本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及抗乙型肝炎病毒領(lǐng)域，更具體涉及一種新型的抗乙型肝炎病毒的新型遞送系統(tǒng)和生物制劑。

背景技術(shù)：

全球乙肝病毒感染者約有3.5億人，其中約1億人在中國(guó)。這些人由于乙肝病毒潛伏無(wú)法得到根治。乙肝病毒潛伏的主要原因是其基因組以一種共價(jià)閉環(huán)DNA(covalently closed circular DNA或cccDNA)的形式在病人的肝細(xì)胞核內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。現(xiàn)有的抗乙肝藥物主要是干擾素和核苷(酸)類似物，但這兩類藥物均無(wú)法清除cccDNA，因而無(wú)法根治乙肝。

新興的基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)由于其高效特異的DNA剪切和編輯能力而得到了在科研領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。CRISPR-Cas9是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種DNA剪切系統(tǒng)，通過DNA內(nèi)切酶Cas9在一段小RNA(guide RNA)的幫助下識(shí)別特定的DNA序列并在特定的位點(diǎn)進(jìn)行剪切。由于需要同時(shí)表達(dá)一個(gè)大的蛋白Cas9和一個(gè)小的guide RNA，如何在人體進(jìn)行安全有效的輸送有特異療效的CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一個(gè)亟待解決的問題，并已經(jīng)成為CRISPR-Cas9在臨床應(yīng)用的瓶頸。

已有的CRISPR-Cas9體內(nèi)輸送是通過運(yùn)用腺病毒表達(dá)體系來(lái)表達(dá)Cas9和guide RNA，但是腺病毒的安全性仍有問題。而且，腺病毒在細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)Cas9這種DNA酶，也有可能帶來(lái)長(zhǎng)期的毒副作用?；谛滦偷闹|(zhì)納米顆粒(LNP)的核酸輸送系統(tǒng)已經(jīng)在活體內(nèi)輸送小RNA比如siRNA和長(zhǎng)鏈RNA比如mRNA上表現(xiàn)出良好的效果。

因此，對(duì)于安全有效的輸送有特異性療效的CRISPR-Cas9系統(tǒng)仍存在需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高效的LNP遞送系統(tǒng)，通過將LNP與Cas9mRNA和一段單鏈guide RNA(sgRNA)通過微流裝置進(jìn)行混合而得到，其能夠有效的被輸送到小鼠肝臟并對(duì)乙肝病毒cccDNA進(jìn)行剪切，達(dá)到抑制乙肝病毒的目的。該試劑提供了一種在人體安全根治乙肝病毒的可能性。

本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及靶向HBV基因保守區(qū)域的sgRNA分子，其具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10所示的核酸序列之一：GAGGTGAAGCGAAGTGCACA(SEQ ID NO:1)；CCACCCAAGGCACAGCTTGG(SEQ ID NO:2)；CGGGGAGTCCGCGTAAAGAG(SEQ ID NO:3)；AAGCCACCCAAGGCACAGCT(SEQ ID NO:4)；GAAGCGAAGTGCACACGGTC(SEQ ID NO:5)；AGAAGATGAGGCATAGCAGC(SEQ ID NO:6)；CAAGCCTCCAAGCTGTGCCT(SEQ ID NO:7)；GGGGCGCACCTCTCTTTACG(SEQ ID NO:8)；GGACTTCTCTCAATTTTCTA(SEQ ID NO:9)；或TCCTCTGCCGATCCATACTG(SEQ ID NO:10)。

本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用于將基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的RNA分子運(yùn)輸?shù)礁闻K的脂質(zhì)納米顆粒。該脂質(zhì)納米顆粒由脂多肽分子、二油?；字Ｒ掖及贰⒛懝檀己途垡叶紭?gòu)成。該脂質(zhì)納米顆粒包裹Cas9mRNA和如上述第一個(gè)方面所述的sgRNA分子。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，該脂多肽分子為脂多肽的多聚體。在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式中，脂多肽為1,3,5-三(N¹,N³,N⁵-(3-雙十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3)，聚乙二醇為PEG2000。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，脂多肽分子、二油?；字Ｒ掖及?、膽固醇和聚乙二醇的摩爾比為15:25:45:0.75或15:30:40:0.75。Cas9mRNA和/或sgRNA與脂多肽分子的質(zhì)量比范圍為(1:10)-(1:5)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，Cas9mRNA和/或sgRNA與脂多肽分子的質(zhì)量比范圍為1:10。

本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及一種生物制劑，其包含本發(fā)明第二個(gè)方面所述脂質(zhì)納米顆粒、Cas9mRNA和/或本發(fā)明第一個(gè)方面所述的sgRNA分子，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑和輔料。

