本發(fā)明屬植物有效成分富集技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是公開(kāi)了一種制劑(七葉神安片)的原料三七葉總皂苷的制備方法，該方法是以人參皂苷Rb₃含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)建立的三七葉總皂苷制備方法，所制得三七葉總皂苷用于制備治療心氣不足、心血瘀阻所致的心悸、失眠、胸疼、胸悶的中藥制劑七葉神安片。

背景技術(shù)：

三七葉為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的葉，具有散瘀止血，消腫定痛之功效，常用于吐血，衄血，便血，外傷出血，跌打腫痛，癰腫瘡毒?！侗静菥V目》稱(chēng)三七莖葉“治折傷、跌撲出血，敷之即止，青腫經(jīng)夜即散，余功同根”。經(jīng)現(xiàn)代化學(xué)分析研究證明三七葉中主要成分為人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rb₃、Re，絞股藍(lán)皂苷及三七皂苷Fa、Fc、Fe等。現(xiàn)代藥理研究表明三七葉總皂苷具有降血脂、鎮(zhèn)靜安神、提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體免疫功能及延長(zhǎng)壽命等作用；對(duì)熱刺激和化學(xué)刺激引起的疼痛均有較明顯的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用是通過(guò)提高痛閾，抑制中樞性及外周性致痛因子而產(chǎn)生，作用起效快，維持時(shí)間長(zhǎng)；對(duì)腦血管有收縮作用，并對(duì)血小板聚集呈現(xiàn)抑制作用。

現(xiàn)有工藝：三七葉水煎煮，濃縮液濃縮至適量，加乙醇使含醇量達(dá)60％，靜置使沉淀，取上清液，濾過(guò)，活性炭脫色，脫色液回收乙醇并濃縮至適量，干燥，即得。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有工藝，主要在下述方面進(jìn)行了改進(jìn)：①因水煎煮易煎煮出大量雜質(zhì)，特別是糖分和果膠類(lèi)成分，本發(fā)明通過(guò)考察提取溶媒，增加了70％乙醇對(duì)三七葉進(jìn)行提取，70％乙醇提取的人參皂苷Rb₃的轉(zhuǎn)移率遠(yuǎn)高于水提取。②脫色工藝由現(xiàn)有工藝的活性炭或有機(jī)試劑萃取改進(jìn)為D101大孔樹(shù)脂脫色，與現(xiàn)有工藝相比，在去除脂溶性色素外也能除去水溶性色素，且能在脫色的同時(shí)去除部分糖類(lèi)和果膠，提升三七葉總皂苷中皂苷含量。③兼顧了三七葉總皂苷含量和生產(chǎn)可行性，便于產(chǎn)業(yè)化。

現(xiàn)有技術(shù)研究中有部分方法富集三七葉中的總皂苷成分，所制得的三七葉總皂苷以人參皂苷Rb₃為指標(biāo)計(jì)總皂苷含量大部分在10％以下，有部分技術(shù)所制含量稍高但無(wú)法適應(yīng)大生產(chǎn)需要。另由于三七葉皂苷中含大量色素、糖類(lèi)和果膠，在富集過(guò)程中采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑、活性炭、氧化鋁等進(jìn)行除雜脫色均不理想。我們通過(guò)采用提取加醇沉/水沉的方式，再結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂脫色除雜，多批次制得的三七葉總皂苷以人參皂苷Rb₃為指標(biāo)計(jì)總皂苷含量均高于10％以上，并通過(guò)了相應(yīng)的生產(chǎn)驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)，制備工藝穩(wěn)定可行，從而保證了七葉神安片不同批次產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供三七葉總皂苷的制備方法。

本發(fā)明所述的三七葉總皂苷是中藥制劑七葉神安片的主要原料。

本發(fā)明所述的三七葉總皂苷的制備方法，該方法是以人參皂苷Rb₃含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)建立的三七葉總皂苷制備方法，包括以下步驟：

1)將三七葉粗碎后用溶劑提取，得三七葉提取液，所述溶劑選自水、70％乙醇的任意一種；

2)所得三七葉提取液濃縮汁相對(duì)密度為1.10～1.25(60℃)后，加入乙醇使含醇量至50％～70％或加入3～7倍量水進(jìn)行水沉，靜置分離，取上清液；

3)上清液通過(guò)大孔樹(shù)脂脫色，先用水和低濃度乙醇進(jìn)行洗脫，后用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得。

