本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料的組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肛瘺補(bǔ)片或栓、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肛瘺是肛周皮膚和直腸/肛管相通的一種慢性感染性管道，由內(nèi)口、瘺管及外口三部分組成。大多數(shù)肛瘺為原發(fā)性肛瘺，即源于肛門腺的非特異性感染，形成肛門周圍膿腫后的一種發(fā)展結(jié)果。肛瘺臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的肛周感染、破潰流膿，長期不愈的病人可以發(fā)生肛周癌。肛瘺是常見的直腸肛管疾病之一，任何年齡都可發(fā)病，以30-50歲的男性多見，男：女為2：1。Sainio報(bào)告每年的發(fā)生率為8.6/10萬。

目前肛瘺的傳統(tǒng)治療方法有以下所述的瘺管切除、瘺管切開、掛線療法、瘺道曠置引流術(shù)、經(jīng)肛直腸黏膜瓣內(nèi)口修補(bǔ)術(shù)等方式。

肛瘺切開術(shù)：是將瘺管全部切開開放，通過肉芽組織生長使傷口愈合的方法，適用于低位肛瘺治療，因瘺管在外括約肌深部以下，切開后只損傷外括約肌皮下部和淺部，不會(huì)出現(xiàn)肛門失禁。但存在創(chuàng)傷大、愈合時(shí)間長缺點(diǎn)。

肛瘺瘺管切除術(shù)：最早由Parks提出，作為一種治療經(jīng)括約肌高位瘺的手術(shù)方式。將瘺管管壁全部切除，直至健康組織，并使創(chuàng)面成為內(nèi)小外大，以利引流。目前較適用于因炎性腸病、結(jié)核等疾病引起的繼發(fā)性肛瘺，并常與其他術(shù)式聯(lián)合應(yīng)用。但同樣存在創(chuàng)傷大、愈合時(shí)間長缺點(diǎn)。

掛線療法：是目前臨床上應(yīng)用最廣的手術(shù)方法，尤其適用于高位單純性肛瘺。它是利用拉緊的橡皮筋使結(jié)扎處組織發(fā)生血運(yùn)障礙，逐漸缺血壞死。由于掛線會(huì)導(dǎo)致局部纖維化和瘢痕形成，使組織在被切割過程中，基底創(chuàng)面同時(shí)開始逐漸愈合，從而避免肛門括約肌被切斷后回縮，造成術(shù)后肛門失禁。但術(shù)后容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率在2％-15％；此外，對(duì)于一些復(fù)雜性肛瘺的病人，由于手術(shù)導(dǎo)致術(shù)后肛門失禁的可能性較大。

肛瘺切除黏膜瓣成形術(shù)：Aguilar等借助插入瘺管的探針切開皮膚肛管和黏膜直到內(nèi)口，從切開的內(nèi)口遠(yuǎn)端開始游離黏膜和部分內(nèi)括約肌，做成占直徑周徑1/3底寬上窄，呈梯形的中厚層黏膜瓣(包括部分內(nèi)括約肌)，然后縫閉因內(nèi)括約肌缺損的內(nèi)口，抬高黏膜瓣覆蓋內(nèi)口，再將瓣縫到肛管末端，外面?zhèn)陂_放引流，每天沖洗。但此術(shù)式的療效存在爭議，近年有研究報(bào)道其復(fù)發(fā)率較高，肛門失禁率最高可達(dá)到30％-40％以上。

生物蛋白膠治療肛瘺：生物蛋白膠已廣泛應(yīng)用于手術(shù)創(chuàng)面止血、管道封填等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域。1992年，Hjortmp等首次應(yīng)用纖維蛋白膠治療會(huì)陰瘺獲得成功。方法多是先用探針確定內(nèi)口及外口，以刮匙搔扒瘺管內(nèi)肉芽組織，再以雙氧水及生理鹽水反復(fù)沖洗后，注入生物蛋白膠，以腸線縫合關(guān)閉兩端瘺口。生物蛋白膠在肛瘺的治療上具有無副反應(yīng)、無痛、操作簡單、無肛門功能障礙等優(yōu)點(diǎn)，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，成功率差異很大，愈合率從14％～90％不等，其復(fù)發(fā)率在15％～86％之間。而Buchanan通過對(duì)豬的肛瘺模型的組織學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)術(shù)后瘺管周圍出現(xiàn)的慢性炎癥細(xì)胞的浸潤，說明機(jī)體對(duì)纖維蛋白膠有排斥反應(yīng)，這也會(huì)使其有效成分迅速減少，使治愈率降低。

生物材料填充治療肛瘺：2005年，美國學(xué)者Lynn Oconnor等應(yīng)用豬小腸黏膜制作的生物材料通過填塞的方法治療20例因克羅恩病引起的肛瘺取得了成功(治愈率80％)，該方法具有痛苦小，成功率高，復(fù)發(fā)率小的優(yōu)點(diǎn)，其有效性還須進(jìn)一步研究。但該材料制作過程復(fù)雜，價(jià)格昂貴(約1萬元人民幣)。

上述方法共同的缺點(diǎn)是創(chuàng)傷大、愈合時(shí)間長(6-8周傷口愈合期)，部分病人可出現(xiàn)肛門功能受損(在高位復(fù)雜性肛瘺可大10-15％)，甚至大便失禁。而肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的快慢直接影響患者的生活質(zhì)量及日常工作，傳統(tǒng)的切開/切開掛線方式是將所發(fā)現(xiàn)的瘺道全部打開，創(chuàng)傷范圍大且患者術(shù)后恢復(fù)周期長。因此，現(xiàn)有技術(shù)中面臨的難題包括：如何有效減少切開范圍以降低內(nèi)口長時(shí)間開放所致的糞便及細(xì)菌進(jìn)入瘺道導(dǎo)致的感染，從而有效縮短愈合時(shí)間；如何有效減少瘢痕，從而減少肛門變形；如何降低術(shù)后疼痛、控便能力、換藥時(shí)間及影響工作時(shí)間等肛瘺相關(guān)癥狀。

針對(duì)上述問題，本領(lǐng)域出現(xiàn)了使用脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)填塞治療肛瘺的報(bào)道，由于治療具有創(chuàng)傷小、痛苦輕、愈合快、低花費(fèi)、無毒無排斥反應(yīng)等特點(diǎn)，該治療技術(shù)成為肛瘺患者臨床治療的一個(gè)新的選擇。

公開號(hào)為CN101322856的中國專利申請(qǐng)記載了一種治療肛瘺的生物填塞引流物，所述生物填塞物由脫細(xì)胞真皮制備獲得，但所述制備中包括了將脫細(xì)胞真皮組織干燥后粉碎，再通過制備好的模具壓制成生物填塞引流物的操作。上述粉碎塑形破壞了脫細(xì)胞真皮自然的組織結(jié)構(gòu)，不利于新生細(xì)胞在真皮三維框架內(nèi)生長，同時(shí)也破壞了組織原有的彈性、拉伸強(qiáng)度等自然屬性，不利于手術(shù)操作使用，影響治療效果。

公開號(hào)為CN103272276的中國專利申請(qǐng)記載了使用來源于動(dòng)物小腸粘膜下層組織制備的脫細(xì)胞組織材料治療肛瘺的生物栓，所述生物栓用于患者肛瘺治療時(shí)，由于組織來源為近交系動(dòng)物，存在免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，且缺少異體真皮組織更優(yōu)的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)特征。

