本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料領(lǐng)域，具體地說，涉及一種天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrixc,ECM)材料常被用于制成各種外科生物補(bǔ)片，如硬腦膜補(bǔ)片、疝補(bǔ)片、胸膜補(bǔ)片、尿道補(bǔ)片等。常用的細(xì)胞外基質(zhì)材料包括真皮基質(zhì)、小腸黏膜下層、膀胱粘膜下層及心包膜等。這些材料主要有膠原纖維組成，富含生物活性因子且具有特殊的三維孔隙結(jié)構(gòu)，相比其他高分子合成的生物材料，有著更好的生物相容性和促進(jìn)組織修復(fù)再生的作用。但是由天然的細(xì)胞外基質(zhì)材料制成的生物補(bǔ)片過于柔軟，機(jī)械性能差，為手術(shù)操作帶來很多不便；在多種組織的修復(fù)上，細(xì)胞外基質(zhì)材料很難實現(xiàn)降解速度與組織再生速度相一致，往往因材料降解過快而導(dǎo)致移植失敗。目前用來提高細(xì)胞外基質(zhì)材料機(jī)械強(qiáng)度及延長降解時間的方法通常是對材料進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)處理，常用的化學(xué)交聯(lián)劑有戊二醛、京尼平、甲醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)等，化學(xué)交聯(lián)是目前比較常用的方法，具有反應(yīng)速度快及可控性強(qiáng)等優(yōu)勢，但是一般的交聯(lián)試劑都具有很大毒性，如果去除不徹底會對產(chǎn)品的安全性帶來更多的隱患，降解產(chǎn)物一般也會有一定的細(xì)胞毒性。另外還可以對多層細(xì)胞外基質(zhì)材料進(jìn)行加壓干燥來增強(qiáng)材料穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度和延長降解時間，但是材料復(fù)水后容易再次分層，無法長期維持機(jī)械強(qiáng)度并提高降解時間。熱交聯(lián)處理(dehydrothermaltreatment,DHT)是一種物理交聯(lián)方法，通過對膠原基質(zhì)材料進(jìn)行熱處理，能使其中的親水自由基團(tuán)氨基和羧基發(fā)生分子內(nèi)脫水縮合形成穩(wěn)定的縮氨酸鍵。這樣材料層內(nèi)與層間分子鏈相互連接成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使材料的整體形態(tài)更加穩(wěn)定。此處理方法，可以在不添加任何有毒化學(xué)交聯(lián)劑的基礎(chǔ)上實現(xiàn)材料性能的改善。但是，一些經(jīng)過特定工藝處理的細(xì)胞外基質(zhì)材料自由親水基團(tuán)暴露并不充分，導(dǎo)致單獨使用熱交聯(lián)技術(shù)只在一定程度上實現(xiàn)了材料層層之間的加固，而對熱處理后材料的親水性、降解時間和力學(xué)強(qiáng)度影響并不大。因此，為進(jìn)一步提高細(xì)胞外基質(zhì)材料的降解時間，并改善材料的整體性能，亟待開發(fā)新的技術(shù)手段。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種基于凍干和熱交聯(lián)聯(lián)用技術(shù)制備天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種制備天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜的方法，以經(jīng)過去抗原處理的天然細(xì)胞外基質(zhì)為材料，將2-10層規(guī)格相同的單層材料交錯或平行疊加放置，使用夾具使各層緊密貼合，在真空條件下凍干處理，然后放入真空烘箱中進(jìn)行熱交聯(lián)處理，然后取下夾具，得到的細(xì)胞外基質(zhì)生物膜經(jīng)鈷60輻照或環(huán)氧乙烷滅菌，即得。所述去抗原處理的具體操作如下：取新鮮的天然細(xì)胞外基質(zhì)，依次經(jīng)消毒、機(jī)械剝除、脫細(xì)胞和去垢處理。