本申請屬于藥用植物提取技術，具體涉及一種提取刺五加的方法。
背景技術：
：刺五加為五加科植物。刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms的干燥根和根莖或莖，具有益氣健脾，補腎安神的功效。其性辛、微苦，溫。刺五加注射液為刺五加經提取加工制成的滅菌水溶液，功效為平補肝腎，益精壯骨。用于治療肝腎不足所致的短暫性腦缺血發(fā)作，腦動脈硬化，腦血栓形成，腦栓塞等，亦用于治療冠心病，心絞痛合并神經衰弱和更年期綜合癥等。刺五加中的主要活性成分為黃酮類、皂苷類及多糖類化合物，皂苷類化合物含量最高的是紫丁香苷和刺五加苷E。包括刺五加注射液在內的中藥注射劑，作為現(xiàn)代科學技術發(fā)展而產生的中藥新劑型，克服了傳統(tǒng)中藥生物利用度低、起效慢等缺點，逐漸受到廣大患者的青睞。然而，臨床使用過程中，中藥注射液不良反應的報道日益增多，其安全性也越加受到重視，例如在2008年10月就有報道，中國某藥廠生產的刺五加注射液導致多人死亡，并有多人產生嚴重不良的反應。在一篇申請?zhí)枮镃N20140508745.9的專利申請中，提到一種低毒的刺五加注射液及其制備方法，該刺五加注射液含有以下活性成分：含總黃酮1.8-5.5mg/mL、紫丁香苷0.13-0.70mg/mL和刺五加苷E0.06-0.34mg/mL，鉀離子的數(shù)量≤800μg/mL。制備方法是提取、第一次醇沉、石硫法處理、大孔樹脂吸附、二次醇沉及熱壓超濾。該專利申請中，通過刺五加注射液的制備方法降低注射液中K離子的含量，因為K離子含量比較高時，能夠導致心臟擴張和無力，甚至導致死亡。在一篇申請?zhí)枮镃N201310743674.6的專利申請中，提到一種刺五加提取物、其制備方法和制劑，該制備方法包括以下步驟：(1)用水提取刺五加藥材，提取液經過濃縮，得到刺五加水煎膏；(2)步驟(1)得到的刺五加水煎膏經過一次醇沉、濃縮，得到刺五加提取物一次醇沉膏；(3)步驟(2)得到的刺五加提取物一次醇沉膏用石灰乳和硫酸調節(jié)pH，再靜置、濃縮，得到濃縮膏；(4)步驟(3)得到的濃縮膏經過二次醇沉、濃縮，得到刺五加提取物二次醇沉膏；(5)步驟(4)得到的刺五加提取物二次醇沉膏經稀釋后，經過大孔吸附樹脂吸附、洗脫，洗脫液經過二級超濾，再進行濃縮，得到刺五加提取物。該專利申請中提供的刺五加提取物的制備方法來減少刺五加提取物中的雜質含量，提高刺五加提取物中的有效成分純度。由于現(xiàn)在市場上生產的刺五加注射液都是從刺五加植物中提取精制出來的，所以其本身就是含有多種成分的混合物，這些成分不僅由于加工工藝的不同而不同，而且也跟原料的產地不同而不同，這些成分中不僅含有上述提到的活性成分，如黃酮類、皂苷類及多糖類化合物，還含有許多對治療疾病沒有作用的成分，甚至部分對身體有害的成分，假如患者注射了這些刺五加注射液，很可能產生皮疹、瘙癢、頭暈、頭痛和心悸等癥狀，嚴重了還可能引起心臟驟停，以至死亡等嚴重后果，所以有必要進一步研究刺五加的提純工藝，控制其注射液中的雜質含量，來盡量減少病人的不良反應。技術實現(xiàn)要素：在刺五加中，除了含有黃酮類、皂苷類和多糖類化合物，還含有硬脂酸、丁香苷、蔗糖、胡蘿卜苷、氨基酸、芪類化合物、脂肪酸類成分和酯類化合物等，這些成分經過濃縮以后組成復雜，有的對疾病的治療效果尚未研究清楚，有的成分對于疾病沒有治療效果，在考慮到刺五加注射液療效的同時，盡量減少其副作用的發(fā)生是很有必要的。