本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及脂質(zhì)納米顆粒的制備方法，該方法包括：

(i)將脂多肽分子、膽固醇和聚乙二醇溶于酒精中，得到第一溶液；并將Cas9mRNA和/或sgRNA分子溶于水，得到第二溶液；

(ii)在微流裝置中混合所述第一溶液和所述第二溶液，形成所述脂質(zhì)納米顆粒。

所述制備方法中的脂多肽為1,3,5-三(N¹,N³,N⁵-(3-雙十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3)；所述聚乙二醇為PEG2000；并且該sgRNA分子為本發(fā)明第一個(gè)方面所述的sgRNA分子。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)納米顆粒的半徑為80-160nm，優(yōu)選80-120nm。

本發(fā)明的包裹有CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脂質(zhì)納米顆粒和包含該脂質(zhì)納米顆粒的生物制劑能夠安全有效地輸送有特異性療效的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，同時(shí)避免腺病毒遞送系統(tǒng)帶來(lái)的安全性問題和毒副作用。

附圖說明

圖1：根據(jù)本發(fā)明的方法通過微流裝置合成包含Cas9mRNA和sgRNA的脂質(zhì)納米顆粒的方法的示意圖。

圖2：根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的用于合成脂質(zhì)納米顆粒的微流體芯片的顯微鏡照片，其中示意性示出了在顯微鏡下觀察到的通道。

圖3：根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式通過微流體芯片合成包含Cas9mRNA或sgRNA的脂質(zhì)納米微粒的示意圖。

圖4：靶向HBV ayw亞型基因組的sgRNA設(shè)計(jì)。A.HBV ayw基因組成及sgRNA B1-B9的靶向區(qū)域；B.sgRNA B1-B9靶向序列的保守性分析。

圖5：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基于RNA組份的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HepAD38細(xì)胞系中的抗乙肝病毒作用。A.實(shí)驗(yàn)流程示意圖；B.細(xì)胞培養(yǎng)上清表面抗原水平；C.細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒表面抗原水平，結(jié)果以各組相對(duì)于對(duì)照組水平的百分比表示，對(duì)照組只轉(zhuǎn)染Cas9mRNA，t檢驗(yàn)計(jì)算P值，以*表示顯著性；D.Hirt法提取HepAD38細(xì)胞系cccDNA，T7E1錯(cuò)配酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cas9/sgRNA靶向剪切DNA雙鏈效率，酶切后的目的條帶用黑色三角箭頭標(biāo)識(shí)。

圖6：TT3脂質(zhì)納米微粒合成及體內(nèi)表達(dá)驗(yàn)證。A.TT3脂質(zhì)納米微粒合成方法示意圖；B.動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量TT3-O3和TT3-O14脂質(zhì)納米微粒的粒徑及分布；C.提取小鼠肝細(xì)胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Cas9mRNA水平；D.提取小鼠肝細(xì)胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)sgRNA水平；E.Western檢測(cè)尾靜脈注射后6h小鼠肝臟中的Cas9蛋白表達(dá)水平；F.Western檢測(cè)尾靜脈注射后6h小鼠脾臟中的Cas9蛋白表達(dá)水平。

圖7：TT3-O3脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在HepAD38細(xì)胞系中的抗乙肝病毒作用。A.實(shí)驗(yàn)流程示意圖；B.細(xì)胞培養(yǎng)上清表面抗原水平；C.細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒e抗原水平，t檢驗(yàn)計(jì)算P值，以*表示顯著性；D.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3.5kb前基因組RNA表達(dá)水平；E.Hirt法提取HepAD38細(xì)胞系cccDNA，T7E1錯(cuò)配酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cas9/sgRNA靶向剪切DNA雙鏈效率，酶切后的目的條帶用黑色三角箭頭標(biāo)識(shí)。

圖8：TT3-O3脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。A.小鼠實(shí)驗(yàn)流程示意圖；B.ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒表面抗原水平；C.ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒e抗原水平；D.ELISA檢測(cè)肝臟內(nèi)乙肝病毒表面抗原水平；E.ELISA檢測(cè)肝臟內(nèi)乙肝病毒e抗原水平；F.肝臟內(nèi)乙肝病毒3.5kb前基因組RNA相對(duì)表達(dá)水平；G.肝臟內(nèi)rcccDNA相對(duì)含量；H.B10sgRNA在HBV DNA引起特異的基因突變，而在對(duì)照組中沒有發(fā)現(xiàn)特異性的突變。

圖9：TT3-O3脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。圖9A示出了小鼠實(shí)驗(yàn)流程示意圖；圖9B示出了ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒表面抗原水平；圖9C示出了ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒e抗原水平；圖9D示出了ELISA檢測(cè)肝臟內(nèi)乙肝病毒表面抗原水平；圖9E示出了ELISA檢測(cè)肝臟內(nèi)乙肝病毒e抗原水平；圖9F示出了肝臟內(nèi)乙肝病毒3.5kb前基因組RNA相對(duì)表達(dá)水平；圖9G示出了肝臟內(nèi)rcccDNA相對(duì)含量；圖9H示出了B10sgRNA在HBV DNA引起特異的基因突變，而在對(duì)照組中沒有發(fā)現(xiàn)特異性的突變。

具體實(shí)施方式

除非另有說明，否則本發(fā)明的上下文中所用的術(shù)語(yǔ)具有下面給出的含義。本文沒有具體給出含義的其他術(shù)語(yǔ)具有其在本領(lǐng)域中通常的含義。