王振軍(中國臨床醫(yī)生，2008年第36卷第8期)、趙寶忠(求醫(yī)問藥，2011年第9卷第7期)、曾華(實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2012年第12卷第5期)、林家威(微創(chuàng)醫(yī)學(xué)，2013年第8卷第6期)等研究者嘗試使用脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)填塞治療肛瘺均取得了相較于手術(shù)治療較好的效果，上述研究使用的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)來自市售產(chǎn)品，根據(jù)該產(chǎn)品相關(guān)的專利(ZL00120211.1)描述可知，該專利制備用作細(xì)胞種植框架和植入體的生物細(xì)胞外基質(zhì)，主要制備方法包括固定劑固定、堿性溶液去細(xì)胞、氨基酸溶液孵育等，該專利中未提及用于肛瘺等疾病的治療，由于肛瘺為管腔結(jié)構(gòu)，尤其是瘺管較長、管腔較寬的嚴(yán)重肛瘺患者，異體真皮基質(zhì)需要保持一定的韌性和牽拉性，才能避免出現(xiàn)撕裂脫除等現(xiàn)象。該專利制備方法中并未針對(duì)上述技術(shù)問題提出對(duì)應(yīng)處理。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，提供了一種具備較高的韌性、彈性等生理特征更易于肛瘺患者尤其是嚴(yán)重肛瘺患者使用的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)及其相關(guān)產(chǎn)品。

為克服以上現(xiàn)有技術(shù)中肛瘺治療方法的不足，本發(fā)明汲取生物蛋白膠和Lynn Oconnor的生物材料經(jīng)驗(yàn)，引入蛋白酶消化處理和表面活性劑高滲聯(lián)合處理、交聯(lián)劑交聯(lián)處理、氨基酸溶液營養(yǎng)等多步驟協(xié)同操作，發(fā)明制作了脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)材料，并將其剪裁成肛瘺栓進(jìn)行肛瘺的填塞治療。脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)取材于人體皮膚組織，經(jīng)特殊的理化、生化處理，去除了可能引起免疫排異反應(yīng)的所有成份，但完整地保留了原有組織的纖維立體支架結(jié)構(gòu)，植入后很快有新生血管和成纖維細(xì)胞長入，取得了良好的臨床效果。

本發(fā)明提供一種脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)，其特征在于其是由異體皮經(jīng)過蛋白酶溶液消化處理、含表面活性劑的高滲鹽溶液脫細(xì)胞處理、交聯(lián)處理、DNA降解處理、氨基酸營養(yǎng)處理獲得。

本發(fā)明提供一種脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的制備方法，具體步驟包括：

步驟一，將異體皮原料投入盛有蛋白酶溶液的容器中，浸泡振蕩處理，得半成品A；

步驟二，將半成品A投入盛有含有表面活性劑和高滲鹽溶液的容器中，超聲浸泡處理；更換表面活性劑和高滲鹽溶液，超聲浸泡處理；重復(fù)該操作多次，得半成品B。

步驟三，將半成品B用生理鹽水浸泡，振蕩處理，得半成品C；

步驟四，將半成品C投入盛有交聯(lián)劑溶液的容器中，浸泡,得半成品D；

步驟五，將半成品D取出投入盛有生理鹽水溶液容器中浸泡，得半成品E；

步驟六，將半成品E投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，浸泡處理，得半成品F；

步驟七，將半成品F用生理鹽水浸泡振蕩處理，得半成品G；

步驟八，將半成品G取出，用氨基酸溶液浸泡后，投入盛有生理鹽水溶液容器中，靜置，得半成品H；

步驟九，將半成品H取出，包裝，滅菌，得成品I。

本發(fā)明制備的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的縫合強(qiáng)度為16N-20N、拉伸強(qiáng)度為3.0MPa-7.0MPa、拉伸伸長率為10％-28.9％。

在某些實(shí)施方式中，前述步驟一所述的蛋白酶選自胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；優(yōu)選地，所述蛋白酶溶液為0.1-0.3％胰蛋白酶-dispase酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶與dispase酶的質(zhì)量比是2-3:0.1-1.8，溶液pH值為7.0-8.0；最優(yōu)選胰蛋白酶與dispase酶的質(zhì)量比是2:1；或所述蛋白酶溶液為0.1-0.4％胰蛋白酶-木瓜蛋白酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為2-3:0.1-1.8，溶液pH值為6.0-8.0；或所述蛋白酶溶液為0.1％-0.3％胰蛋白酶-菠蘿蛋白酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶與菠蘿蛋白酶的質(zhì)量比為2-3:0.1-1.8，溶液pH值為7.0-8.0。

在某些實(shí)施方式中，前述步驟二中表面活性劑和高滲鹽溶液的配方是含有0.1-0.3g/L聚乙二醇與SDS，或含有0.1-0.3g/L聚乙二醇與Triton X-100的高滲鹽溶液，其中，聚乙二醇選擇分子量400-2000，聚乙二醇與SDS或與Triton X-100的質(zhì)量比選擇為40-60:60-40，高滲鹽為50mM tris-HCl，1M氯化鈉，10mM EDTA；優(yōu)選聚乙二醇與SDS或與Triton X-100的質(zhì)量比為50-60:50-40。

在某些實(shí)施方式中，前述步驟四中交聯(lián)劑溶液的配方是用京尼平、戊二醛、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺、一水嗎啉乙磺酸中的一種或多種作為交聯(lián)劑，交聯(lián)劑與異體皮原料質(zhì)量比為0.1-4：1；優(yōu)選交聯(lián)劑溶液的配方是用京尼平與選自戊二醛、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺、一水嗎啉乙磺酸任一作為交聯(lián)劑，其中，京尼平與另一交聯(lián)劑的質(zhì)量比為1-6:1。上述低毒性的交聯(lián)劑，在提高交聯(lián)度的同時(shí)，進(jìn)一步降低了產(chǎn)品的細(xì)胞毒性。

在某些實(shí)施方式中，前述步驟六中DNA水解酶溶液的配方是DNA水解酶濃度為2-10g/L，pH7.0-8.0；優(yōu)選濃度為3-8g/L。

在某些實(shí)施方式中，前述步驟八中氨基酸溶液選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸、或其組合配制而成，氨基酸濃度為0.5-2g/L；優(yōu)選由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸按照3-4:1.1-1.3:1.0-1.6：0.96-1.16:0.07-0.08質(zhì)量比配制；更優(yōu)選所述比例為3.3:1.1:1.3：0.96:0.07，氨基酸濃度為0.6-1.6g/L。

