本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，發(fā)病率高，在老年人口中十分常見(jiàn)，60歲以上的人群中患病率可達(dá)50％，75歲以上的人群中則達(dá)80％。骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)疼痛常使患者難以忍受，患者發(fā)病后致殘率高。骨關(guān)節(jié)炎常發(fā)生軟骨缺損，但軟骨的自身修復(fù)能力有限，通常可以將軟骨修復(fù)作為骨關(guān)節(jié)炎治療的最重要評(píng)價(jià)指標(biāo)?，F(xiàn)有的治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物能在一定程度上延緩病程、改善患者癥狀，緩解患者疼痛，但不能逆轉(zhuǎn)病理過(guò)程，不能根治骨關(guān)節(jié)炎，且大部分藥物副作用明顯。而外科手術(shù)治療主要通過(guò)關(guān)節(jié)鏡(窺鏡)、開(kāi)放手術(shù)或人工關(guān)節(jié)置換，雖然能暫時(shí)緩解疼痛，但長(zhǎng)遠(yuǎn)效果(10年左右)并不理想。干細(xì)胞等細(xì)胞治療法是目前最有希望徹底解決骨關(guān)節(jié)炎治療的新方法。近十年來(lái)，干細(xì)胞移植治療骨關(guān)節(jié)炎已有大量研究報(bào)道。干細(xì)胞注入骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)后，能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)作用，減少疼痛；分泌抗凋亡因子和抗纖維化因子抑制病情進(jìn)展；分泌TGF-β、BMP-4等因子，促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞軟骨修復(fù)；還能分化為軟骨細(xì)胞幫助修復(fù)軟骨。中國(guó)專(zhuān)利CN105796600A公開(kāi)了使用干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的方法和組合物，該組合物包括間充質(zhì)干細(xì)胞、透明質(zhì)酸或其藥用鹽、氯化鈉和水，雖然其記載了凍存后細(xì)胞存活率較好的有益效果，但是采用該組合物治療骨關(guān)節(jié)炎的效果卻具有一定的缺陷，主要是治療后復(fù)發(fā)率較高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用，使得所述組合物對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有顯著的療效，且治療后復(fù)發(fā)率較低。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組合物，包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、透明質(zhì)酸或其藥用鹽、生理鹽水、人血白蛋白、胰島素生長(zhǎng)因子。針對(duì)現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞制劑在治療骨關(guān)節(jié)炎方面存在復(fù)發(fā)率較高的問(wèn)題，本發(fā)明選用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、透明質(zhì)酸或其藥用鹽、生理鹽水、人血白蛋白、胰島素生長(zhǎng)因子組成新型組合物，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有較為顯著的療效并且復(fù)發(fā)率較低。其中，作為優(yōu)選，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為(1-2)×106個(gè)/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為5-10％，人血白蛋白體積百分比10-15％，胰島素生長(zhǎng)因子體積百分比為5-10％，其余為生理鹽水。在本發(fā)明具體實(shí)施過(guò)程中，所述組合物中各成分組成可任意選擇如下：(1)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為1.5×106個(gè)/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為8％，人血白蛋白體積百分比10％，胰島素生長(zhǎng)因子體積百分比為8％，其余為生理鹽水；(2)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為5％，人血白蛋白體積百分比13％，胰島素生長(zhǎng)因子體積百分比為10％，其余為生理鹽水；(3)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為10％，人血白蛋白體積百分比15％，胰島素生長(zhǎng)因子體積百分比為5％，其余為生理鹽水；本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)可按照常規(guī)方法進(jìn)行，在具體制備時(shí)可采用患者自體脂肪進(jìn)行分離培養(yǎng)，本發(fā)明提供了如下方法：抽取30ml新鮮脂肪，將脂肪轉(zhuǎn)移到無(wú)菌儲(chǔ)液瓶中用等體積PBS劇烈搖晃，靜止分層棄去下層液體，重復(fù)一次；將清洗好的脂肪轉(zhuǎn)移到50ml離心管中補(bǔ)加加PBS至體積50ml，用1500rpm離心5分鐘，離心后用移液管將上層脂肪油和下層液體棄置，再加入等體積的I型膠原酶，蓋上蓋子封口；轉(zhuǎn)移到恒溫震蕩儀中以37度、200轉(zhuǎn)每分進(jìn)行消化，大概30-50分鐘，至脂肪完全消化，再轉(zhuǎn)移到離心機(jī)中以1500rpm離心5分鐘；用移液管吸掉上層脂肪油，倒棄剩余液體，再用40mlPBS重懸細(xì)胞沉淀，繼續(xù)以1500rpm離心5分鐘；倒棄液體，用Lonza無(wú)血清完全培養(yǎng)基重懸，分到3個(gè)10cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿10ml，再在每個(gè)皿中加入EGF調(diào)整后EGF為10ng/ml，放置37度、5％二氧化碳、濕度95％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)2天后，給細(xì)胞換液，每天觀察細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁匯合度達(dá)到80％給細(xì)胞傳代。