1.定義：

TT3：1,3,5-三(N¹,N³,N⁵-(3-雙十二烷氨基丙基)苯甲酰胺

PDMS：聚二甲基硅氧烷

DOPE：二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)

PEG：聚乙二醇

2.材料和方法

本發(fā)明的一種實(shí)施方式涉及新型LNP遞送系統(tǒng)，包含：脂質(zhì)納米顆粒、Cas9mRNA和/或sgRNA，其中脂質(zhì)納米顆粒由脂多肽分子與膽固醇和聚乙二醇構(gòu)成。

圖1中示出了根據(jù)本發(fā)明的方法通過微流裝置合成包含Cas9mRNA和sgRNA的脂質(zhì)納米顆粒的方法的示意圖。將TT3、DOPE、PEG 2000和膽固醇溶于酒精中，并將Cas9mRNA和/或sgRNA溶于水中，然后將兩種溶液一起在微流裝置中被快速混合，形成半徑為80－160nm的顆粒。

2.1.靶向HBVayw亞型的sgRNA序列設(shè)計(jì)

通過CRISPR設(shè)計(jì)工具(http://www.genome-engineering.org/crispr/)及sgRNA的設(shè)計(jì)原則，評(píng)估HBVayw序列上得分較高的靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA。從HBVdb中獲得HBV不同基因型和亞型序列，運(yùn)用CLC Sequence Viewer軟件分析和序列比對(duì)分析靶位點(diǎn)序列在不同基因型和亞型的HBV基因序列中的保守性，選取并合成10條靶向HBV基因保守區(qū)域的sgRNA，分別命名為B1-B10。

表1中示出了靶向HBV基因保守區(qū)域的sgRNA的序列及其在HBV基因組上的區(qū)域和靶向的HBV ORF。

表1：靶向HBV基因保守區(qū)域的sgRNA序列

2.2.sgRNA-B1～B10表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)設(shè)計(jì)的sgRNA序列，在其5’末端加上CACCG得到正向寡核苷酸序列，在其互補(bǔ)鏈的5’末端加上AAAC，3’末端加上C得到反向寡核苷酸序列，分別合成正向和反向寡核苷酸序列。將合成的序列用T4多聚核苷酸激酶于37℃處理30分鐘使其磷酸化，95℃變性5分鐘、以1.5℃/分鐘降溫至25℃退火后，得到具有BsmBI(或BbsI)粘性末端的雙鏈DNA片段，如下：

正向：5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

磷酸化、變性及退火體系為：

1μl 100μM正向寡核苷酸鏈

1μl 100μM反向寡核苷酸鏈

1μl 10×T4Ligation Buffer(NEB)

6.5μl ddH2O

0.5μl T4多聚核苷酸激酶

將雙鏈DNA片段和用BsmbI酶切過的LentiCRISPRv2(Addgene#52961)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，篩選陽(yáng)性菌落，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒進(jìn)行分析及測(cè)序，確定sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為L(zhǎng)entiCRISPRv2-sgRNA(B1-B9)。

將雙鏈DNA片段和用BbsI酶切過的PX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene#42230)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，篩選陽(yáng)性菌落，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒進(jìn)行分析及測(cè)序，確定gRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功,命名為PX330-HBVgRNA(B1-B9)。

2.3.穩(wěn)定表達(dá)Cas9和靶向HBVayw的sgRNA的Huh7細(xì)胞系的構(gòu)建以及sgRNA對(duì)于HBV抗病毒作用的分析檢測(cè)

在六孔板中每孔接種8×10⁵個(gè)293T細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70-80％轉(zhuǎn)染2μg CRISPR表達(dá)質(zhì)粒、0.4μg vsvG、0.2μg Tat、0.2μg Gag/Pol及0.2μg Rev質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后6-8h更換新鮮培養(yǎng)基，48h收取293T培養(yǎng)上清，3000rpm離心10分鐘去除沉淀，病毒上清立即使用或于-80℃貯存。

用293T細(xì)胞包裝出的慢病毒感染Huh7細(xì)胞系，感染48h后用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Cas9和相應(yīng)sgRNA的Huh7細(xì)胞系，命名為Huh7-B1～B9細(xì)胞系。培養(yǎng)條件為DMEM培養(yǎng)基，其中含10％FBS，2μg/ml Puromycin，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)，37℃，5％CO₂。

在轉(zhuǎn)染前一天將Huh7-B1～B9細(xì)胞系分別接種于6孔板中，每孔6×10⁵個(gè)，待細(xì)胞密度達(dá)到70％-80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染2.5μg prcccDNA，2.5μg pCMV-Cre，8-12h更換37℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞提取細(xì)胞中的HBV cccDNA，用T7E1錯(cuò)配酶檢測(cè)經(jīng)過在穩(wěn)定表達(dá)Cas9和靶向HBVayw的sgRNA的Huh7細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染的HBV基因組序列是否產(chǎn)生了突變。