本發(fā)明的目的是提供一種提取刺五加的方法，該方法能夠顯著提高刺五加的提取效率，并且能夠顯著減少刺五加提取物中的極性和非極性雜質，有效成分得到進一步提純，減少病人皮疹、瘙癢、頭暈、頭痛和心悸等不良反應癥狀，從而增加注射藥物的安全性。本發(fā)明申請的提純工藝是在低溫條件下進行，有效避免高溫引起的藥物變性損失。一種提取刺五加的方法，該方法包括以下步驟：1)粉碎：粉碎刺五加的根和莖，制成粉碎料，稱取粉碎料；2)超聲波提?。撼暡ㄌ崛∏笆雒附饬希@得超聲波提取料；3)過濾：過濾超聲波提取料，之后向濾料中加入5倍體積純化水，繼續(xù)過濾，濾液合并，得到混合濾液；4)醇沉：減壓蒸餾濃縮混合濾液，之后向濃縮液中加入5倍體積95％乙醇，攪拌后室溫靜置4h，過濾得到醇沉濾液，減壓蒸餾回收乙醇，得到醇沉膏；5)大孔樹脂吸附：將醇沉膏用純化水稀釋至黃酮類、皂苷類和多糖類化合物成分含量總和為8-12mg/mL，超聲震蕩后過濾，調節(jié)pH值5-7，組裝大孔樹脂柱進行吸附，上液量流速為2BV/h吸附，收集尾液；然后用60％的乙醇洗脫，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮，得到一次濃縮膏；其中，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的含量使用氣相或液相色譜儀檢測；6)非極性樹脂吸附：使用非極性樹脂對步驟5)中的尾液進行吸附，洗脫液選用己烷或丙酮，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，回收洗脫液，減壓蒸餾得到二次濃縮膏，并將其同一次濃縮膏混合得到濃縮膏；7)色譜柱分離：采用高效液相色譜柱對兩次混合得到的濃縮膏進行分離，柱溫20-35℃，流速為3L/min，同時連接近紅外色譜儀，檢測各個不同時間段的藥物含量成分，并將黃酮類、皂苷類和多糖類化合物萃取濃縮并混合在一起得到刺五加提取物粗品；8)滅菌超濾：調節(jié)刺五加提取物粗品pH到4.5-5.0，加純化水后滅菌過濾后，進行10萬級和3萬級二級超濾，濃縮濾液至密度為1.1-1.25g/mL,即得刺五加提取物。進一步地，步驟1)中粉碎料的粒度為60-100目。進一步地，本申請使用酶液對粉碎料進行酶解。進一步地，酶解條件為溫度：35-45℃，酶液濃度：0.45-0.75g/mL，pH值：4.5-5.5，料液比，1:10-20，時間2-4h。進一步地，酶液中的酶為纖維素酶和果膠酶中的一種或兩種。更進一步地，所述酶液中的酶為纖維素酶和果膠酶，并且纖維素酶和果膠酶的重量比為1：0.5-2。進一步地，步驟2)中超聲波提取條件為溫度30-50℃，料液比：1：10-20，時間：2h，超聲波功率：450-600W。進一步地，大孔樹脂吸附和非極性樹脂吸附的吸附溫度為20-25℃。進一步地，所述的大孔樹脂用的是AB-8樹脂；非極性樹脂用的是D-101樹脂或NKA樹脂。進一步地，步驟7)中的高效液相色譜柱中的流動相A為0.5％甲酸-40％乙腈溶液(V/V)，流動相B為0.5％的甲酸溶液(V/V)。進一步地，步驟7)中，所述的近紅外色譜儀檢測所用的預處理方式為：黃酮類化合物：MSC處理；皂苷類和多糖類化合物：SG平滑處理；近紅外色譜檢測所用的波段為：黃酮類化合物：4000-6000cm-1；皂苷類和多糖類化合物：8000-10000cm-1。其中，提取液中的有效成分：黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的比例為1:0.2-2:0.1-0.3，總有效成分含量為2-8mg/mL。