優(yōu)選地前述步驟一中的浸泡振蕩為浸泡3-6小時(shí)，振蕩轉(zhuǎn)速為50-200rpm，重復(fù)操作1-3次。

優(yōu)選地前述步驟二中的超聲浸泡條件為：30-60KHz，100-400W，超聲5-10分鐘，浸泡2-4小時(shí)，重復(fù)2-4次。

優(yōu)選地前述步驟三中的振蕩處理?xiàng)l件為振蕩2小時(shí)，更換生理鹽水，繼續(xù)振蕩處理，重復(fù)該操作4-6次。

優(yōu)選地前述步驟四中的浸泡時(shí)間為3-6h。

優(yōu)選地前述步驟五中的浸泡時(shí)間為8小時(shí)，浸泡次數(shù)為6-9次，浸泡溫度為5-10℃。

優(yōu)選地前述步驟七的條件為生理鹽水浸泡10-12小時(shí)，振蕩處理；更換生理鹽水，振蕩處理，重復(fù)該操作2-4次。

優(yōu)選地前述步驟一、三、七中振蕩轉(zhuǎn)速為50-200rpm。

優(yōu)選地前述步驟九的包裝為將半成品H裝入包裝袋中，封口包裝完畢；所述滅菌為鈷-60照射，照射劑量為20-30kGy。

本發(fā)明還提供所述脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)在制備治療肛瘺的生物材料中的應(yīng)用，所述治療肛瘺的生物材料包括但不限于肛瘺補(bǔ)片、肛瘺栓等。將脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)根據(jù)臨床試劑的需要在無菌等合適的條件下制作成治療肛瘺的補(bǔ)片或進(jìn)一步制成肛瘺栓等方法和技術(shù)均屬于本領(lǐng)域所公知的。

本發(fā)明另一方面提供一種肛瘺栓的制備方法，其是將前述制備獲得的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)制成肛瘺栓。肛瘺栓的制備過程可選擇為將脫細(xì)胞異體真皮經(jīng)圈成圓錐形的細(xì)長圓錐體，再凍干而成。肛瘺栓優(yōu)選成細(xì)長圓錐體，其尺寸大小可以根據(jù)肛瘺患者的嚴(yán)重程度及管腔大小裁減制作成適宜成品，通常圓錐體的底面直徑0.4-2cm，高為8-12cm。

本發(fā)明另一方面提供一種肛瘺補(bǔ)片的制備方法，其是將前述制備獲得的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)制成，所述肛瘺補(bǔ)片尺寸適宜制作成肛瘺栓使用，優(yōu)選尺寸為寬1-5cm，長3-10cm。

本發(fā)明另一方面提供一種脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)或肛瘺補(bǔ)片或肛瘺栓，所述脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)或肛瘺補(bǔ)片或肛瘺栓根據(jù)前述方法制備獲得。

本發(fā)明另一方面提供一種試劑盒，所述試劑盒包含前述的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)或肛瘺補(bǔ)片或肛瘺栓。試劑盒可根據(jù)具體需要進(jìn)一步包含消化酶溶液凍干粉、手術(shù)刀片、無齒鑷子、注射器、注射器針頭、無菌水等相關(guān)配套器械或材料。

本發(fā)明另一方面提供一種治療肛瘺疾病的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括使用本發(fā)明制備的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)治療肛瘺疾病，或使用本發(fā)明制備的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)制備治療肛瘺的生物材料。上述治療方法可選為填充法或填塞法。上述肛瘺可選為高位復(fù)雜性肛瘺或低位單純性肛瘺；尤其是針對(duì)瘺管較長或瘺管管腔寬大的患者，更優(yōu)選針對(duì)瘺管較長，直接切開易造成肛門變形和愈合時(shí)間延長的患者或瘺管管腔寬大，瘺壁自然愈合緩慢的患者或瘺道彎曲患者。

本發(fā)明所述的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)或肛瘺栓或肛瘺片在使用前需先進(jìn)行如下操作：使用生理鹽水浸泡2-3次，每次10-15分鐘。

本發(fā)明制備方法針對(duì)肛瘺疾病的治療需要改進(jìn)和優(yōu)化了制備工藝，包括引入蛋白酶消化組織細(xì)胞，利用表面活性劑和高滲鹽在超聲條件下進(jìn)行脫細(xì)胞處理，并進(jìn)一步與交聯(lián)劑、氨基酸營養(yǎng)液等協(xié)同使用，聯(lián)合選擇DNA去除等操作，獲得了適宜用于肛瘺治療的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)材料。

對(duì)于外科手術(shù)使用的生物材料來講，通常希望其具有某些特殊的機(jī)械性能以滿足特定的使用用途。尤其是一些薄片組織材料，應(yīng)當(dāng)具有足夠的強(qiáng)度來承受預(yù)期用途。對(duì)于肛瘺患者而言，由于肛瘺為管腔結(jié)構(gòu)，尤其是瘺管較長、管腔較寬的嚴(yán)重肛瘺患者，異體真皮基質(zhì)需要保持一定的韌性、牽拉性和柔軟度，才能避免出現(xiàn)撕裂脫除等現(xiàn)象。通常使用脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)材料進(jìn)行肛瘺填塞治療時(shí)，需要對(duì)基質(zhì)材料的生物特性及術(shù)中可操作性進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)主要考慮脫細(xì)胞異體真皮的韌性和彈性，是否能夠縫合、牽拉，便于臨床操作。常規(guī)的分級(jí)包括滿意、較滿意、一般、不滿意。滿意：材料韌性和彈性良好、操作簡單、便于縫合、牽拉；較滿意：材料韌性和彈性尚可、操作尚可、適合縫合、牽拉；一般：材料韌性和彈性一般、縫合操作一般；不滿意：材料韌性和彈性較差、臨床使用可操作性差。

本發(fā)明通過蛋白酶處理脫細(xì)胞組織產(chǎn)品能夠提高組織產(chǎn)品機(jī)械性能，如獲得較好的彈性和韌性，提高組織的拉伸、撕裂、縫合強(qiáng)度；進(jìn)一步的，使用交聯(lián)劑處理增加膠原的強(qiáng)度，使真皮材料的力學(xué)性能更適用于肛瘺手術(shù)；同時(shí)交聯(lián)劑的處理還能夠延長組織在體內(nèi)的降解和消化，利于血管化和組織轉(zhuǎn)軌，適宜肛瘺患者較長時(shí)間使用組織材料的需求；同時(shí)混合氨基酸浸泡也能夠進(jìn)一步提高脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的柔韌性。進(jìn)一步的，本發(fā)明將提高組織產(chǎn)品機(jī)械性能的方法與脫細(xì)胞異體真皮制備方法進(jìn)行融合，并進(jìn)行工藝的調(diào)整和改進(jìn)，如將酶處理步驟與表面活性劑高滲溶液處理步驟進(jìn)行順序調(diào)整將會(huì)影響終產(chǎn)品的性能，在脫細(xì)胞處理中使用超聲浸泡以及混合氨基酸溶液浸泡有利于改善終產(chǎn)品的性能等等。經(jīng)過對(duì)工藝操作的不斷篩選和優(yōu)化，最終獲得了本發(fā)明制備脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的方法，所述方法獲得的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)其縫合強(qiáng)度為16N-20N、拉伸強(qiáng)度為3.0MPa-7.0MPa、拉伸伸長率為10％-28.9％，均能夠滿足前述肛瘺治療用生物材料的生物特性和術(shù)中可操作性，達(dá)到滿意級(jí)別，臨床實(shí)驗(yàn)表明取得了很好的手術(shù)和治療效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有顯著的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。本發(fā)明脫細(xì)胞異體真皮充填修復(fù)的真皮填塞法(試驗(yàn)組)與傳統(tǒng)切開法的標(biāo)準(zhǔn)治療方案(對(duì)照組)相比，試驗(yàn)組平均愈合時(shí)間比對(duì)照組短6.5862天；術(shù)后3個(gè)月試驗(yàn)組瘢痕長度比對(duì)照組短1.4607；試驗(yàn)組發(fā)生輕微肛門變形的概率比對(duì)照組低43.22％。同時(shí)，臨床試驗(yàn)顯示，在術(shù)后1周、術(shù)后14天、21天和3個(gè)月的訪視中，試驗(yàn)組與對(duì)照組的綜合評(píng)分有顯著差異，試驗(yàn)組術(shù)后的綜合得分顯著低于對(duì)照組，且在術(shù)后第21天的隨訪結(jié)束時(shí)試驗(yàn)組所有病例得分都趨于零；提示采用真皮治療后，肛瘺相關(guān)癥狀要顯著輕于對(duì)照組。