前述的方法，對新鮮的天然細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行消毒處理，將新鮮的天然細(xì)胞外基質(zhì)在消毒劑中浸泡45-65min(優(yōu)選60min)，每隔10min攪拌一次；然后用純化水清洗上述消毒后的天然細(xì)胞外基質(zhì)直至pH為6.0-7.0。所述消毒劑為雙氧水、過氧乙酸溶液或乙醇等中的至少一種。優(yōu)選過氧乙酸溶液，濃度為0.5-1％，最佳濃度為0.5％。前述的方法，天然細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)消毒后進(jìn)行機(jī)械剝除，然后置于脫細(xì)胞液中浸泡10-15min(優(yōu)選10min)，然后于水中浸泡，并用水沖洗進(jìn)行去垢處理。所述脫細(xì)胞液為高滲鹽溶液、SDS溶液、堿溶液或酶液。優(yōu)選堿溶液，包括氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈉或氨水溶液；更優(yōu)選氫氧化鈉溶液，濃度為0.01-0.5M，最佳濃度為0.05M。本發(fā)明所述天然細(xì)胞外基質(zhì)來自于同種異體或異種生物的組織材料，包括牛真皮基質(zhì)、牛心包基質(zhì)、牛腹膜基質(zhì)、豬膀胱粘膜下層基質(zhì)、豬小腸粘膜下層基質(zhì)、豬腹膜基質(zhì)、人真皮基質(zhì)；優(yōu)選豬小腸粘膜下層基質(zhì)等。前述的方法，將上述天然細(xì)胞外基質(zhì)在不銹鋼板上鋪平重疊，將4層規(guī)格相同的單個材料交錯或平行疊加放置，用夾具夾緊。前述的方法，真空條件下凍干處理具體操作如下：在-40～-80℃條件下預(yù)凍2-6h，然后進(jìn)行真空干燥處理，干燥時間16-24h，最終溫度上升到4-20℃。優(yōu)選-80℃預(yù)凍4h。前述的方法，熱交聯(lián)處理具體操作如下：凍干的材料在真空烘箱中熱處理1-8h，真空度≤100Pa，溫度為100-140℃(優(yōu)選100-120℃)。更優(yōu)選120℃熱處理4h。本發(fā)明還提供按上述方法制備的天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明首先對去抗原的多層細(xì)胞外基質(zhì)材料進(jìn)行冷凍干燥，再通過熱交聯(lián)處理，來提高其復(fù)水穩(wěn)定性、疏水性、力學(xué)強(qiáng)度并延長降解時間。相對于非冷凍干燥處理的材料，凍干處理后可以使材料更加疏松多孔，膠原基質(zhì)中的自由水及結(jié)合水含量降低，暴露出更多的自由羧基和氨基，將材料再進(jìn)行熱交聯(lián)處理后，大量的自由親水性基團(tuán)氨基和羧基發(fā)生分子內(nèi)脫水縮合形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵。通過冷凍干燥和熱交聯(lián)聯(lián)合處理后的多層細(xì)胞外基質(zhì)材料，不但總體上維持了穩(wěn)定的分子空間結(jié)構(gòu)，并在很大程度上加固了原有的三維空間結(jié)構(gòu)，消除了更多的親水性基團(tuán)，復(fù)水穩(wěn)定性和疏水性明顯增加，體內(nèi)降解時間變長，機(jī)械強(qiáng)度變大，可應(yīng)用于長時間組織隔離和應(yīng)力性組織修復(fù)的手術(shù)上。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例9中天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜的復(fù)水測試結(jié)果；a.熱處理前；b.熱處理后。圖2為本發(fā)明實施例10中天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜的疏水性測試結(jié)果；a.未經(jīng)過熱處理；b.熱處理。圖3為本發(fā)明實施例11中天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜的生物降解時間測試結(jié)果；a、b、c、d分別為熱處理的生物膜在1周、3周、8周及12周的HE染色圖，e、f、g、h分別為未經(jīng)過熱處理的生物膜在1周、3周、8周及12周的HE染色圖。