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞選擇傳代5代以內(nèi)的細(xì)胞。作為優(yōu)選，所述人血白蛋白的濃度為20％。本發(fā)明組合物在治療兔骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)中，破壞的軟骨表層恢復(fù)完好，軟骨正常未發(fā)生空泡樣變性，成熟軟骨細(xì)胞柱狀線恢復(fù)；軟骨含量、TNF-α含量和Mankin評(píng)分結(jié)果與正常組無(wú)顯著差異，表明本發(fā)明組合物對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有顯著的療效。同時(shí)以本發(fā)明所述組合物為試驗(yàn)對(duì)象，以現(xiàn)有專(zhuān)利CN105796600A實(shí)施例8的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組合物為第一組對(duì)照，同時(shí)在其基礎(chǔ)上用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞替換臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞設(shè)置第二組對(duì)照，分別治療按臨床標(biāo)準(zhǔn)劃分為相同程度的骨關(guān)節(jié)炎疾病志愿者，結(jié)果顯示，采用本發(fā)明組合物治療的志愿者，復(fù)發(fā)率只有36％，而另外兩組對(duì)照組的復(fù)發(fā)率均為68％，此外其中一組還有1例無(wú)效?；谏鲜鰞?yōu)異的技術(shù)效果，本發(fā)明提供了所述組合物在制備治療骨關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的應(yīng)用。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明組合物選擇脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、透明質(zhì)酸或其藥用鹽、生理鹽水、人血白蛋白、胰島素生長(zhǎng)因子作為治療骨關(guān)節(jié)炎的成分，組合物組成簡(jiǎn)單，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為自體細(xì)胞，取材不受限制，并且在治療復(fù)發(fā)率上明顯低于其他干細(xì)胞制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1所示為正常兔關(guān)節(jié)石蠟切片圖；圖2所示為骨關(guān)節(jié)炎兔模型關(guān)節(jié)石蠟切片圖；圖3所示為經(jīng)過(guò)本發(fā)明組合物治療后的骨關(guān)節(jié)炎兔模型關(guān)節(jié)石蠟切片圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和應(yīng)用已通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明所述組合物將各組分按照要求的比例輕微振蕩混勻即可獲得所述組合物。在本發(fā)明兔骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)中，脂肪來(lái)源為模型兔自體脂肪，同樣，在骨關(guān)節(jié)炎志愿者臨床治療實(shí)驗(yàn)中，脂肪來(lái)源為志愿者自體脂肪，所用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞均經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物符合要求，實(shí)施方式中采用傳代至第4代的細(xì)胞。以下就本發(fā)明所提供的一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)抽取30ml新鮮脂肪，將脂肪轉(zhuǎn)移到無(wú)菌儲(chǔ)液瓶中用等體積PBS劇烈搖晃，靜止分層棄去下層液體，重復(fù)一次；將清洗好的脂肪轉(zhuǎn)移到50ml離心管中補(bǔ)加加PBS至體積50ml，用1500rpm離心5分鐘，離心后用移液管將上層脂肪油和下層液體棄置，再加入等體積的I型膠原酶，蓋上蓋子封口；轉(zhuǎn)移到恒溫震蕩儀中以37度、200轉(zhuǎn)每分進(jìn)行消化，大概30-50分鐘，至脂肪完全消化，再轉(zhuǎn)移到離心機(jī)中以1500rpm離心5分鐘；用移液管吸掉上層脂肪油，倒棄剩余液體，再用40mlPBS重懸細(xì)胞沉淀，繼續(xù)以1500rpm離心5分鐘；倒棄液體，用Lonza無(wú)血清完全培養(yǎng)基重懸，分到3個(gè)10cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿10ml，再在每個(gè)皿中加入EGF調(diào)整后EGF為10ng/ml，放置37度、5％二氧化碳、濕度95％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)2天后，給細(xì)胞換液，每天觀察細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁匯合度達(dá)到80％給細(xì)胞傳代。實(shí)施例2：本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組合物脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為1.5×106個(gè)/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為8％，人血白蛋白(濃度為20％)體積百分比10％，胰島素生長(zhǎng)因子體積百分比為8％，其余為生理鹽水。