2.4.穩(wěn)定表達(dá)Cas9和靶向HBVayw的sgRNA的HepAD38細(xì)胞系的構(gòu)建以及sgRNA對(duì)于HBV抗病毒作用的分析檢測(cè)

采用上述相同方法在293T細(xì)胞中包裝出慢病毒后感染HepAD38細(xì)胞系，感染48h后用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Cas9和靶向HBV DNA的sgRNA的HepAD38細(xì)胞系，命名為HepAD38-B1～B9細(xì)胞系。培養(yǎng)條件為DMEM培養(yǎng)基，其中含10％FBS，2μg/ml Puromycin，400μg/ml G418，0.3μg/ml Tet，penicillin(100U/ml)和treptomycin(100μg/ml)，37℃，5％CO₂。

將HepAD38-B1～B9細(xì)胞系分別接種于6孔板中，每孔6×10⁵個(gè)，72h后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞中的HBV cccDNA，用T7E1錯(cuò)配酶檢測(cè)經(jīng)過在穩(wěn)定表達(dá)Cas9和靶向HBVayw的sgRNA的HepAD38細(xì)胞系中HBV基因組序列是否產(chǎn)生了突變。

2.5.在HepAD38細(xì)胞系中分析檢測(cè)轉(zhuǎn)染Cas9mRNA和sgRNA對(duì)于HBV的抗病毒作用

將HepAD38細(xì)胞系接種于6孔板中，每孔6×10⁵個(gè)，待細(xì)胞密度達(dá)到70％-80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染9.6ug Cas9mRNA和9ul 20uM sgRNA，8h更換37℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞，用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)的乙肝病毒表面抗原水平，細(xì)胞內(nèi)的乙肝病毒e抗原水平。提取細(xì)胞中的HBV cccDNA，用T7E1錯(cuò)配酶檢測(cè)轉(zhuǎn)染Cas9mRNA和sgRNA后HepAD38細(xì)胞系中HBV基因組序列是否產(chǎn)生了突變。

2.6.Hirt法提取細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA

胰酶消化收取細(xì)胞后3000rpm離心5分鐘，用PBS洗滌一遍，3000rpm離心5分鐘，收取細(xì)胞沉淀。加入500μl裂解液I(1％NP-40,1mM EDTA,50mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH 8.0)，冰上裂解30分鐘，10000g，4℃離心20分鐘收集沉淀，保留裂解上清用于ELISA法檢測(cè)HBV表面抗原和e抗原表達(dá)的變化。向沉淀加入1ml裂解液II(1％SDS,10mM EDTA,150mM NaCl,50mM Tris-HCl,pH 8.0)，4℃旋轉(zhuǎn)60分鐘裂解細(xì)胞核。加入200μl 3M氯化鉀，4℃旋轉(zhuǎn)過夜。14000rpm，4℃離心20分鐘，取上清，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇，劇烈混勻，室溫靜置7分鐘，14000rpm，4℃離心10分鐘，取上清。按收取的上清體積加入2倍體積乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉，于-80℃沉淀2小時(shí)。14000rpm，4℃離心20分鐘，棄上清，加入1ml 75％乙醇洗滌沉淀，14000rpm，4℃離心20分鐘，棄上清。于37℃烘箱晾干以去除殘留乙醇，20μl ddH2O溶解沉淀，Nanodrop測(cè)定DNA濃度。

2.7.T7E1錯(cuò)配酶檢測(cè)

根據(jù)sgRNA B1-B9在HBVayw基因組上的靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增出包含sgRNA靶位點(diǎn)的片段，表2中示出了引物序列。

表2：根據(jù)sgRNA B1-B9在HBVayw基因組上的靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PCR引物

PCR體系如下：

PCR反應(yīng)循環(huán)

使用Axygen公司膠回收試劑盒或天根公司超薄PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收PCR得到目的片段，具體方法按照公司提供的說明書進(jìn)行，Nanodrop測(cè)定DNA濃度。

向回收得到的目的片段中加入NEB Buffer 2，按如下方式退火：

向退火產(chǎn)物中加入1μl T7E1內(nèi)切酶，37℃，30min。加入6X Purple Loading Dye，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

Cas9在識(shí)別的PAM上游3bp的位置切斷目的DNA雙鏈。表3中示出了預(yù)測(cè)的酶切目的片段大小。

表3：sgRNA的預(yù)測(cè)的酶切目的片段大小

2.8.ELISA法測(cè)定HBV表面抗原和e抗原表達(dá)的變化

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解后上清，以合適比例稀釋后按照乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒及乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒(上?？迫A)說明書測(cè)量HBV表面抗原及e抗原，具體步驟如下：

每孔加入待測(cè)樣本(表面抗原75μl，e抗原50μl)，設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照各兩孔，每孔加入與待測(cè)樣品等體積的陰性對(duì)照(或陽(yáng)性對(duì)照)，并設(shè)空白對(duì)照1孔。

表面抗原反應(yīng)板于37℃孵育1小時(shí)(e抗原反應(yīng)板無(wú)需孵育)，每孔加入酶結(jié)合物50μl(空白對(duì)照除外)，手工輕輕震蕩10秒鐘，用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板置37℃孵育30分鐘。

