本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種對FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來惡性腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，惡性腫瘤是目前全世界的主要死亡原因之一，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類生命健康的一大類疾病，因此各種新型的抗腫瘤藥物和納米給藥系統(tǒng)應(yīng)運而生。然而，很多抗癌藥物和給藥系統(tǒng)的治療效率總是達不到預(yù)期效果，這主要是由于腫瘤微環(huán)境的生物屏障作用，使得抗癌藥物不能夠高效率的到達腫瘤部位發(fā)揮作用。其中，屏障作用最為明顯的就是包圍在腫瘤細(xì)胞外周的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。
癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAF)在形態(tài)上是一種細(xì)胞核不規(guī)則的大梭形細(xì)胞，與正常成纖維細(xì)胞相比處于持續(xù)活化狀態(tài)，增殖旺盛，常分泌一些生長因子促進腫瘤的生長和遷移，還特異性表達一些蛋白，如成纖維細(xì)胞活化蛋白(Fibroblast activation proteinα，F(xiàn)AP-α)等，并在腫瘤細(xì)胞外周形成一層致密的纖維化明顯的保護屏障，因此癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)有望成為腫瘤微環(huán)境中最有價值的作用靶點之一。
多肽鏈Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln、AC-Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala、Ala-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln和Thr-Gly-Pro-Ala等作為多肽連接臂，是對癌相關(guān)成纖維細(xì)胞特異性表達的蛋白FAP-α特異性敏感的，在接觸到癌相關(guān)成纖維細(xì)胞表面的FAP-α?xí)r能夠特異性的迅速斷裂，顯現(xiàn)出較強的酶敏感活性，有望實現(xiàn)對CAF的靶向作用，為克服CAF這一生物屏障提供了好的條件。
聚酰胺胺(polyamidoamine，PAMAM)作為高度分散劑和穩(wěn)定劑，用于納米粒子的合成，在納米復(fù)合物方面有很好的應(yīng)用價值。PAMAM還具有大量的端基基團，可以進行不同的功能性改性修飾，進而很好的作為藥物、基因、疫苗的載體，用于藥物緩釋、靶向釋藥、體外診斷、體外基因轉(zhuǎn)移以及基因治療等。其作為醫(yī)藥載體與無機載體相比毒副作用小、生物相容性好、安全性更高。PAMAM樹枝狀分子由于其特殊的結(jié)構(gòu)還可用于核磁成像，如PAMAM包藏釓(Gd)可作為一種非常有前景的順磁共振成像(MRI)造影劑。
阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，如乳腺癌、肺癌、軟組織腫瘤、骨肉瘤、膀胱癌等，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。目前已上市的鹽酸阿霉素注射劑在臨床上使用時由于缺乏靶向性產(chǎn)生許多毒性反應(yīng)，如心臟毒性、抑制骨髓造血功能以及胃腸道反應(yīng)等。
到目前為止，臨床上應(yīng)用的給藥系統(tǒng)仍具有缺乏靶向性、毒副作用大、功能單一、難以克服腫瘤微環(huán)境生物屏障等的缺點。因此發(fā)明一種具有靶向性強、毒副作用小、多功能的能夠有效克服生物屏障提高抗癌效率的給藥系統(tǒng)是亟待解決的技術(shù)問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述情況，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種對FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)的制備方法及其應(yīng)用，可有效解決現(xiàn)有抗腫瘤藥物用于腫瘤治療的靶向性差、毒副作用大、功能單一、難以克服生物屏障等問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，阿霉素(DOX)通過二硫鍵作為連接臂與聚酰胺胺(PAMAM)相連形成還原敏感型納米粒(DOX-S-S-PAMAM)，然后將此納米粒通過對FAP-α敏感的多肽連接臂相連形成對FAP-α、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)(即納米制劑DOX-S-S-PAMAM-peptide-DOX-S-S-PAMAM，簡稱DSP-pep-DSP)，所述的二硫鍵為3，3’-二硫代二丙酸或2，2’-二硫代二乙酸，多肽連接臂為蘇氨酸-絲氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺(Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln)或AC-天冬氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸(AC-Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala)或丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺(Ala-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln)或蘇氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸(Thr-Gly-Pro-Ala)等，具體步驟是：