實(shí)施例3：本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組合物脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為5％，人血白蛋白(濃度為20％)體積百分比13％，胰島素生長(zhǎng)因子體積百分比為10％，其余為生理鹽水。實(shí)施例4：本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組合物脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為10％，人血白蛋白(濃度為20％)體積百分比15％，胰島素生長(zhǎng)因子體積百分比為5％，其余為生理鹽水。實(shí)施例5：治療兔骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)1、兔骨關(guān)節(jié)炎造模選用健康成年新西蘭大耳白兔，體重5到8千克。將兔后左膝關(guān)節(jié)進(jìn)行前交叉韌帶切斷術(shù)與內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)聯(lián)合造模，右膝作為對(duì)照側(cè)，手術(shù)4周后，病理評(píng)價(jià)骨關(guān)節(jié)炎造模效果。2、兔骨關(guān)節(jié)炎治療在評(píng)價(jià)造模成功后第4周，在超聲引導(dǎo)下使用注射器向患骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)處注射0.4mL組合物(實(shí)施例2組合物)，緩慢推注。3、治療效果評(píng)價(jià)在接受治療后第10周，進(jìn)行檢測(cè)：(1)關(guān)節(jié)病理觀察關(guān)節(jié)去除遠(yuǎn)端股骨和脛骨平臺(tái)后，用10％甲醛固定，樣本脫鈣后，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色。結(jié)果如圖1-圖3所示，正常膝關(guān)節(jié)軟骨表層完好，軟骨細(xì)胞正常(圖1)；對(duì)照組未治療的膝關(guān)節(jié)軟骨表層明顯破壞，剝脫現(xiàn)象明顯，表層軟骨空泡樣變性，成熟軟骨細(xì)胞柱狀線消失，結(jié)構(gòu)破壞明顯(圖2)；經(jīng)細(xì)胞治療后的軟骨，破壞的軟骨表層恢復(fù)完好，軟骨正常未發(fā)生空泡樣變性，成熟軟骨細(xì)胞柱狀線恢復(fù)(圖3)。(2)Mankin評(píng)分關(guān)節(jié)去除遠(yuǎn)端股骨和脛骨平臺(tái)后，用10％甲醛固定，樣本脫鈣后，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色、甲苯胺藍(lán)和番紅O染色。采用Mankin評(píng)分法對(duì)關(guān)節(jié)進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果如表1所示。表1Mankin評(píng)分結(jié)果正常對(duì)照組治療組模型組0.31.55.5(3)ELISA法檢測(cè)TNF-α含量取關(guān)節(jié)液，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α炎性因子表達(dá)，含量檢測(cè)如表2所示。表2ELISA法檢測(cè)TNF-α結(jié)果(單位：μg/ml)天數(shù)正常對(duì)照組治療組模型組第1天303030第20天30100100第40天3035105(4)軟骨總量變化將兔關(guān)節(jié)進(jìn)行核磁共振成像MRI觀察，檢測(cè)關(guān)節(jié)恢復(fù)狀況及軟骨體積。治療10周后關(guān)節(jié)軟骨含量如表3所示。表3軟骨含量(單位：μg)正常對(duì)照組治療組模型組1094根據(jù)上述多項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明組合物對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有顯著的療效。同樣，實(shí)施例3和4組合物進(jìn)行上述試驗(yàn)，與模型組相比，在各方面均得到顯著改善。實(shí)施例6：臨床療效對(duì)比試驗(yàn)招募骨關(guān)節(jié)病志愿者125名，所有志愿者經(jīng)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為同等程度的疾病患者，隨機(jī)平均分成五組，實(shí)驗(yàn)1-3組采用本發(fā)明實(shí)施例2-4組合物，對(duì)照1組采用專(zhuān)利CN105796600A實(shí)施例8的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組合物，對(duì)照2組在對(duì)照1組基礎(chǔ)上采用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，跟蹤6個(gè)月(2個(gè)月注射一次)，無(wú)效、有效以及復(fù)發(fā)判斷參照臨床標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)表4。表4骨關(guān)節(jié)炎志愿者6個(gè)月后治療情況組別無(wú)效有效不復(fù)發(fā)有效復(fù)發(fā)實(shí)驗(yàn)1組0/25，016/25，64％9/25，36％實(shí)驗(yàn)2組0/25，015/25，60％10/25，40％實(shí)驗(yàn)3組0/25，013/25，52％12/25，48％對(duì)照1組0/25，08/25，32％17/25，68％對(duì)照2組1/25，4％7/25，28％17/25，68％由表4可知，采用本發(fā)明組合物治療的志愿者均有效，有效不復(fù)發(fā)率在50％以上，遠(yuǎn)高于兩組對(duì)照；而在有效不復(fù)發(fā)率上，本發(fā)明只有36％，另外兩組對(duì)照組的復(fù)發(fā)率均為68％，此外其中對(duì)照2組還有1例無(wú)效。以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3