取出反應(yīng)板，撕去封片紙，洗滌反應(yīng)板5次：棄去孔內(nèi)液體，用工作濃度洗滌液注滿各孔，靜置30-60秒，甩干，重復(fù)5次后，在干凈的吸水紙上拍干。

洗滌結(jié)束后立即在各孔內(nèi)加入顯色劑A、顯色劑B各50μl，手工輕輕震蕩10秒鐘。用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板置37℃孵育10-15分鐘。

在各孔內(nèi)加入50μl終止液，震蕩反應(yīng)板5秒鐘，使之充分混勻。用酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長(zhǎng)450nm。

2.9.在小鼠模型中分析檢測(cè)sgRNA-B5、B6對(duì)于HBV復(fù)制的抑制作用

將6ug prcccDNA、4ug pCMV-Cre和20ug PX330/PX330-B5/PX330-B6質(zhì)粒溶于1.7mlPBS中，用2ml醫(yī)用注射器加1ml醫(yī)用注射針頭將溶有質(zhì)粒的PBS在5-7秒鐘內(nèi)通過尾靜脈注射到野生型C57BL/6小鼠體內(nèi)。

注射后的小鼠養(yǎng)3天后腹腔注射200-250μl Avertin麻醉，用毛細(xì)管自眼眶采血50-100ul。養(yǎng)5天后腹腔注射200-250μl Avertin麻醉，摘取眼球取血，處死后剖開取肝臟，液氮速凍后于-80℃保存。采集的小鼠血液均于4℃冰箱放置過夜后，3500rpm，4℃離心15min后分離血清。取少量小鼠血清稀釋后用ELISA檢測(cè)其中的乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原水平。取少量肝臟用裂解液勻漿、冰上裂解后測(cè)定蛋白濃度，將各小鼠肝臟樣品蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化后用ELISA檢測(cè)其中的乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原水平。Hirt法提取小鼠肝臟中的cccDNA，用T7E1錯(cuò)配酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)過sgRNA處理的小鼠肝臟中的HBV基因組序列是否產(chǎn)生了突變。

2.10.包裹Cas9mRNA或sgRNA的脂質(zhì)納米微粒的合成

2.10.1用于合成脂質(zhì)納米微粒的PDMS微流體芯片制備

將聚二甲基硅氧烷(PDMS)預(yù)聚物和固化劑在燒杯中充分混合，放入真空箱內(nèi)除去混合物內(nèi)的氣泡。澆鑄到使用光刻加工的SU-8模具上，放入烘箱內(nèi)加熱固化，從SU-8模具上揭下固化后的PDMS塊。在PDMS塊上結(jié)構(gòu)的入口和出口位置打孔，沿芯片邊界裁切PDMS塊。對(duì)PDMS塊做氧氣等離子體清洗，將PDMS塊對(duì)準(zhǔn)，按壓鍵合。每次在合成脂質(zhì)納米微粒前用氧氣等離子體做親水處理。

2.10.2脂質(zhì)納米微粒合成

下表4中示出了各脂質(zhì)納米微粒的兩種配方(O3配方和O14配方)：

表4：脂質(zhì)納米微粒的組成

合成方法：用無(wú)水乙醇溶解各脂質(zhì)成分得到儲(chǔ)液，按包裹的Cas9mRNA或sgRNA的質(zhì)量以及各脂質(zhì)成分的比例計(jì)算各脂質(zhì)成分所需用量，將配制好的乙醇相的脂質(zhì)成分與水相的RNA組分一起推入微流體芯片裝置使其快速混合，通過靜電相互作用組裝成內(nèi)部包裹有RNA的脂質(zhì)納米微粒。用于小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的脂質(zhì)納米微粒在尾靜脈注射前需用3.5K MWCO的透析卡在PBS緩沖液中透析1小時(shí)，透析完成后于4℃保存。圖3中是示出了根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式通過微流體芯片合成包含Cas9mRNA或sgRNA的脂質(zhì)納米微粒的示意圖。

脂質(zhì)納米微粒的表征：用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量合成的脂質(zhì)納米微粒粒徑和分布，用Quant-iT RiboGreen RNA Kit檢測(cè)脂質(zhì)納米微粒的包裹效率。

2.10.3 Quant-iT RiboGreen試劑盒定量檢測(cè)脂質(zhì)納米微粒的包裹效率

用DEPC水稀釋20×TE溶液配制成1×TE工作液，將合成的脂質(zhì)納米微粒一份用1×TE工作液按1：100的比例稀釋，一份用含有Triton-X100(終濃度為1％)的1×TE工作液按1：100的比例稀釋，室溫放置15分鐘以破壞脂質(zhì)納米微粒從而釋放出包裹的RNA。