本發(fā)明的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)治療肛瘺相對(duì)于傳統(tǒng)手術(shù)治療方法及現(xiàn)有同類真皮材料具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)顯著的簡易和微創(chuàng)性：本方法簡單易行、手術(shù)侵襲小、術(shù)后痛苦輕，不損害肛門功能也不會(huì)造成肛門畸形；(2)成功率高：本方法截至目前術(shù)后3個(gè)月愈合成功率為100％；(3)低花費(fèi)和顯著的社會(huì)效益：本方法治療的病人與常規(guī)治療病人的花費(fèi)基本持平，但由于愈合快，可為每例病人節(jié)約3-4周的工作時(shí)間，具有顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益；(4)具有良好的安全性，無細(xì)胞毒性和排斥反應(yīng)；(5)采用本發(fā)明制備方法制作的脫細(xì)胞異體真皮質(zhì)地柔軟、有較強(qiáng)的韌性和牽拉性，可以滿足肛瘺手術(shù)中牽拉、縫合的張力，不會(huì)出現(xiàn)撕裂脫出等現(xiàn)象；(6)本方法產(chǎn)品具備良好的組織相容性，所有患者真皮植入處生長良好，沒有發(fā)現(xiàn)局部紅腫、溢出膿性分泌物現(xiàn)象，后續(xù)亦未發(fā)生排異反應(yīng)。

本發(fā)明產(chǎn)品適宜各種肛瘺患者的治療，尤其適宜嚴(yán)重肛瘺患者的治療，如以下情況：(1)瘺管較長，直接切開易造成肛門變形和愈合時(shí)間延長的患者；(2)特別適合瘺管管腔寬大，瘺壁自然愈合緩慢的患者；(3)瘺道彎曲患者。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例5中脫細(xì)胞異體真皮充填修復(fù)的真皮填塞法(試驗(yàn)組)與傳統(tǒng)切開法的標(biāo)準(zhǔn)治療方案(對(duì)照組)的創(chuàng)面愈合效果分析結(jié)果。具體為試驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)后14天(d14)、術(shù)后21天(d21)、術(shù)后3個(gè)月(m3)的生存曲線進(jìn)行比較，結(jié)果顯示術(shù)后主要訪視點(diǎn)兩組愈合率分別為：圖1A所示的術(shù)后14天(試驗(yàn)組6.90％，對(duì)照組3.33％)、圖1B所示的術(shù)后21天(試驗(yàn)組75.86％，對(duì)照組16.67％)、圖1C所示的術(shù)后3個(gè)月(試驗(yàn)組100％，對(duì)照組96.67％)；采用Log-rank檢驗(yàn)，第二周的兩組生存曲線無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第三周和第3個(gè)月的兩組生存曲線有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，試驗(yàn)組的生存曲線高于對(duì)照組，即試驗(yàn)組療法優(yōu)于對(duì)照組療法。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例5中脫細(xì)胞異體真皮充填修復(fù)的真皮填塞法(試驗(yàn)組)與傳統(tǒng)切開法的標(biāo)準(zhǔn)治療方案(對(duì)照組)的瘢痕及肛門變形情況分析結(jié)果。圖2A顯示試驗(yàn)組手術(shù)切開當(dāng)時(shí)瘺道切口及走向，可清楚看到瘺道較長；圖2B顯示試驗(yàn)組長瘺道使用真皮可幫助愈合而不用切開，預(yù)后良好，無瘢痕和變形；圖2C顯示對(duì)照組傳統(tǒng)切開的大創(chuàng)面，瘺道全部打開創(chuàng)傷大且愈合困難。結(jié)果顯示試驗(yàn)組采用真皮治療肛瘺，可以有效減少瘢痕，沒有明顯的肛門變形，由于填塞真皮后加速愈合，從而保證了肛瘺治愈的穩(wěn)定性。同時(shí)，試驗(yàn)組由于切開范圍小，避免了對(duì)照組瘺道全部切開的大創(chuàng)面，而這種大創(chuàng)面的愈合是極難恢復(fù)的。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例5中脫細(xì)胞異體真皮充填修復(fù)的真皮填塞法(試驗(yàn)組)與傳統(tǒng)切開法的標(biāo)準(zhǔn)治療方案(對(duì)照組)的術(shù)后疼痛、控便能力、換藥時(shí)間及影響工作時(shí)間等肛瘺相關(guān)癥狀的分析結(jié)果。圖3A是分值與癥狀關(guān)系圖，得分越低說明術(shù)后相關(guān)癥狀越輕，反之則差；總體分值越接近“0”，術(shù)后癥狀對(duì)日常生活造成的影響越小。臨床試驗(yàn)顯示，在術(shù)后1周、術(shù)后14天、21天和3個(gè)月的訪視中，試驗(yàn)組與對(duì)照組的綜合評(píng)分有顯著差異，各訪視點(diǎn)兩組平均分值比較如圖3B所示，能夠看出，試驗(yàn)組術(shù)后的綜合得分顯著低于對(duì)照組，且在術(shù)后第21天的隨訪結(jié)束時(shí)試驗(yàn)組所有病例得分都趨于零；提示采用真皮治療后，肛瘺相關(guān)癥狀要顯著輕于對(duì)照組。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例6中脫細(xì)胞異體真皮充填修復(fù)的真皮填塞法的臨床實(shí)例一。圖4A為患者術(shù)前創(chuàng)面；圖4B為術(shù)中探查及形成切口，術(shù)后次日創(chuàng)面；圖4C為術(shù)后14天愈合，21天創(chuàng)面痕跡；圖4D顯示術(shù)后3月瘢痕不明顯。結(jié)果顯示，該患者術(shù)后21天觀察創(chuàng)面愈合良好，無肛門變形，無周圍組織和全身的反應(yīng)，患者肛周功能恢復(fù)良好。術(shù)后3個(gè)月隨訪，傷口完全愈合，無明顯瘢痕、無肛門變形，手術(shù)區(qū)域與周圍組織已無明顯差別。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例6中脫細(xì)胞異體真皮充填修復(fù)的真皮填塞法的臨床實(shí)例二。圖5A為患者術(shù)前探查，截石位7點(diǎn)距肛緣3cm處可見外口，瘺道長約4cm；圖5B為患者在腰麻下行脫細(xì)胞異體真皮肛瘺填塞術(shù)；圖5C顯示術(shù)后3周創(chuàng)面愈合良好，無排異；圖5D顯示術(shù)后3月與周圍組織已無明顯差別。結(jié)果顯示，該患者術(shù)后21天觀察創(chuàng)面愈合良好，無肛門變形，無周圍組織和全身的反應(yīng)，患者肛周功能恢復(fù)良好。術(shù)后3個(gè)月隨訪，傷口完全愈合，無瘢痕、變形情況，手術(shù)創(chuàng)面與周圍組織已無明顯差別。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的制備方法