本發(fā)明的有益效果為：1)刺五加的提取效率更高，傳統(tǒng)的提取方法的提取效率大概在30-40％，本發(fā)明的提取效率能提高到60-80％。2)本申請的提取刺五加的方法能夠顯著減少刺五加提取物中的極性和非極性雜質，減少病人因注射該提取物制備的刺五加注射液引起的皮疹、瘙癢、頭暈、頭痛和心悸等癥狀，提高注射藥物的安全性。3)本申請的提取刺五加的方法都是在低溫條件下進行的，降低了由于高溫引起的藥物變性損失。4)本申請的提取刺五加的方法能夠顯著降低刺五加中K+含量，防止因K+含量過高引起的心臟擴張和無力，提高刺五加的用藥安全性。5)本申請的提取刺五加的方法使得在生產過程中，能夠顯著提高刺五加中有效成分的監(jiān)控程度，使得能夠更加集中的提取有效成分，具體實施方式實施例1本申請中，刺五加產自長白山地區(qū)。刺五加的提純工藝步驟如下：1)粉碎：粉碎刺五加的根和莖，制成粉碎料，粉碎料的粒度為60目，稱取粉碎料5kg。2)酶解：使用酶液將前述稱取的粉碎料酶解，其酶解條件為：溫度：30℃，酶液濃度：0.45g/mL，pH值：4.5，料液比，1:10，時間2h，獲得酶解料；所述酶液中的酶為纖維素酶。3)超聲波提?。撼暡ㄌ崛∏笆雒附饬?，獲得超聲波提取料；所述的超聲波提取條件為溫度：30℃，料液比：1：10，時間：2h，超聲波功率：450W。4)過濾：過濾超聲波提取料，之后向濾料中加入5倍體積純化水，繼續(xù)過濾，濾液合并，得到混合濾液；5)醇沉：減壓蒸餾濃縮混合濾液，之后向濃縮液中加入5倍體積95％乙醇，攪拌后室溫靜置4h，過濾得到醇沉濾液，減壓蒸餾回收乙醇，得到醇沉膏；6)大孔樹脂吸附：將醇沉膏用純化水稀釋至黃酮類、皂苷類和多糖類化合物成分含量總和為8mg/mL，超聲震蕩后過濾，調節(jié)pH值為5，組裝大孔樹脂柱進行吸附，上液量流速為2BV/h吸附，收集尾液；然后用60％的乙醇洗脫，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮，得到一次濃縮膏；大孔樹脂用的是AB-8樹脂；其中，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的含量使用液相色譜儀檢測；7)非極性樹脂吸附：使用非極性樹脂對步驟6)中的尾液進行吸附，洗脫液選用己烷或丙酮，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，回收洗脫液，減壓蒸餾得到二次濃縮膏，并將其同一次濃縮膏混合得到濃縮膏；所述的非極性樹脂用的是NKA樹脂；8)色譜柱分離：采用高效液相色譜柱對兩次混合得到的濃縮膏進行分離，柱溫20-35℃，流速為3L/min，同時連接近紅外色譜儀，檢測各個不同時間段的藥物含量成分，其中，近紅外色譜儀檢測所用的預處理方式為：黃酮類化合物：MSC處理；皂苷類和多糖類化合物：SG平滑處理；近紅外色譜檢測所用的波段為：黃酮類化合物：4000-6000cm-1；皂苷類和多糖類化合物：8000-10000cm-1。并將黃酮類、皂苷類和多糖類化合物萃取濃縮并混合在一起得到刺五加提取物粗品；高效液相色譜柱中的流動相A為0.5％甲酸-40％乙腈溶液(V/V)，流動相B為0.5％的甲酸溶液(V/V)；9)滅菌超濾：調節(jié)刺五加提取物粗品pH到4.5，加純化水后滅菌過濾后，進行10萬級和3萬級二級超濾，濃縮濾液至密度為1.1g/mL，即得刺五加提取物。