在透明的平底96孔板中各加入100μl樣品稀釋液，同時(shí)設(shè)置濃度為0，10，50，90，100ng/ml的RNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋孔。在各孔中加入100μl Reagent A工作液，室溫避光反應(yīng)5分鐘后用熒光酶標(biāo)儀讀數(shù)，激發(fā)光480nm，發(fā)射光520nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品的RNA濃度，脂質(zhì)納米微粒的包裹效率計(jì)算公式為：(1-不加入Triton-X100反應(yīng)孔R(shí)NA濃度/加入Triton-X100反應(yīng)孔R(shí)NA濃度)×100％

2.11.在小鼠模型中分析檢測(cè)脂質(zhì)納米微粒對(duì)于HBV復(fù)制的抑制作用

將prcccDNA和pCMV-Cre通過尾靜脈高壓注射的方法注射到小鼠體內(nèi)，構(gòu)建乙型肝炎病毒的小鼠模型。2天后用毛細(xì)管自眼眶采血50-100μl，分離血清后用ELISA檢測(cè)乙肝病毒表面抗原水平。根據(jù)血清乙肝病毒抗原水平進(jìn)行分組，保證組間平均水平無(wú)顯著差異。分別合成包裹Cas9mRNA和靶向HBV的sgRNA或?qū)φ誷gRNA的脂質(zhì)納米微粒，于尾靜脈高壓注射后第3天和第4天進(jìn)行尾靜脈注射。第5天腹腔注射200ul Avertin麻醉小鼠，摘除眼球取血，處死后剖開腹腔，取出肝臟，液氮速凍保存。分離血清，稀釋后用ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒表面抗原和e抗原水平。取肝臟勻漿后用BCA法測(cè)定蛋白濃度并作標(biāo)準(zhǔn)化，用ELISA試劑盒檢測(cè)肝臟內(nèi)乙肝病毒表面抗原和e抗原水平。Trizol法提取肝臟RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其中的HBV 3.5kb RNA含量。Hirt法提取HBV cccDNA，并用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其中的HBV cccDNA的含量變化。表5中列出了熒光實(shí)時(shí)定量引物。

表5：熒光實(shí)時(shí)定量引物

Cas9mRNA或sgRNA的質(zhì)量以及各脂質(zhì)成分的比例可隨脂質(zhì)成分的性質(zhì)以及用于免疫的動(dòng)物而變化。多種途徑可以用于施用本發(fā)明的包裹有CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脂質(zhì)納米顆粒和包含該脂質(zhì)納米顆粒的生物制劑：包括皮下、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、和脾內(nèi)等等。

3.結(jié)果

3.1.靶向HBV ayw亞型基因組的sgRNA設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

根據(jù)CRISPR設(shè)計(jì)網(wǎng)站獲得靶向HBV ayw亞型基因組上不同ORF的sgRNA，從HBVdb上獲取HBV不同亞型的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，從找到的靶位點(diǎn)中選出位于保守性較高區(qū)域的sgRNA序列，命名為B1-B9。B1-B9在HBV ayw亞型基因組的靶向區(qū)域和保守性分析結(jié)果如圖4A和圖4B所示。圖4示出了靶向HBV ayw亞型基因組的sgRNA設(shè)計(jì)，其中圖4A.HBV ayw基因組成及sgRNA B1-B9的靶向區(qū)域；圖4B為sgRNA B1-B9靶向序列的保守性分析。

3.2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基于RNA組分的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HepAD38細(xì)胞系中的抗乙肝病毒作用及sgRNA效果的體外鑒定

因?yàn)镃RISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯可以通過瞬時(shí)作用完成，因此在驗(yàn)證了LentiCRISPRv2慢病毒載體遞送的靶向HBV ayw的CRISPR系統(tǒng)在細(xì)胞系中對(duì)乙肝的抗病毒作用后，我們?cè)诜€(wěn)定表達(dá)HBV基因組的HepAD38細(xì)胞系中評(píng)估了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Cas9mRNA和體外合成的sgRNA B1-B9的抗病毒作用。圖5示出了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基于RNA組份的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HepAD38細(xì)胞系中的抗乙肝病毒作用，其中圖5A為實(shí)驗(yàn)流程示意圖；圖5B-5C分別為細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒表面抗原水平，結(jié)果以各組相對(duì)于對(duì)照組水平的百分比表示，對(duì)照組只轉(zhuǎn)染Cas9mRNA，t檢驗(yàn)計(jì)算P值，以*表示顯著性，圖5D為Hirt法提取HepAD38細(xì)胞系cccDNA，T7E1錯(cuò)配酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cas9/sgRNA靶向剪切DNA雙鏈效率，酶切后的目的條帶用黑色三角箭頭標(biāo)識(shí)。

圖5A中所示的方法包括如下步驟：在接種的HepAD38細(xì)胞系中用TransIT-mRNA分別轉(zhuǎn)染Cas9mRNA和B1-B9sgRNA，72h后收取細(xì)胞和培養(yǎng)上清。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中和細(xì)胞內(nèi)的乙肝表面抗原水平，結(jié)果表明與只轉(zhuǎn)染Cas9mRNA的對(duì)照組相比，sgRNA B3,B5,B6和B7能夠顯著降低HepAD38系細(xì)胞內(nèi)和分泌的乙肝表面抗原水平(圖5B-5C)。Hirt法提取HepAD38細(xì)胞中的cccDNA，T7E1錯(cuò)配酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明B1,B3,B4,B5,B6,B7,B8均能靶向剪切HBV cccDNA，但相比較于穩(wěn)定表達(dá)Cas9/sgRNA的細(xì)胞系剪切效率較低(圖5D)。