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其制備方法肉聯(lián)廠采購新鮮豬小腸1副，前處理清洗去除腸內(nèi)食糜，截成長度為1米左右的腸段；配制濃度為0.5％的過氧乙酸溶液3L，將上述腸段放入過氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min攪拌一次；清洗上述消毒后的腸段5-8次直到pH為6.0-7.0為止；用剝腸機(jī)將腸段剝離腸內(nèi)組織得到小腸粘膜下層；配制濃度為0.05M的氫氧化鈉溶液，將上述小腸粘膜下層放入堿溶液浸泡10min，然后純化水浸泡10min，反復(fù)3次；將上述小腸粘膜下層用純化水重復(fù)清洗10次；將清洗后小腸粘膜下層進(jìn)行重疊鋪4層，夾具夾緊，凍干(在-80℃條件下預(yù)凍4h，然后進(jìn)行真空干燥處理，干燥時間20h，最終溫度上升到15℃)；將凍干后得到的生物膜放入真空烘箱中熱處理4h，溫度為120℃，真空度為100Pa；然后取下夾具，進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，封裝保存。實施例2天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其制備方法肉聯(lián)廠采購新鮮豬小腸1副，前處理清洗去除腸內(nèi)食糜，截成長度為1米左右的腸段；配制濃度為0.5％的過氧乙酸溶液3L，將上述腸段放入過氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min攪拌一次；清洗上述消毒后的腸段5-8次直到pH為6.0-7.0為止；用剝腸機(jī)將腸段剝離腸內(nèi)組織得到小腸粘膜下層；配制濃度為0.25％的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，將上述小腸粘膜下層放入SDS溶液浸泡10min，反復(fù)4次；將上述小腸粘膜下層用純化水重復(fù)清洗10次；將清洗后小腸粘膜下層進(jìn)行重疊鋪4層，夾具夾緊，凍干(在-40℃條件下預(yù)凍6h，然后進(jìn)行真空干燥處理，干燥時間16h，最終溫度上升到4℃)；將凍干后得到的生物膜放入真空烘箱中熱處理4h，溫度為120℃，真空度為100Pa；然后取下夾具，進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，封裝保存。實施例3天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其制備方法肉聯(lián)廠采購新鮮豬小腸1副，前處理清洗去除腸內(nèi)食糜，截成長度為1米左右的腸段；配制濃度為0.5％的過氧乙酸溶液3L，將上述腸段放入過氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min攪拌一次；清洗上述消毒后的腸段5-8次直到pH為6.0-7.0為止；用剝腸機(jī)將腸段剝離腸內(nèi)組織得到小腸粘膜下層；配制濃度為0.05M的氫氧化鈉溶液，將上述小腸粘膜下層放入堿溶液浸泡10min，然后純化水浸泡10min，反復(fù)3次；將上述小腸粘膜下層用純化水重復(fù)清洗10次；將清洗后小腸粘膜下層進(jìn)行重疊鋪4層，夾具夾緊，凍干(在-50℃條件下預(yù)凍5h，然后進(jìn)行真空干燥處理，干燥時間24h，最終溫度上升到20℃)；將凍干后得到的生物膜放入真空烘箱中熱處理4h，溫度為100℃，真空度為100Pa；然后取下夾具，進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，封裝保存。實施例4天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其制備方法肉聯(lián)廠采購新鮮豬小腸1副，前處理清洗去除腸內(nèi)食糜，截成長度為1米左右的腸段；配制濃度為0.5％的過氧乙酸溶液3L，將上述腸段放入過氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min攪拌一次；清洗上述消毒后的腸段5-8次直到pH為6.0-7.0為止；用剝腸機(jī)將腸段剝離腸內(nèi)組織得到小腸粘膜下層；配制濃度為0.05M的氫氧化鈉溶液，將上述小腸粘膜下層放入堿溶液浸泡10min，然后純化水浸泡10min，反復(fù)3次；將上述小腸粘膜下層用純化水重復(fù)清洗10次；將清洗后小腸粘膜下層進(jìn)行重疊鋪2層，夾具夾緊，凍干(在-60℃條件下預(yù)凍2h，然后進(jìn)行真空干燥處理，干燥時間18h，最終溫度上升到4℃)；將凍干后得到的生物膜放入真空烘箱中熱處理8h，溫度為100℃，真空度為100Pa；然后取下夾具，進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，封裝保存。