其中，步驟2)中所述提取液濃度濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.20(60℃)；

其中，步驟2)中所述乙醇的終濃度為55％～65％；

其中，步驟2)中所述水的加入量為5～6倍量；

其中，步驟3)中所述大孔樹(shù)脂為D101大孔樹(shù)脂；

其中，步驟3)中所述水洗用量為3～6BV用量；

其中，步驟3)中所述低濃度乙醇為20％～30％的乙醇；

其中，步驟3)中所述低濃度乙醇用量為3～6BV(柱體積)用量；

其中，步驟3)中所述70％乙醇用量為4～6BV(柱體積)用量；

優(yōu)選的，本發(fā)明所述的三七葉總皂苷的制備方法，包括以下步驟：

取三七葉1kg，加10-20倍量50-90％乙醇回流提取1-3次，每次2-4h，提取液過(guò)濾、合并、濃縮，加4-6倍量水進(jìn)行水沉，靜置，過(guò)濾，濾液濃縮，上D101大孔樹(shù)脂脫色，以6BV水和4BV 25％的乙醇洗脫除雜，最后用5BV 70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到三七葉總皂苷。

或者，

取三七葉1kg，加10-20倍量水回流提取1-3次，每次2-4h，提取液合并濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)50-70％，靜置，過(guò)濾，濾液濃縮，上D101大孔樹(shù)脂脫色，先后用6BV水、4BV 30％乙醇、和5BV 70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到三七葉總皂苷。

進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明所述的三七葉總皂苷的制備方法，包括以下步驟：

取三七葉1kg，加15倍量70％乙醇回流提取2次，每次3h，提取液過(guò)濾、合并、濃縮至相對(duì)密度1.20，加5倍量水進(jìn)行水沉，靜置24h后，過(guò)濾，濾液濃縮至1.07～1.09，上D101大孔樹(shù)脂脫色，徑高比1：8～1：10，以6BV水和4BV 25％的乙醇洗脫除雜，最后用5BV 70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到三七葉總皂苷。

或者，

取三七葉1kg，加15倍量水回流提取2次，每次3h，提取液合并濃縮至相對(duì)密度1.20，加乙醇使含醇量達(dá)60％，靜置24h后，過(guò)濾，濾液濃縮至1.07～1.09，上D101大孔樹(shù)脂脫色，徑高比1：8～1：10，上樣流速為1BV/h，先后用6BV水、4BV 30％乙醇、5BV 70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到三七葉總皂苷。

其中，6BV是指6倍所用D101大孔樹(shù)脂柱體積；

其中，5BV是指5倍所用D101大孔樹(shù)脂柱體積；

其中，4BV是指4倍所用D101大孔樹(shù)脂柱體積；

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供的三七葉總皂苷在治療心氣不足、心血瘀阻所致的心悸、失眠、胸疼、胸悶的中藥制劑七葉神安片中應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供三七葉總皂苷(以人參皂苷Rb₃為指標(biāo)計(jì))的測(cè)定方法。

本發(fā)明所述的測(cè)定方法，包括以下步驟：

照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0512)測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.2％磷酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb₃峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Rb₃對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備 取三七葉總皂苷50mg，精密稱(chēng)定，置10ml量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

本發(fā)明公開(kāi)的三七葉總皂苷制備方法，該方法是在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)改進(jìn)得到的，通過(guò)采用提取加醇沉/水沉的方式，再結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂脫色除雜，多批次制得的三七葉總皂苷以人參皂苷Rb₃為指標(biāo)計(jì)總皂苷含量均高于10％以上，并通過(guò)了相應(yīng)的生產(chǎn)驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)，制備工藝穩(wěn)定可行，從而保證了其制劑產(chǎn)品七葉神安片不同批次產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。同時(shí)，由于三七葉總皂苷是七葉神安片的主要活性成分，本發(fā)明在提高三七葉總皂苷質(zhì)量的同時(shí)，也提高七葉神安片的療效。

附圖說(shuō)明

圖1為三七葉總皂苷制備工藝流程圖，

圖2為D101大孔樹(shù)脂洗脫時(shí)不同溶媒洗脫曲線(xiàn)。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1三七葉總皂苷的制備

取三七葉1kg，加15倍量70％乙醇回流提取2次，每次3h，提取液過(guò)濾、合并、濃縮至相對(duì)密度1.20(60℃)，加5倍量水進(jìn)行水沉，靜置24h后，過(guò)濾，濾液濃縮至1.07～1.09(60℃)，上D101大孔樹(shù)脂脫色，徑高比1：8～1：10，上樣流速為1BV/h，以6BV水(洗脫速度3BV/h)和4BV 25％的乙醇洗脫除雜，最后用5BV 70％乙醇(洗脫速度2BV/h)洗脫，收集70％乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到三七葉總皂苷65.7g，高效液相色譜法測(cè)得人參皂苷Rb₃含量為12.99％。