本發(fā)明提供一種脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的制備方法，具體的，優(yōu)選制備實(shí)施例包括按順序進(jìn)行下列步驟：

將原料投入到0.2％胰蛋白酶-dispase酶溶液(w/v)浸泡振蕩，其中，胰蛋白酶與dispase酶的質(zhì)量比是2:1，用PBS緩沖溶液調(diào)pH值至7.4，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,浸泡4小時(shí)，即得半成品A。

將半成品A投入盛有含有表面活性劑和高滲鹽溶液的容器中，超聲浸泡，得半成品B。超聲浸泡條件為：40KHz，220W，超聲6分鐘，浸泡3小時(shí)，重復(fù)3次；含有表面活性劑和高滲鹽溶液的配方是含有0.2g/L聚乙二醇與SDS其中，聚乙二醇選擇分子量為1500，聚乙二醇與SDS的質(zhì)量比為60:40，高滲鹽為50mM tris-HCl，1M氯化鈉，10mM EDTA。

將半成品B取出，投入盛有生理鹽水溶液的容器中，振蕩，每振蕩2小時(shí)，更換生理鹽水溶液一次，共振蕩4次，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,得半成品C。

將C投入盛有交聯(lián)劑溶液的容器中，浸泡4小時(shí)，交聯(lián)劑為京尼平與1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，京尼平與1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺的質(zhì)量比為5:1，交聯(lián)劑與異體皮原料質(zhì)量比為0.8：1，浸泡5小時(shí),得半成品D。

將D取出，投入另一盛有生理鹽水溶液容器中5℃浸泡56小時(shí)，每隔8小時(shí)換一次生理鹽水溶液，即得半成品E。

將半成品E取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，25℃浸泡4小時(shí)，得半成品F，DNA水解酶溶液的濃度是5g/L，用PBS緩沖溶液調(diào)pH至7.2。

將半成品F取出，投入盛有生理鹽水溶液的容器中，振蕩，每振蕩2小時(shí)，更換生理鹽水溶液一次，共振蕩3次，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,得半成品G。

將半成品G取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于5℃條件下浸泡3次，每次浸泡2.5小時(shí)，將處理后的半成品G取出，投入生理鹽水溶液中，即得半成品H，氨基酸溶液的濃度為1.5g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸按照3.3:1.1:1.3：0.96:0.07質(zhì)量比配制。

將半成品H取出裝入包裝袋中，鋪平，封口，進(jìn)行鈷-60照射，照射劑量為20-30kGy,取出，終得成品I。

實(shí)施例2脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的制備方法

本發(fā)明提供一種脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的制備方法，具體的，優(yōu)選制備實(shí)施例包括按順序進(jìn)行下列步驟：

將原料投入到0.3％胰蛋白酶-木瓜蛋白酶溶液(w/v)，浸泡振蕩，其中，胰蛋白酶與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比是2.5:1，用PBS緩沖溶液調(diào)pH值至7.2，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,浸泡4小時(shí)，即得半成品A。

將半成品A投入盛有含有表面活性劑和高滲鹽溶液的容器中，超聲浸泡，得半成品B。超聲浸泡條件為：50KHz，220W，超聲5分鐘，浸泡2小時(shí)，重復(fù)4次；含有表面活性劑和高滲鹽溶液的配方是含有0.2g/L聚乙二醇與Triton X-100其中，聚乙二醇選擇分子量為1000，聚乙二醇與Triton X-100的質(zhì)量比為50:50，高滲鹽為50mM tris-HCl，1M氯化鈉，10mM EDTA。

將半成品B取出，投入盛有生理鹽水溶液的容器中，振蕩，每振蕩2小時(shí)，更換生理鹽水溶液一次，共振蕩4次，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,得半成品C。

將C投入盛有交聯(lián)劑溶液的容器中，浸泡4小時(shí)，交聯(lián)劑為京尼平與N-羥基丁二酰亞胺，京尼平與N-羥基丁二酰亞胺的質(zhì)量比為6:1，交聯(lián)劑與異體皮原料質(zhì)量比為0.6：1，浸泡5小時(shí),得半成品D。

將D取出，投入另一盛有生理鹽水溶液容器中5℃浸泡56小時(shí)，每隔8小時(shí)換一次生理鹽水溶液，即得半成品E。

將半成品E取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，20℃浸泡4小時(shí)，得半成品F，DNA水解酶溶液的濃度是6g/L，用PBS緩沖溶液調(diào)pH至7.2。

將半成品F取出，投入盛有生理鹽水溶液的容器中，振蕩，每振蕩2小時(shí)，更換生理鹽水溶液一次，共振蕩3次，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,得半成品G。

將半成品G取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于4℃條件下浸泡3次，每次浸泡3小時(shí)，將處理后的半成品G取出，投入生理鹽水溶液中，即得半成品H，氨基酸溶液的濃度為1.5g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸按照4:1.3:1.0：1.16:0.08質(zhì)量比配制。

將半成品H取出裝入包裝袋中，鋪平，封口，進(jìn)行鈷-60照射，照射劑量為20-30kGy,取出，終得成品I。

實(shí)施例3脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的制備方法

本發(fā)明提供一種脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的制備方法，具體的，優(yōu)選制備實(shí)施例包括按順序進(jìn)行下列步驟：

將原料投入到0.2％胰蛋白酶與菠蘿蛋白酶溶液(w/v)浸泡振蕩，其中，胰蛋白酶與菠蘿蛋白酶的質(zhì)量比為1:1，用PBS緩沖溶液調(diào)pH值至7.4，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,浸泡4小時(shí)，即得半成品A。

將半成品A投入盛有含有表面活性劑和高滲鹽溶液的容器中，超聲浸泡，得半成品B。超聲浸泡條件為：60KHz，220W，超聲8分鐘，浸泡3小時(shí)，重復(fù)2次；含有表面活性劑和高滲鹽溶液的配方是含有0.2g/L聚乙二醇與SDS其中，聚乙二醇選擇分子量為2000，聚乙二醇與SDS的質(zhì)量比為60:40，高滲鹽為50mM tris-HCl，1M氯化鈉，10mM EDTA。

將半成品B取出，投入盛有生理鹽水溶液的容器中，振蕩，每振蕩2小時(shí)，更換生理鹽水溶液一次，共振蕩4次，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,得半成品C。

將C投入盛有交聯(lián)劑溶液的容器中，浸泡4小時(shí)，交聯(lián)劑為京尼平與戊二醛，京尼平與戊二醛的質(zhì)量比為3:1，交聯(lián)劑與異體皮原料質(zhì)量比為0.9：1，浸泡4小時(shí),得半成品D。

將D取出，投入另一盛有生理鹽水溶液容器中5℃浸泡64小時(shí)，每隔8小時(shí)換一次生理鹽水溶液，即得半成品E。

將半成品E取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，25℃浸泡4小時(shí)，得半成品F，DNA水解酶溶液的濃度是5g/L，用PBS緩沖溶液調(diào)pH至7.2。

