘留在血液循環(huán)中的中間細胞會逐漸死去，而那些移植的非肌肉組織的細胞最終將轉變?yōu)橹信邔蛹毎蜷g充質干細胞，這些細胞最終形成結締組織。
對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。
此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。