實(shí)施例2三七葉總皂苷的制備

取三七葉1kg，加15倍量水回流提取2次，每次3h，提取液合并濃縮至相對(duì)密度1.20(60℃)，加乙醇使含醇量達(dá)60％，靜置24h后，過(guò)濾，濾液濃縮至1.07～1.09(60℃)，上D101大孔樹(shù)脂脫色，徑高比1：8～1：10，上樣流速為1BV/h，以6BV水(洗脫速度3BV/h)、4BV 30％乙醇(洗脫速度2BV/h)、5BV 70％乙醇(洗脫速度2BV/h)洗脫，收集70％乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到三七葉總皂苷71g，高效液相色譜法測(cè)得人參皂苷Rb₃含量為11.25％。

實(shí)施例3、D101大孔樹(shù)脂脫色工藝優(yōu)化研究過(guò)程：

1、靜態(tài)飽和吸附量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取已處理好的D101大孔吸附樹(shù)脂10.0g，置于250ml錐形瓶中，準(zhǔn)確加入三七葉上柱液(人參皂苷Rb₃含量已知)200.0ml，充分震蕩后靜置吸附24h，濾過(guò)，取續(xù)濾液10ml，按含量測(cè)定方法測(cè)定人參皂苷Rb₃含量，計(jì)算D101大孔樹(shù)脂在室溫條件下對(duì)人參皂苷Rb₃的飽和吸附量。吸附量＝[(吸附前濃度—吸附后濃度)*吸附液體積]/樹(shù)脂質(zhì)量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2、靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

24h靜態(tài)吸附后的10g D101大孔樹(shù)脂，去凈表面液體，準(zhǔn)確加入70％乙醇100ml，充分振搖后靜置24h，使皂苷充分解吸，濾過(guò)，取續(xù)濾液10ml，按含量測(cè)定方法測(cè)定人參皂苷Rb₃含量，計(jì)算解吸率。解吸率(％)＝(解吸后溶液溶度*解吸后溶液溶度)/[(吸附前濃度—吸附后濃度)*吸附液體積]*100％，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1靜態(tài)飽和吸附量與解吸率的測(cè)定

為了避免生產(chǎn)過(guò)程中造成總皂苷的泄漏損耗，以樹(shù)脂吸附量的80％上樣，即每克D101大孔樹(shù)脂的人參皂苷Rb₃上樣量不得超過(guò)11mg。

3、洗脫溶媒的選擇

采用乙醇-水系統(tǒng)為洗脫液，取經(jīng)三七葉上柱液飽和吸附的D101大孔樹(shù)脂4份，每份50g，先用4BV(柱體積)水洗脫后，再分別以4BV(柱體積)的20％、30％、60％、70％、80％乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，制備成合適的供試品溶液，按人參皂苷Rb₃含量測(cè)定方法測(cè)定含量，計(jì)算不同濃度乙醇的洗脫率。以洗脫溶劑為橫坐標(biāo)，洗脫率為縱坐標(biāo)繪制解析曲線(xiàn)，見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為30％及其以下時(shí)，人參皂苷Rb₃洗脫率很低，當(dāng)乙醇濃度增至70％時(shí)，人參皂苷Rb₃的洗脫率達(dá)90％以上，隨著乙醇濃度再增加，人參皂苷Rb₃洗脫率增長(zhǎng)緩慢，綜合生產(chǎn)成本考慮，故選擇30％及其以下濃度乙醇為除雜洗脫液，70％乙醇為人參皂苷Rb₃的目標(biāo)洗脫溶液。

4、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取三七葉，分為3份，每份1kg，加15倍量70％乙醇回流提取2次，每次3h，提取液過(guò)濾、合并、濃縮至相對(duì)密度1.20(60℃)，加5倍量水進(jìn)行水沉，靜置24h后，過(guò)濾，濾液濃縮至1.07～1.09(60℃)，上D101大孔樹(shù)脂脫色，徑高比1：8～1：10，上樣流速為1BV/h，以6BV水(洗脫速度3BV/h)和4BV 25％的乙醇洗脫除雜，最后用5BV70％乙醇(洗脫速度2BV/h)洗脫，收集70％乙醇洗脫液，濃縮，干燥，測(cè)定三七葉總皂苷中人參皂苷Rb₃的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證結(jié)果表明，三七葉總皂苷制備工藝穩(wěn)定可行，質(zhì)量可控。

實(shí)施例4、本發(fā)明的制備方法與現(xiàn)有方法的比較