將半成品F取出，投入盛有生理鹽水溶液的容器中，振蕩，每振蕩2小時(shí)，更換生理鹽水溶液一次，共振蕩3次，振蕩轉(zhuǎn)速為100rpm,得半成品G。

將半成品G取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于5℃條件下浸泡3次，每次浸泡2.5小時(shí)，將處理后的半成品G取出，投入生理鹽水溶液中，即得半成品H，氨基酸溶液的濃度為2g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸按照3.6:1.2:1.2：1.0:0.07質(zhì)量比配制。

將半成品H取出裝入包裝袋中，鋪平，封口，進(jìn)行鈷-60照射，照射劑量為20-30kGy,取出，終得成品I。

實(shí)施例4脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的生物學(xué)性能檢測

對(duì)實(shí)施例1-3制備獲得的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的機(jī)械特性等生物學(xué)性能進(jìn)行測試，性能指標(biāo)包括拉伸強(qiáng)度、縫合強(qiáng)度、拉伸延長率、含水量、DNA殘留量，具體檢測結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，本發(fā)明產(chǎn)品韌性和彈性良好、便于縫合、牽拉，能夠滿足肛瘺治療需要。

表1脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)檢測結(jié)果

注：“-”表示沒有數(shù)據(jù)。

實(shí)施例5脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)用于臨床填充治療肛瘺

將前述實(shí)施例1-3制備的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)制備成肛瘺栓用于臨床治療肛瘺。

1.臨床一般資料

選擇確診肛瘺并且肛緣外瘺管長度在3cm-6cm范圍內(nèi)，需實(shí)施手術(shù)治療、符合入組條件的患者共60例，包括男44例，女16例，年齡22-62歲。其中：

試驗(yàn)組30例；對(duì)照組30例。試驗(yàn)組1例患者因在手術(shù)探查過程中瘺道完全切開，不適宜進(jìn)行脫細(xì)胞異體真皮植入，予以剔除；實(shí)際總有效病例為59例。

2.臨床試驗(yàn)方法

2.1試驗(yàn)方法

(1)研究方法

因此，本試驗(yàn)采用多中心、隨機(jī)、對(duì)照的優(yōu)效性試驗(yàn)設(shè)計(jì)，與公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)治療方案進(jìn)行對(duì)照，觀察應(yīng)用脫細(xì)胞異體真皮治療肛瘺的有效性及安全性。

(2)試驗(yàn)分組及病例分配

本試驗(yàn)在以往臨床證據(jù)的基礎(chǔ)上，按照公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)治療方案(傳統(tǒng)肛瘺切開或切開掛線手術(shù))治療?；诠J(rèn)有效、類同可比的原則，將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的病例作為受試對(duì)象，隨機(jī)分為試驗(yàn)和對(duì)照兩組。對(duì)照組采用標(biāo)準(zhǔn)治療方案(簡稱傳統(tǒng)切開法)。試驗(yàn)組治療方案中對(duì)瘺道未切開部分聯(lián)合應(yīng)用脫細(xì)胞異體真皮充填修復(fù)(簡稱真皮填塞法)。對(duì)照組病例和試驗(yàn)組病例的分配比例為1：1。

(3)樣本量計(jì)算

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：切開掛線術(shù)創(chuàng)面愈合時(shí)間為20.5±2.2，依照優(yōu)效性試驗(yàn)兩組比較均數(shù)的樣本含量估計(jì)方法計(jì)算所得單組所需樣本量為25例，考慮到脫組及失訪因素(按20％計(jì))，單組所需樣本量為30例；試驗(yàn)總樣本量為60例。

2.2倫理學(xué)要求

本臨床試驗(yàn)遵循赫爾辛基宣言和中國有關(guān)臨床試驗(yàn)研究規(guī)范、法規(guī)進(jìn)行。在試驗(yàn)開始之前，經(jīng)各研究單位醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)定該試驗(yàn)方案后實(shí)施。

每一位患者入選本研究前，研究醫(yī)師以書面文字形式向其或其指定代表完整、全面地介紹本研究的目的、程序和可能的風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)期的收益，讓患者知道他們有權(quán)隨時(shí)退出本研究；入選前與每位患者簽署一份知情同意書，并保存于研究檔案中。

3.所采用的統(tǒng)計(jì)方法及評(píng)價(jià)方法

3.1統(tǒng)計(jì)分析方法

統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)集：

(1)全分析集(Full Analysis Set，F(xiàn)AS)人群

FAS是指對(duì)所有經(jīng)隨機(jī)化分組，進(jìn)入試驗(yàn)，至少有1次療效評(píng)定的受試者，構(gòu)成本研究的全分析集人群。

(2)符合方案集(Per-Protocol Set，PPS)人群

PPS是指對(duì)所有符合研究方案、研究期間未使用禁止用藥、完成CRF規(guī)定填寫內(nèi)容、未嚴(yán)重違反試驗(yàn)方案的病例進(jìn)行分析。

(3)安全性(Safety Set，SS)人群

SS是指對(duì)所有經(jīng)隨機(jī)化分組，并進(jìn)行了至少一次安全性評(píng)估的受試者，構(gòu)成本研究的安全性人群。

統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 9.13統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行計(jì)算。

3.2評(píng)價(jià)方法

3.2.1有效性指標(biāo)

主要療效數(shù)據(jù)集為FAS分析人群，同時(shí)也對(duì)療效的PPS人群進(jìn)行分析。

所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P值≤0.05被認(rèn)為所檢驗(yàn)的差別有統(tǒng)計(jì)意義。計(jì)量資料采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)、最大值、最小值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述；計(jì)數(shù)資料或等級(jí)資料采用頻數(shù)(構(gòu)成比)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。計(jì)數(shù)資料的比較用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料的比較用非參數(shù)檢驗(yàn)。

不同治療組各次就診的計(jì)量資料將采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)、最大值、最小值、四分位間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。與篩選期基礎(chǔ)值進(jìn)行比較，采用配對(duì)t檢驗(yàn)或符號(hào)秩和檢驗(yàn)比較組內(nèi)前后差異。兩組治療前后的變化采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

不同治療組各次就診的計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)(構(gòu)成比)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。各組治療前后的變化采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法或非參數(shù)檢驗(yàn)。

3.2.2安全性指標(biāo)

(1)與安全性有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查

對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢查以治療前后交叉表(根據(jù)臨床判斷)的形式列出所有完成的檢查項(xiàng)目，并列出療后異常的檢查項(xiàng)目。

(2)不良事件

試驗(yàn)期間所有不良事件的種類、嚴(yán)重程度及與試驗(yàn)藥物的關(guān)系等將列表描述。不良事件將按全部不良事件、相關(guān)不良事件分類列表給出。

4.臨床評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及隨訪

4.1臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)制定依據(jù)

肛瘺的傳統(tǒng)治療方法是瘺管切除、瘺管切開掛線等手術(shù)方式，其缺點(diǎn)是創(chuàng)傷大、愈合時(shí)間長、肛門功能受損，影響正常的工作和生活。因此，圍繞肛瘺治療存在的問題，我們制定了試驗(yàn)的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)。將創(chuàng)面愈合時(shí)間、術(shù)后外觀及肛瘺相關(guān)癥狀作為臨床試驗(yàn)有效性的評(píng)價(jià)；通過對(duì)血尿常規(guī)、肝腎功能以及創(chuàng)面分泌物和排異反應(yīng)的監(jiān)測，評(píng)價(jià)臨床試驗(yàn)的安全性；同時(shí)試驗(yàn)過程中所使用脫細(xì)胞異體真皮的韌性和彈性，以及能否縫合、牽拉也會(huì)影響材料填塞瘺道后的愈合效果，因此我們增加了對(duì)產(chǎn)品術(shù)中可操作性的評(píng)價(jià)。