(1)合成還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)：
①稱取作為連接臂的二硫鍵3，3’-二硫代二丙酸或2，2’-二硫代二乙酸10mg-2g，分別加入2.0～15.0ml乙酰氯，置于燒瓶中，在65℃油浴下回流2～6h，將反應(yīng)物進行濃縮后加入3～4倍預(yù)冷的乙醚，冷卻析晶，真空干燥，得3，3’-二硫代二丙酸酐或2，2’-二硫代二乙酸酐；
②稱取0.01～1.0mmolDOX、0.01～1.0mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.01～1.0mmol步驟①中制得的酸酐分別溶解于0.5～15.0ml反應(yīng)溶劑中，將DOX和DMAP溶液混合，加入20～200μl三乙胺(TEA)，向上述溶液中加入酸酐溶液，在25～45℃下避光反應(yīng)8～24h，反應(yīng)停止后加入3～4倍預(yù)冷的乙醚，冷卻析晶，真空干燥，得羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)；
③稱取羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)20～100mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)100～250mg和羥基琥珀酰亞胺(NHS)60～180mg分別溶解于5～25mL反應(yīng)溶劑中，先將DOX-S-S-COOH和EDC溶液混合，反應(yīng)0.5～3h，再加入NHS溶液，反應(yīng)0.5～4h，得活化的羧基化阿霉素(DOX-S-S-COO-NHS)，取聚酰胺胺(PAMAM)10～150mg溶解于3～12mL反應(yīng)溶劑中，加10～200μlTEA，再將DOX-S-S-COO-NHS和PAMAM溶液混合，在20～45℃下氮氣保護反應(yīng)6～26h，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液為超純水，每3～6小時換一次水，冷凍干燥，得還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)；
所述的反應(yīng)溶劑為二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的一種或兩種的混合物，或甲酰胺等類似溶劑以及類似溶劑的混合物；
(2)合成對FAP-α、還原環(huán)境雙敏感的納米粒(DSP-pep-DSP)：
稱取作為連接臂的多肽鏈2～100mg、EDC 20～200mg和NHS 15～180mg分別溶解于2～20mL反應(yīng)溶劑中，然后將多肽連接臂和EDC溶液混合，反應(yīng)0.5～2.5h，再加入NHS溶液，反應(yīng)0.5～3.5h，得活化的多肽連接臂，取負(fù)載了阿霉素的還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)10～200mg溶解于5～25mL反應(yīng)溶劑中，再將活化的多肽連接臂和上述納米粒溶液混合，在20～40℃下氮氣保護8～25h，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量3500～8000的透析袋透析2天，透析液為超純水，每3～6h換一次水，冷凍干燥，得FAP-α、還原環(huán)境雙敏感的納米粒(DSP-pep-DSP)；即對FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)；
所述的多肽連接臂為Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln或AC-Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala或Ala-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln或Thr-Gly-Pro-Ala，反應(yīng)溶劑為二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的一種或兩種的混合物，或甲酰胺等類似溶劑以及類似溶劑的混合物。
本發(fā)明制備的對FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)可有效克服腫瘤微環(huán)境的生物屏障，進而對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮療效，實現(xiàn)在制備新型抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明合成工藝簡單方便，具有良好的生物相容性、高靶向性、還原敏感型、酶敏感性、低毒性和能夠有效克服腫瘤微環(huán)境生物屏障等優(yōu)點，是治療腫瘤中藥物制劑上的創(chuàng)新。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作詳細(xì)說明。
實施例1
本發(fā)明在具體實施中，可由以下步驟實現(xiàn)：
(1)合成還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)：
①稱取作為連接臂的2，2’-二硫代二乙酸109mg和乙酰氯3ml置于燒瓶中，在65℃油浴下回流2h，將反應(yīng)物進行濃縮后加入3倍預(yù)冷的乙醚，冷卻析晶，真空干燥，得2，2’-二硫代二乙酸酐；