實施例5天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其制備方法肉聯(lián)廠采購新鮮豬小腸1副，前處理清洗去除腸內(nèi)食糜，截成長度為1米左右的腸段；配制濃度為0.5％的過氧乙酸溶液3L，將上述腸段放入過氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min攪拌一次；清洗上述消毒后的腸段5-8次直到pH為6.0-7.0為止；用剝腸機(jī)將腸段剝離腸內(nèi)組織得到小腸粘膜下層；配制濃度為0.05M的氫氧化鈉溶液，將上述小腸粘膜下層放入堿溶液浸泡10min，然后純化水浸泡10min，反復(fù)3次；將上述小腸粘膜下層用純化水重復(fù)清洗10次；將清洗后小腸粘膜下層進(jìn)行重疊鋪6層，夾具夾緊，凍干(在-70℃條件下預(yù)凍3h，然后進(jìn)行真空干燥處理，干燥時間22h，最終溫度上升到10℃)；將凍干后得到的生物膜放入真空烘箱中熱處理8h，溫度為120℃，真空度為100Pa；然后取下夾具，進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，封裝保存。實施例6天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其制備方法肉聯(lián)廠采購新鮮豬小腸1副，前處理清洗去除腸內(nèi)食糜，截成長度為1米左右的腸段；配制濃度為0.5％的過氧乙酸溶液3L，將上述腸段放入過氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min攪拌一次；清洗上述消毒后的腸段5-8次直到pH為6.0-7.0為止；用剝腸機(jī)將腸段剝離腸內(nèi)組織得到小腸粘膜下層；配制濃度為0.05M的氫氧化鈉溶液，將上述小腸粘膜下層放入堿溶液浸泡10min，然后純化水浸泡10min，反復(fù)3次；將上述小腸粘膜下層用純化水重復(fù)清洗10次；將清洗后小腸粘膜下層進(jìn)行重疊鋪4層，夾具夾緊，凍干(在-80℃條件下預(yù)凍4h，然后進(jìn)行真空干燥處理，干燥時間24h，最終溫度上升到4℃)；將凍干后得到的生物膜放入真空烘箱中熱處理4h，溫度為140℃，真空度為100Pa；然后取下夾具，進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，封裝保存。實施例7天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜及其制備方法肉聯(lián)廠采購新鮮豬小腸1副，前處理清洗去除腸內(nèi)食糜，截成長度為1米左右的腸段；配制濃度為0.5％的過氧乙酸溶液3L，將上述腸段放入過氧乙酸溶液中浸泡1h，每隔10min攪拌一次；清洗上述消毒后的腸段5-8次直到pH為6.0-7.0為止；用剝腸機(jī)將腸段剝離腸內(nèi)組織得到小腸粘膜下層；配制濃度為0.05M的氫氧化鈉溶液，將上述小腸粘膜下層放入堿溶液浸泡10min，然后純化水浸泡10min，反復(fù)3次；將上述小腸粘膜下層用純化水重復(fù)清洗10次；將清洗后小腸粘膜下層進(jìn)行重疊鋪4層，夾具夾緊，抽干(設(shè)定溫度為4℃，進(jìn)行真空干燥處理，干燥時間24h，最終溫度上升到10℃)；將抽干后得到的生物膜放入真空烘箱中熱處理4h，溫度為120℃，真空度為100Pa；然后取下夾具，進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，封裝保存。