4.2有效性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

主要指標(biāo)：創(chuàng)面愈合時(shí)間

次要指標(biāo)：

(1)術(shù)后外觀評(píng)價(jià)：瘢痕長度、肛門變形；

(2)肛瘺相關(guān)癥狀評(píng)價(jià)：疼痛、控便、換藥時(shí)間及影響工作時(shí)間等肛瘺相關(guān)癥狀進(jìn)行觀察，以評(píng)分方式進(jìn)行綜合評(píng)定，對(duì)兩組在各訪視點(diǎn)的總分值及其變化趨勢進(jìn)行比較分析。

4.3安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

(1)術(shù)前一般體檢項(xiàng)目，如血壓、心率、體溫等；

(2)血、尿常規(guī)及肝腎功能檢查，手術(shù)前、手術(shù)后各檢查一次。

(3)記錄試驗(yàn)期間不良反應(yīng)發(fā)生情況，重點(diǎn)觀察：傷口不愈合、感染(分泌物情況：滲出、溢膿)、有無排異等。

4.4產(chǎn)品術(shù)中可操作性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

評(píng)價(jià)脫細(xì)胞異體真皮(簡稱真皮)的韌性和彈性、能夠縫合、牽拉，便于臨床操作；

分為滿意、較滿意、一般、不滿意。

滿意：材料韌性和彈性良好、操作簡單、便于縫合、牽拉；

較滿意：材料韌性和彈性尚可、操作尚可、適合縫合、牽拉；

一般：材料韌性和彈性一般、縫合操作一般；

不滿意：材料韌性和彈性較差、臨床使用可操作性差。

4.5臨床隨訪

根據(jù)臨床治療經(jīng)驗(yàn)，肛瘺切開/切掛線手術(shù)后，創(chuàng)面愈合較長的時(shí)間在30天左右，平均在20天；若利用脫細(xì)胞異體真皮填塞治療，應(yīng)能縮短愈合時(shí)間；因此通常情況下，治療所需的最長周期為一個(gè)月；傷口愈合后，試驗(yàn)設(shè)定的各觀察項(xiàng)目均能完成。盡管脫細(xì)胞異體真皮作為真皮缺損的替代和修復(fù)材料已在臨床使用多年，但尚未在肛瘺手術(shù)中大量使用，因此將臨床隨訪時(shí)間定為3個(gè)月，以使研究數(shù)據(jù)更為完善。

5.臨床試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)共入組受試者60例，試驗(yàn)組30例，對(duì)照組30例；其中試驗(yàn)組1例病人因在手術(shù)過程中發(fā)現(xiàn)不適合入組本試驗(yàn)被剔除(術(shù)中發(fā)現(xiàn)兩瘺管并行，導(dǎo)致瘺道完全切開，不適合真皮填塞，予以剔除)。實(shí)際有效病例為59例，試驗(yàn)組29例，對(duì)照組30例，均完成了全部訪視及療效評(píng)價(jià)。(表2)

表2病例分布情況表

對(duì)入組病例的安全性、有效性進(jìn)行分析比較，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組性別、年齡、身高、體重、過敏史、瘺道總長等項(xiàng)目基線情況進(jìn)行分析比較。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間具有可比性。

以創(chuàng)面愈合時(shí)間、愈合率為主要療效指標(biāo)，以瘢痕長度、肛門變形、肛瘺相關(guān)癥狀、疼痛程度、控便能力、換藥累計(jì)時(shí)間、影響工作時(shí)間等作為次要指標(biāo)，測定數(shù)據(jù)(具體數(shù)據(jù)略)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較。

6.臨床試驗(yàn)效果分析

6.1創(chuàng)面愈合效果分析

肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的快慢直接影響患者的生活質(zhì)量及日常工作，傳統(tǒng)的切開/切開掛線方式是將所發(fā)現(xiàn)的瘺道全部打開，創(chuàng)傷范圍大且患者術(shù)后恢復(fù)周期長；采用真皮填塞瘺道，可有效減少切開范圍、消除了內(nèi)口長時(shí)間開放所致的糞便及細(xì)菌進(jìn)入瘺道導(dǎo)致的感染，可有效縮短愈合時(shí)間。

通過比較兩組愈合時(shí)間，試驗(yàn)組10～40(19.6±5.7)天，對(duì)照組18～56(26.2±8.4)天，試驗(yàn)組比對(duì)照組短6.6天，其95％可信區(qū)間為(-10.3665，-2.8059)；采用雙側(cè)T檢驗(yàn)，P＝0.001，二者具有顯著差異，說明采用真皮填塞瘺道可明顯縮短愈合時(shí)間。

分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)后14天(d14)、術(shù)后21天(d21)、術(shù)后3個(gè)月(m3)的生存曲線進(jìn)行比較，如圖1A-C所示。術(shù)后主要訪視點(diǎn)兩組愈合率分別為：術(shù)后14天(試驗(yàn)組6.90％，對(duì)照組3.33％)、術(shù)后21天(試驗(yàn)組75.86％，對(duì)照組16.67％)、術(shù)后3個(gè)月(試驗(yàn)組100％，對(duì)照組96.67％)；采用Log-rank檢驗(yàn)，第二周的兩組生存曲線無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第三周和第3個(gè)月的兩組生存曲線有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，試驗(yàn)組的生存曲線高于對(duì)照組，即試驗(yàn)組療法優(yōu)于對(duì)照組療法。

6.2瘢痕及肛門變形情況分析

對(duì)比兩組術(shù)后3個(gè)月(試驗(yàn)組0.43±0.18cm，對(duì)照組1.89±1.31cm)的瘢痕長度，采用雙側(cè)T檢驗(yàn)，P值為0.001，說明二者之間有顯著差異。

對(duì)比兩組術(shù)后3個(gè)月肛門變形情況，試驗(yàn)組無變形病例28例(96.6％)，對(duì)照組無變形病例16例(53.3％)，結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)，得χ2＝14.53，P＝0.000，顯示二者具有顯著差異。

上述結(jié)果提示，采用真皮治療肛瘺，可以有效減少瘢痕，沒有明顯的肛門變形，主要是由于填塞真皮后加速愈合，從而保證了肛瘺治愈的穩(wěn)定性。同時(shí)，由于切開范圍小(圖2A、圖2B)，避免了瘺道全部切開的大創(chuàng)面，而這種大創(chuàng)面的愈合是極難恢復(fù)的(圖2C)。

6.3肛瘺相關(guān)癥狀分析

對(duì)術(shù)后疼痛、控便能力、換藥時(shí)間及影響工作時(shí)間等肛瘺相關(guān)癥狀進(jìn)行觀察，以評(píng)分方式進(jìn)行綜合評(píng)定，對(duì)兩組在各訪視點(diǎn)的總分值及其變化趨勢進(jìn)行比較分析，分值與癥狀的關(guān)系如圖3A所示。圖3A中得分越低說明術(shù)后相關(guān)癥狀越輕，反之則差；總體分值越接近“0”，術(shù)后癥狀對(duì)日常生活造成的影響越小。