3.3.包裹CRISPR系統(tǒng)RNA組分的TT3脂質(zhì)納米微粒合成及體內(nèi)表達(dá)驗(yàn)證

由于mRNA與siRNA有著不同的特性，尤其在分子量上相距甚遠(yuǎn)，Cas9mRNA大約有4200nt，使其在利用脂質(zhì)納米微粒包裹時(shí)更為困難。我們通過體外篩選和優(yōu)化，得到用于遞送mRNA的新型的TT3脂質(zhì)納米微粒，合成方法示意圖如圖5A所示。經(jīng)過優(yōu)化得到的兩種配方的TT3脂質(zhì)納米微粒：TT3-O3和TT3-O14。以60μg/ml作為Cas9mRNA的起始濃度合成相應(yīng)的TT3-O3和TT3-14脂質(zhì)納米微粒，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量其粒徑和分布，結(jié)果顯示相比較于TT3-14，TT3-O3配方合成的脂質(zhì)納米微粒半徑更小且分布更加集中(圖6B)。圖6A-F中示出了TT3脂質(zhì)納米微粒合成及體內(nèi)表達(dá)驗(yàn)證，其中圖6A為TT3脂質(zhì)納米微粒合成方法示意圖；圖6B示出了動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量TT3-O3配方和TT3-O14配方脂質(zhì)納米微粒的粒徑及分布；圖6C為提取小鼠肝細(xì)胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Cas9mRNA水平；圖6D示出了提取小鼠肝細(xì)胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)sgRNA水平；圖6E示出了Western檢測(cè)尾靜脈注射后6h小鼠肝臟中的Cas9蛋白表達(dá)水平；圖6F示出了Western檢測(cè)尾靜脈注射后6h小鼠脾臟中的Cas9蛋白表達(dá)水平。

以60μg/ml作為RNA的起始濃度合成包裹Cas9mRNA和B6sgRNA的TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒，在C57BL/6小鼠中通過尾靜脈注射包裹Cas9mRNA和B6sgRNA的TT3-O3脂質(zhì)納米微粒(5μg/20g體重)，于不同時(shí)間點(diǎn)收取小鼠肝臟檢測(cè)TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA的表達(dá)。圖6C和圖6D中的RT-qPCR結(jié)果顯示在尾靜脈注射6h后，肝細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)能夠檢測(cè)到Cas9mRNA、sgRNA，12h后Cas9mRNA、sgRNA已經(jīng)下降到較低的水平。尾靜脈注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒6h后，在肝臟中能夠檢測(cè)到Cas9的蛋白表達(dá)(圖6E)而在脾臟中檢測(cè)不到(圖6F)，證明TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的RNA組分主要在肝臟中高表達(dá)。

實(shí)施例

實(shí)施例1:TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在HepAD38細(xì)胞系中的抗乙肝病毒作用

TT3-O3配方無(wú)需外源添加其他物質(zhì)即可在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中遞送包裹的RNA組分。因此我們首先在穩(wěn)定表達(dá)HBV基因組的HepAD38細(xì)胞系中評(píng)估了TT3-O3脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA B6的抗病毒作用。

圖7示出了TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在HepAD38細(xì)胞系中的抗乙肝病毒作用。圖7A示出了實(shí)驗(yàn)流程的示意圖；圖7B-7C分別示出了細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒e抗原水平，t檢驗(yàn)計(jì)算P值，以*表示顯著性；圖7D示出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3.5kb前基因組RNA表達(dá)水平；圖7E示出了Hirt法提取HepAD38細(xì)胞系cccDNA，T7E1錯(cuò)配酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cas9/sgRNA靶向剪切DNA雙鏈效率，酶切后的目的條帶用黑色三角箭頭標(biāo)識(shí)。

圖7A中示出了TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒的制備方法：在接種的HepAD38細(xì)胞系中加入分別包裹有Cas9mRNA和sgRNA-B6的TT3-O3脂質(zhì)納米微粒，sgRNA-sgGFP和sgRNA-B6S2(sgRNA-B6序列隨機(jī)打亂)作為對(duì)照組，48h后收取細(xì)胞和培養(yǎng)上清。Cas9mRNA和sgRNA-B6根據(jù)圖7中所示出的方法分別形成脂質(zhì)納米微粒，其可以序貫遞送或同時(shí)遞送。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中和細(xì)胞內(nèi)的乙肝表面抗原和e抗原水平，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，sgRNA-B6實(shí)驗(yàn)組能夠顯著降低HepAD38系細(xì)胞內(nèi)和分泌的乙肝e抗原水平(圖7B-7C)，細(xì)胞內(nèi)3.5kb前基因組RNA相對(duì)表達(dá)水平也有顯著的下降(圖7D)。Hirt法提取HepAD38細(xì)胞中的cccDNA，T7E1錯(cuò)配酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TT3-O3脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B6能靶向剪切HBV cccDNA，但剪切效率較低(圖7E)，這是由于大部分cccDNA在發(fā)生剪切以后被降解，因而無(wú)法在最終的T7E1錯(cuò)配酶實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到。