②稱取0.3mmolDOX、0.3mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.3mmol2，2’-二硫代二乙酸酐分別溶解于5mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；將DOX和DMAP溶液混合，加入20μl三乙胺(TEA)，向上述溶液中加入2，2’-二硫代二乙酸酐溶液，在35℃下避光反應(yīng)8h，反應(yīng)停止后加入3倍預(yù)冷的乙醚，冷卻析晶，真空干燥，得羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)；
③稱取羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)20mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)100mg和羥基琥珀酰亞胺(NHS)80mg分別溶解于6mL二甲基亞砜(DMSO)中，然后將DOX-S-S-COOH溶液和EDC溶液反應(yīng)0.5h，再加入NHS溶液反應(yīng)1h，得活化的羧基化阿霉素(DOX-S-S-COO-NHS)，取聚酰胺胺(PAMAM)30mg溶解于3mL DMSO中，加20μlTEA，再將DOX-S-S-COO-NHS和PAMAM溶液混合，在25℃下避光反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液為超純水，每4小時換一次水，冷凍干燥，得還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)；
(2)合成對FAP-α、還原環(huán)境雙敏感的納米粒(DSP-pep-DSP)：
稱取作為連接臂的多肽鏈Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln5mg、EDC 30mg和NHS 25mg分別溶解于4mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后將多肽連接臂溶液和EDC溶液反應(yīng)0.5h，再加入NHS溶液反應(yīng)1h，得活化的多肽連接臂，取還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)30mg溶解于7mL DMF中，再將活化的多肽連接臂和上述納米粒溶液混合，在20℃下避光反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液為超純水，每4小時換一次水，冷凍干燥，得FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)(DSP-pep-DSP)。
實施例2
本發(fā)明在具體實施中，也可由以下步驟實現(xiàn)：
(1)合成還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)：
①稱取作為連接臂的3，3’-二硫代二丙酸252mg和乙酰氯6.0ml置于燒瓶中，在65℃油浴下回流4h，將反應(yīng)物進行濃縮后加入3.5倍預(yù)冷的乙醚，冷卻析晶，真空干燥，得3，3’-二硫代二丙酸酐；
②稱取0.6mmolDOX、0.6mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.6mmol3，3’-二硫代二丙酸酐分別溶解于9mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；然后將DOX溶液和DMAP溶液混合，再加入60μl三乙胺(TEA)溶液，最后加入3，3’-二硫代二丙酸酐溶液，在40℃下避光反應(yīng)12h，反應(yīng)停止后加入3.5倍預(yù)冷的乙醚，冷卻析晶，真空干燥，得羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)；
③稱取羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)40mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)180mg和羥基琥珀酰亞胺(NHS)120mg分別溶解于12mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后將DOX-S-S-COOH溶液和EDC溶液反應(yīng)1h，再加入NHS溶液反應(yīng)2h，得活化的羧基化阿霉素(DOX-S-S-COO-NHS)；取聚酰胺胺(PAMAM)60mg溶解于6mL DMF中，加60μlTEA，再將DOX-S-S-COO-NHS和PAMAM溶液混合，在30℃下氮氣保護反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液為超純水，每5小時換一次水，冷凍干燥，得還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)；
(2)合成對FAP-α、還原環(huán)境雙敏感的納米粒(DSP-pep-DSP)：
稱取作為連接臂的多肽鏈AC-Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala20mg、EDC 100mg和NHS 80mg分別溶解于6mL二甲基亞砜(DMSO)中，然后將多肽連接臂溶液和EDC溶液反應(yīng)1h，再加入NHS溶液反應(yīng)2h，得活化的多肽連接臂；取還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)100mg溶解于15mL DMSO中，再將活化的多肽連接臂和上述納米粒溶液混合，在25℃下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液為超純水，每5小時換一次水，冷凍干燥，得FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)(DSP-pep-DSP)。