實施例8天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜的體外力學(xué)測試實驗對實施例1、實施例3、實施例6(凍干)和實施例7(非凍干)熱處理前后制備的生物膜進(jìn)行體外拉伸強(qiáng)度測試(參考標(biāo)準(zhǔn)ASTMD882-09)，結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，凍干的生物膜樣品在100～120℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行熱處理，膜的拉伸強(qiáng)度明顯增大(P<0.05)。但是當(dāng)溫度超過此范圍，達(dá)到140℃時，膜的強(qiáng)度會下降，與未處理組相比變化不明顯(P>0.05)，溫度控制在100～120℃為宜；對于非凍干的樣品，熱處理前后拉伸強(qiáng)度變化不明顯(P>0.05)。對實施例2、實施例4和實施例5的熱處理前生物膜樣品進(jìn)行了體外縫合強(qiáng)度測試(參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T3903.43--2008)，結(jié)果見表2。實驗結(jié)果表明，隨著層數(shù)的增加，膜的縫合強(qiáng)度明顯增大(P<0.05)。但對于可吸收降解材料而言，植入量過大將導(dǎo)致其免疫排斥反應(yīng)增大。因此，綜合考慮，既要保證一定的力學(xué)強(qiáng)度，同時又能夠保證較低的免疫風(fēng)險，以4層材料制備的生物膜為宜。表1生物膜拉伸強(qiáng)度測試結(jié)果(單位，牛頓)注：分別與未處理組相比，*P值<0.05；**P值<0.01。表1和表2中數(shù)據(jù)均為4次取樣測試的平均值。表2生物膜縫合強(qiáng)度測試結(jié)果(單位，牛頓)2層材料4層材料6層材料2.00±0.634.32±0.35*7.54±0.95*注：與2層材料相比，*P值<0.05。實施例9天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜的復(fù)水測試實驗實施例1熱交聯(lián)處理前后的生物膜(豬小腸黏膜下層)復(fù)水后狀態(tài)見圖1，a.熱處理前；b.熱處理后。復(fù)水后，未經(jīng)過熱交聯(lián)處理的生物膜質(zhì)軟不易成型，熱交聯(lián)處理的生物膜挺實且原有形狀保持度較高。實施例10天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜的疏水性測試實驗用接觸角測試儀對實施例1中熱處理前后的的生物膜進(jìn)行接觸角測試，結(jié)果見圖2，其中a.未熱處理；b.熱處理。在膜表面滴水，30s后觀察記錄接觸角。實驗結(jié)果表明，未經(jīng)過熱處理的生物膜接觸角變化較大，熱處理的生物膜接觸角變化較小，說明熱處理使材料疏水性增加。接觸角測親疏水性的原理參考許崗等(疏水復(fù)合薄膜接觸角的測定，西安工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，24(1):65-69)。實施例11天然細(xì)胞外基質(zhì)生物膜的生物降解時間測試實驗用新西蘭白兔對實施例1制備的生物膜進(jìn)行肌肉埋植實驗，結(jié)果如圖3所示，圖3中a、b、c、d分別為熱處理的生物膜在1周、3周、8周及12周的HE染色圖，e、f、g、h分別為未經(jīng)過熱處理的生物膜在1周、3周、8周及12周的HE染色圖。實驗結(jié)果表明，進(jìn)行了熱處理的生物膜在12周還未降解，而未經(jīng)過熱處理的生物膜在8周已經(jīng)開始逐步降解，12周完全降解。(箭頭指向為SIS區(qū))本發(fā)明通過對天然細(xì)胞外基質(zhì)材料進(jìn)行一系列的去抗原處理，得到了具有一定三維空間結(jié)構(gòu)的生物膜基質(zhì)材料，并經(jīng)過冷凍干燥和熱交聯(lián)聯(lián)合處理，使膠原基質(zhì)中暴露出的大量親水性基團(tuán)發(fā)生分子內(nèi)脫水縮合，實現(xiàn)了對其空間結(jié)構(gòu)的加固，這樣得到的材料具有更強(qiáng)的復(fù)水穩(wěn)定性，在手術(shù)操作上更方便。同時，材料在體內(nèi)的降解時間變長，疏水性及機(jī)械強(qiáng)度增大，這在隔離防粘連及修復(fù)周期較長的應(yīng)力性組織上具有重要意義。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3