在證實(shí)了TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在HepAD38細(xì)胞系中的抗乙肝病毒作用后，我們進(jìn)一步評(píng)估了其在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。

圖8示出了TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。圖8A示出了小鼠實(shí)驗(yàn)流程示意圖；圖8B示出了ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒e抗原水平；圖8C示出了ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒RNA水平；圖8D示出了ELISA檢測(cè)肝臟內(nèi)乙肝病毒DNA水平。

圖8A中示出了TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在小鼠乙肝模型中的實(shí)驗(yàn)流程：通過尾靜脈高壓注射prcccDNA和pCMV-Cre質(zhì)粒在C57BL/6小鼠中構(gòu)建乙肝感染模型，根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分組，根據(jù)Cas9蛋白和sgRNA表達(dá)水平的動(dòng)力學(xué)變化，于24h尾靜脈注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒(200μl/10g體重)，6h后尾靜脈注射包裹sgRNA-B5或?qū)φ战MsgRNA的TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒(100μl/10g體重)。48h后采集小鼠外周血分離血清，收取小鼠肝臟，ELISA檢測(cè)肝臟內(nèi)的乙肝病毒e抗原水平。結(jié)果表明，TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在小鼠乙肝模型中有的抗乙肝病毒作用，且對(duì)于小鼠乙肝模型內(nèi)乙肝病毒e抗原(圖8B)，RNA(圖8C)和cccDNA(圖8D)有顯著的靶向破壞作用。

實(shí)施例2：TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用

以與實(shí)施例1中相似的方法評(píng)估了其在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。

圖9示出了TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。圖9A示出了小鼠實(shí)驗(yàn)流程示意圖；圖9B示出了ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒表面抗原水平；圖9C示出了ELISA檢測(cè)血清乙肝病毒e抗原水平；圖9D示出了ELISA檢測(cè)肝臟內(nèi)乙肝病毒表面抗原水平；圖9E示出了ELISA檢測(cè)肝臟內(nèi)乙肝病毒e抗原水平；圖9F示出了肝臟內(nèi)乙肝病毒3.5kb前基因組RNA相對(duì)表達(dá)水平；圖9G示出了肝臟內(nèi)rcccDNA相對(duì)含量；圖9H示出了B10sgRNA在HBV DNA引起特異的基因突變，而在對(duì)照組中沒有發(fā)現(xiàn)特異性的突變。

圖9A中示出了TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在在小鼠乙肝模型中的實(shí)驗(yàn)流程：通過尾靜脈高壓注射prcccDNA和pCMV-Cre質(zhì)粒在C57BL/6小鼠中構(gòu)建乙肝感染模型，根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分組，根據(jù)Cas9蛋白和sgRNA表達(dá)水平的動(dòng)力學(xué)變化，于24h尾靜脈注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒(200μl/10g體重)，6h后尾靜脈注射包裹sgRNA-B5或sgRNA-B10或?qū)φ战MsgRNA的TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒(100μl/10g體重)。48h后采集小鼠外周血分離血清，收取小鼠肝臟，ELISA檢測(cè)血清和肝臟內(nèi)的乙肝病毒表面抗原和e抗原水平。ELISA結(jié)果顯示相比于sgGFP對(duì)照組，sgRNA:B5和B10實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清乙肝病毒表面抗原和e抗原(圖9B和圖9C)，肝臟內(nèi)表面抗原和e抗原有顯著下降(圖9D-9E)，肝臟內(nèi)3.5kb前基因組RNA相對(duì)表達(dá)水平也有顯著下降(圖8F)。提取肝臟總DNA，經(jīng)Plasmid-Safe DNaseI消化處理后用cccDNA特異引物檢測(cè)其含量變化，結(jié)果顯示相比較于對(duì)照組，sgRNA B10實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟內(nèi)cccDNA含量有顯著下降(圖9G)。通過深度測(cè)序，我們進(jìn)一步確認(rèn)了在B10處理的小鼠的乙肝病毒DNA中確實(shí)有特異性的突變(圖9H)。以上結(jié)果表明，TT3-O3配方脂質(zhì)納米微粒遞送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中有一定的抗乙肝病毒作用，且對(duì)于小鼠乙肝模型內(nèi)HBV cccDNA有顯著的靶向破壞作用。

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上文中提及的所有出版物和專利均通過引用方式并入本文。本發(fā)明的所述方法和系統(tǒng)的各種變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的而不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管已結(jié)合具體優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但應(yīng)理解，本發(fā)明不限于這些具體實(shí)施方式。實(shí)際上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉的可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的所述方式的各種變更都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求限定。