其中，提取液中有效成分，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的比例為1:0.2:0.1，總含量為2mg/mL。流動相A和流動相B的梯度按照表1進行：表1流動相梯度實施例2刺五加的提純工藝步驟如下：1)粉碎：粉碎刺五加的根和莖，制成粉碎料，粉碎料的粒度為100目，稱取粉碎料15kg。2)超聲波提?。撼暡ㄌ崛∏笆雒附饬?，獲得超聲波提取料；所述的超聲波提取條件為溫度：40℃，料液比：1：20，時間：2h，超聲波功率：550W。3)過濾：過濾超聲波提取料，之后向濾料中加入5倍體積純化水，繼續(xù)過濾，濾液合并，得到混合濾液；4)醇沉：減壓蒸餾濃縮混合濾液，之后向濃縮液中加入5倍體積95％乙醇，攪拌后室溫靜置4h，過濾得到醇沉濾液，減壓蒸餾回收乙醇，得到醇沉膏；5)大孔樹脂吸附：將醇沉膏用純化水稀釋至黃酮類、皂苷類和多糖類化合物成分含量總和為12mg/mL，超聲震蕩后過濾，調節(jié)pH值為7，組裝大孔樹脂柱進行吸附，上液量流速為2BV/h吸附，收集尾液；然后用60％的乙醇洗脫，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮，得到一次濃縮膏；大孔樹脂用的是AB-8樹脂；其中，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的含量使用液相色譜儀檢測；6)非極性樹脂吸附：使用非極性樹脂對步驟6)中的尾液進行吸附，洗脫液選用己烷或丙酮，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，回收洗脫液，減壓蒸餾得到二次濃縮膏，并將其同一次濃縮膏混合得到濃縮膏；所述的非極性樹脂用的是NKA樹脂；7)色譜柱分離：采用高效液相色譜柱對兩次混合得到的濃縮膏進行分離，柱溫20-35℃，流速為3L/min，同時連接近紅外色譜儀，檢測各個不同時間段的藥物含量成分，其中，近紅外色譜儀檢測所用的預處理方式為：黃酮類化合物：MSC處理；皂苷類和多糖類化合物：SG平滑處理；近紅外色譜檢測所用的波段為：黃酮類化合物：4000-6000cm-1；皂苷類和多糖類化合物：8000-10000cm-1。并將黃酮類、皂苷類和多糖類化合物萃取濃縮并混合在一起得到刺五加提取物粗品；高效液相色譜柱中的流動相A為0.5％甲酸-40％乙腈溶液(V/V)，流動相B為0.5％的甲酸溶液(V/V)。8)滅菌超濾：調節(jié)刺五加提取物粗品pH到5.0，加純化水后滅菌過濾后，進行10萬級和3萬級二級超濾，濃縮濾液至密度為1.25g/mL,即得刺五加提取物。其中，提取液中有效成分，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的比例為1:2:0.3，總含量為8mg/mL。其中，洗脫流動相A和流動相B的梯度按照表1進行。實施例31)粉碎：粉碎刺五加的根和莖，制成粉碎料，粉碎料的粒度為80目，稱取粉碎料10kg。3)超聲波提?。撼暡ㄌ崛∏笆龇鬯榱?，獲得超聲波提取料；所述的超聲波提取條件為溫度：50℃，料液比：1：20，時間：2h，超聲波功率：600W。