臨床試驗(yàn)顯示，在術(shù)后1周、術(shù)后14天、21天和3個(gè)月的訪視中，試驗(yàn)組與對(duì)照組的綜合評(píng)分有顯著差異，各訪視點(diǎn)兩組平均分值比較如圖3B所示。通過圖3B可以看出，試驗(yàn)組術(shù)后的綜合得分顯著低于對(duì)照組，且在術(shù)后第21天的隨訪結(jié)束時(shí)試驗(yàn)組所有病例得分都趨于零；提示采用真皮治療后，肛瘺相關(guān)癥狀要顯著輕于對(duì)照組。在術(shù)后1周時(shí)試驗(yàn)組的得分值均在3以內(nèi)，說明術(shù)后恢復(fù)較快，1周時(shí)已基本不影響工作與生活；這為消除病人術(shù)后痛苦、贏得工作時(shí)間創(chuàng)造了條件。

6.4試驗(yàn)器材可操作性及組織相容情況分析

手術(shù)操作過程中，脫細(xì)胞異體真皮質(zhì)地柔軟、有較強(qiáng)的韌性和牽拉性，可以滿足手術(shù)中牽拉、縫合的張力，沒有出現(xiàn)撕裂脫出等現(xiàn)象。

所有患者真皮植入處生長良好，沒有發(fā)現(xiàn)局部紅腫、溢出膿性分泌物現(xiàn)象，隨訪結(jié)束時(shí)沒有出現(xiàn)排異反應(yīng)，說明組織相容性良好。

6.5安全性分析

本研究共納入病例60例(試驗(yàn)組30例、對(duì)照組30例)；試驗(yàn)組1例患者(隨機(jī)編號(hào)18)因在手術(shù)過程中瘺道完全切開，不適宜進(jìn)行脫細(xì)胞異體真皮植入，在全分析集(FAS)人群和符合方案集(PPS)人群中予以剔除；在安全性(SS)人群中予以保留，安全性分析集共包含病例60例。試驗(yàn)期間未發(fā)生與植入材料相關(guān)的安全性風(fēng)險(xiǎn)，且真皮植入后能夠顯著加快組織愈合并具有良好的組織相容性，可證明脫細(xì)胞異體真皮使用的安全性。

7.臨床試驗(yàn)結(jié)論

經(jīng)過對(duì)59例臨床確診的肛瘺患者進(jìn)行的隨機(jī)對(duì)照臨床研究，通過使用脫細(xì)胞異體真皮填塞瘺道與傳統(tǒng)的切開/切開掛線手術(shù)方法治療肛瘺療效比較，得出如下研究結(jié)論：

①療效可靠并且安全；

②真皮填塞組的創(chuàng)面愈合時(shí)間尤其是影響工作和擾亂生活的時(shí)間明顯低于對(duì)照組；

③真皮填塞組無明顯肛門變形，瘢痕長度較對(duì)照組明顯縮短，提高了患者的生活質(zhì)量；

④可以明顯減輕患者術(shù)后的痛苦，較對(duì)照組術(shù)后大創(chuàng)面的相關(guān)不適癥狀顯著改善；

⑤脫細(xì)胞異體真皮使用方便；材質(zhì)強(qiáng)韌、柔軟，可以滿足手術(shù)中牽拉、縫合的張力；沒有排異、異物刺激等不良反應(yīng)。

本試驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期的試驗(yàn)觀察目的。尤其適合以下情況：(1)瘺管較長，直接切開易造成肛門變形和愈合時(shí)間延長的患者。(2)特別適合瘺管管腔寬大，瘺壁自然愈合緩慢的患者。(3)瘺道彎曲患者

實(shí)施例6脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)用于臨床填充治療肛瘺的兩例實(shí)例

將前述實(shí)施例1-3制備的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)用于臨床治療肛瘺具有良好效果，以下示例性給出兩例典型臨床實(shí)例。

病例1：男，59歲。該患者于2005年因肛瘺在二龍路醫(yī)院手術(shù)，后因肛旁反復(fù)破潰流膿，于2011年10月14日入我院治療。?？魄闆r：肛門部視診：肛門發(fā)育正常，可見多處外口破損、紅腫。肛門部指診：可及肛門左側(cè)條索，范圍自2點(diǎn)伸向6點(diǎn)。肛門鏡檢查：未見腫物，未見明確瘺口。經(jīng)術(shù)前常規(guī)血生化檢查符合入選標(biāo)準(zhǔn)，在患者簽署知情同意書后，行肛瘺手術(shù)治療，術(shù)中探查瘺口、探查瘺道，確定瘺道自2點(diǎn)開始，至4點(diǎn)處局部切開，自4點(diǎn)開始，至5點(diǎn)處局部切開，瘺道總長度10cm。對(duì)瘺道采用脫細(xì)胞異體真皮分兩段進(jìn)行填塞治療，使用真皮面積5cm×1cm，術(shù)中使用可吸收縫合線縫合兩段瘺道內(nèi)口并固定真皮。圖4A為術(shù)前創(chuàng)面；圖4B為術(shù)中探查及形成切口，術(shù)后次日創(chuàng)面；圖4C為術(shù)后14天愈合，21天創(chuàng)面痕跡；圖4D顯示術(shù)后3月瘢痕不明顯。結(jié)果顯示，該患者術(shù)后21天觀察創(chuàng)面愈合良好，無肛門變形，無周圍組織和全身的反應(yīng)，患者肛周功能恢復(fù)良好。術(shù)后3個(gè)月隨訪，傷口完全愈合，無明顯瘢痕、無肛門變形，手術(shù)區(qū)域與周圍組織已無明顯差別。

病例2：男，57歲。因“肛旁反復(fù)破潰流膿血6個(gè)月”以“肛瘺”于2012年2月22日收入院治療。?？魄闆r：肛門部視診：肛門發(fā)育正常，截石位7點(diǎn)距肛緣3cm處可見一外口。肛門部指診：外口處皮下可及索條狀硬結(jié)通向肛內(nèi)，輕度壓痛。肛門括約肌功能正常，直腸中下段未及腫物，指套未染血跡。肛門鏡檢查：截石位3、7、11點(diǎn)齒線上直腸黏膜隆起，表面色暗紅，無糜爛及出血點(diǎn)。經(jīng)術(shù)前常規(guī)血生化檢查符合入選標(biāo)準(zhǔn)，在患者簽署知情同意書后，行肛瘺手術(shù)治療，探查瘺口、確定瘺道，瘺道長度4cm，對(duì)瘺道采用脫細(xì)胞異體真皮進(jìn)行填塞治療，使用真皮面積4cm×1cm，術(shù)中使用可吸收縫合線縫合瘺道內(nèi)口并固定真皮。圖5A為術(shù)前探查，截石位7點(diǎn)距肛緣3cm處可見外口，瘺道長約4cm；圖5B為患者在腰麻下行脫細(xì)胞異體真皮肛瘺填塞術(shù)；圖5C顯示術(shù)后3周創(chuàng)面愈合良好，無排異；圖5D顯示術(shù)后3月與周圍組織已無明顯差別。結(jié)果顯示，該患者術(shù)后21天觀察創(chuàng)面愈合良好，無肛門變形，無周圍組織和全身的反應(yīng)，患者肛周功能恢復(fù)良好。術(shù)后3個(gè)月隨訪，傷口完全愈合，無瘢痕、變形情況，手術(shù)創(chuàng)面與周圍組織已無明顯差別。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。