4)過濾：過濾超聲波提取料，之后向濾料中加入5倍體積純化水，繼續(xù)過濾，濾液合并，得到混合濾液；5)醇沉：減壓蒸餾濃縮混合濾液，之后向濃縮液中加入5倍體積95％乙醇，攪拌后室溫靜置4h，過濾得到醇沉濾液，減壓蒸餾回收乙醇，得到醇沉膏；6)大孔樹脂吸附：將醇沉膏用純化水稀釋至黃酮類、皂苷類和多糖類化合物成分含量總和為10mg/mL，超聲震蕩后過濾，調節(jié)pH值為7，組裝大孔樹脂柱進行吸附，上液量流速為2BV/h吸附，收集尾液；然后用60％的乙醇洗脫，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮，得到一次濃縮膏；大孔樹脂用的是AB-8樹脂；其中，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的含量使用液相色譜儀檢測；7)非極性樹脂吸附：使用非極性樹脂對步驟6)中的尾液進行吸附，洗脫液選用己烷或丙酮，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，回收洗脫液，減壓蒸餾得到二次濃縮膏，并將其同一次濃縮膏混合得到濃縮膏；所述的非極性樹脂用的是D-101樹脂；8)色譜柱分離：采用高效液相色譜柱對兩次混合得到的濃縮膏進行回流分離，柱溫20-35℃，流速為3L/min，同時連接近紅外色譜儀，檢測各個不同時間段的藥物含量成分，其中，近紅外色譜儀檢測所用的預處理方式為：黃酮類化合物：MSC處理；皂苷類和多糖類化合物：SG平滑處理；近紅外色譜檢測所用的波段為：黃酮類化合物：4000-6000cm-1；皂苷類和多糖類化合物：8000-10000cm-1。并將黃酮類、皂苷類和多糖類化合物萃取濃縮并混合在一起得到刺五加提取物粗品；高效液相色譜柱中的流動相A為0.5％甲酸-40％乙腈溶液(V/V)，流動相B為0.5％的甲酸溶液(V/V)；9)滅菌超濾：調節(jié)刺五加提取物粗品pH到4.8，加純化水后滅菌過濾后，進行10萬級和3萬級二級超濾，濃縮濾液至密度為1.20g/mL,即得刺五加提取物。其中，提取液中有效成分，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的比例為1:0.5:0.2，總含量為6mg/mL。其中，洗脫流動相A和流動相B的梯度按照表1進行。實施例41)粉碎：粉碎刺五加的根和莖，制成粉碎料，粉碎料的粒度為100目，稱取粉碎料12kg。2)酶解：使用酶液將前述稱取的粉碎料酶解，其酶解條件為：溫度：42℃，酶液濃度：0.7g/mL，pH值：4.8，料液比：1:20，時間3h，獲得酶解料。酶液中的酶為纖維素酶和果膠酶中，所述酶液中纖維素酶和果膠酶的比例為1：1。3)超聲波提?。撼暡ㄌ崛∏笆雒附饬?，獲得超聲波提取料；所述的超聲波提取條件為溫度：40℃，料液比：1：20，時間：2h，超聲波功率：550W；4)過濾：過濾超聲波提取料，之后向濾料中加入5倍體積純化水，繼續(xù)過濾，濾液合并，得到混合濾液；5)醇沉：減壓蒸餾濃縮混合濾液，之后向濃縮液中加入5倍體積95％乙醇，攪拌后室溫靜置4h，過濾得到醇沉濾液，減壓蒸餾回收乙醇，得到醇沉膏；6)大孔樹脂吸附：將醇沉膏用純化水稀釋至黃酮類、皂苷類和多糖類化合物成分含量總和為11mg/mL，超聲震蕩后過濾，調節(jié)pH值為6，組裝大孔樹脂柱進行吸附，上液量流速為2BV/h吸附，收集尾液；然后用60％的乙醇洗脫，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮，得到一次濃縮膏；大孔樹脂用的是AB-8樹脂；其中，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的含量使用液相色譜儀檢測；7)非極性樹脂吸附：使用非極性樹脂對步驟6)中的尾液進行吸附，洗脫液選用己烷或丙酮，洗脫液用量為2BV，流速為1.5BV/h，回收洗脫液，減壓蒸餾得到二次濃縮膏，并將其同一次濃縮膏混合得到濃縮膏；所述的非極性樹脂用的是NKA樹脂；8)色譜柱分離：采用高效液相色譜柱對兩次混合得到的濃縮膏進行回流分離，柱溫20-35℃，流速為3L/min，同時連接近紅外色譜儀，檢測各個不同時間段的藥物含量成分，其中，近紅外色譜儀檢測所用的預處理方式為：黃酮類化合物：MSC處理；皂苷類和多糖類化合物：SG平滑處理；近紅外色譜檢測所用的波段為：黃酮類化合物：4000-6000cm-1；皂苷類和多糖類化合物：8000-10000cm-1。并將黃酮類、皂苷類和多糖類化合物萃取濃縮并混合在一起得到刺五加提取物粗品；高效液相色譜柱中的流動相A為0.5％甲酸-40％乙腈溶液(V/V)，流動相B為0.5％的甲酸溶液(V/V)；9)滅菌超濾：調節(jié)刺五加提取物粗品pH到4.7，加純化水后滅菌過濾后，進行10萬級和3萬級二級超濾，濃縮濾液至密度為1.15g/mL,即得刺五加提取物。其中，提取液中有效成分，黃酮類、皂苷類和多糖類化合物的比例為1:1:0.2，總含量為5mg/mL。其中，洗脫流動相A和流動相B的梯度按照表1進行。實驗例1申請人外購市售的刺五加注射液，同本申請的實施例中的刺五加提取物制備的刺五加注射液進行對比試驗，結果見下表1：表2對比試驗1小白鼠試驗，將小鼠分為4批，每批40只，每10只為一組，分別編號為組1、組2、組3和組4靜脈注射刺五加注射液，每組注射劑量分別為4mL/kg、6mL/kg、8mL/kg和9mL/kg；2人體試驗，同樣分為4批，每批16人，每4人為一組，靜脈注射刺五加注射液，每組注射劑量分別為4mL/kg、6mL/kg、8mL/kg和9mL/kg；記錄統(tǒng)計如下：由以上試驗可知，采用本實施例方法生產的刺五加提取物制備的刺五加注射液相比于市售產品，產生異常反應的小白鼠比較少，產生過敏反應的人也比較少，這說明本申請的工藝能夠顯著減少病人因注射該注射液引起的皮疹、瘙癢、頭暈、頭痛和心悸等癥狀，提高了注射藥物的安全性。實驗例2表3提取效率對比傳統(tǒng)工藝實施例1實施例2實施例3實施例4提取效率32％56％75％70％66％本申請采用的工藝方法相比于傳統(tǒng)工藝，其提取效率有了顯著的增加，效率提高一倍有余；采用本工藝能夠減少降低原料的用量，節(jié)省成本，在低溫下進行操作也減少降低了有效成分的損失。實驗例3表4刺五加提取物中K+含量對比注：以上K+含量采用原子吸收法檢測。在國家標準中，制劑類K+含量控制在1000μg/mL以下，在傳統(tǒng)工藝中，雖然能夠控制K+含量在1000μg/mL以下，但是距離上限很接近，一旦在操作中出現(xiàn)失誤或工藝不穩(wěn)定出現(xiàn)波動的話，很容易超出國家標準限定的最高含量，即便有后期的質量檢測，但是也無形中增加了流向市場的風險和工廠的生產成本(不合格產品回收銷毀等)，而使用本方法可見其K+含量都在600μg/mL以下，相比于傳統(tǒng)工藝，K+含量降低1/3，其有效防止因K+含量過高引起的心臟擴張和無力，導致病人身體不舒服，甚至死亡的風險，安全性能更高。對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業(yè)技術人員能夠實現(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。當前第1頁1 2 3