實施例3
本發(fā)明在具體實施中，還可由以下步驟實現(xiàn)：
(1)合成還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)：
①稱取作為連接臂的3，3’-二硫代二丙酸420mg和乙酰氯9ml置于燒瓶中，在65℃油浴下回流5h，將反應(yīng)物進行濃縮后加入4倍預(yù)冷的乙醚，冷卻析晶，真空干燥，得3，3’-二硫代二丙酸酐；
②稱取0.9mmolDOX、0.9mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.9mmol3，3’-二硫代二丙酸酐分別溶解于14ml二甲基亞砜(DMSO)中；將DOX溶液和DMAP溶液混合，加入80μl三乙胺(TEA)，向上述溶液中加入3，3’-二硫代二丙酸酐溶液，在45℃下避光反應(yīng)24h，反應(yīng)停止后加入4倍預(yù)冷的乙醚，冷卻析晶，真空干燥，得羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)；
③稱取羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)70mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)250mg和羥基琥珀酰亞胺(NHS)180mg分別溶解于18mL二甲基亞砜(DMSO)中，然后將DOX-S-S-COOH溶液和EDC溶液反應(yīng)2h，再加入NHS溶液反應(yīng)1.5h，得活化的羧基化阿霉素(DOX-S-S-COO-NHS)，取聚酰胺胺(PAMAM)80mg溶解于9mL DMSO中，加80μlTEA，再將DOX-S-S-COO-NHS和PAMAM溶液混合，在35℃下避光反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液為超純水，每6小時換一次水，冷凍干燥，得還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)；
(2)合成對FAP-α、還原環(huán)境雙敏感的納米粒(DSP-pep-DSP)：
稱取作為連接臂的多肽鏈Thr-Gly-Pro-Ala30mg、EDC 180mg和NHS 150mg分別溶解于9mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后將多肽連接臂溶液和EDC溶液反應(yīng)1.5h，再加入NHS溶液反應(yīng)3h，得活化的多肽連接臂，取還原敏感型的納米粒(DOX-S-S-PAMAM)160mg溶解于20mL DMF中，再將活化的多肽連接臂和上述納米粒溶液混合，在30℃下避光反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量7000的透析袋透析2天，透析液為超純水，每6小時換一次水，冷凍干燥，得FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)(DSP-pep-DSP)。
由上述可知，本發(fā)明選用3，3’-二硫代二丙酸(或2，2’-二硫代二乙酸等類似物)為連接臂，連接含有氨基的阿霉素(DOX)和聚酰胺胺(PAMAM)，形成還原敏感型納米粒(DOX-S-S-PAMAM)，粒徑在25～40nm之間。再用對癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)表面的FAP-α敏感的多肽連接臂將這些小粒徑的還原敏感型納米粒交聯(lián)起來，形成了粒徑在100～200nm之間的納米粒(DSP-pep-DSP)。多肽連接臂具有對CAF表面的FAP-α敏感的酶敏感性，在遇到腫瘤細(xì)胞外周的CAF時能夠特異性斷裂，使大粒徑的納米粒DSP-pep-DSP裂解為很多負(fù)載藥物的小粒徑的還原敏感型納米粒DOX-S-S-PAMAM，進而能夠破壞或穿過生物屏障，進入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用，有效的克服了生物屏障、提高了抗癌效率；DOX-S-S-PAMAM進入腫瘤內(nèi)部后，二硫鍵為還原響應(yīng)型化學(xué)鍵，通過腫瘤細(xì)胞中高表達的谷胱甘肽的作用，迅速斷裂，使得抗腫瘤藥物阿霉素高效釋放。本發(fā)明是一種兼具還原敏感型、酶敏感性、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞靶向優(yōu)點的能夠有效克服腫瘤微環(huán)境生物屏障，提高抗癌效率的新型藥物體系。并經(jīng)試驗取得了非常滿意的有益技術(shù)效果，有關(guān)試驗資料如下：
1、對FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)(對FAP-α酶、還原環(huán)境雙敏感的粒徑收縮型的腫瘤滲透性納米系統(tǒng)又稱為DSP-pep-DSP納米制劑)中DOX的含量測定：
采用紫外分析法測定DOX的含量，以公式(1)計算樣品的載藥量，載藥量達到32.5％以上。
(1)
2、DSP-pep-DSP納米制劑的粒徑和電位表征：
取適量制劑用水稀釋至適宜濃度后，用Nano-ZS90型激光納米粒度分析儀測得其粒徑和電位分別為156.2nm和-21.3±0.30mv。
3、DSP-pep-DSP納米制劑對細(xì)胞的增殖抑制試驗：
細(xì)胞培養(yǎng)方法：試驗采用2種細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，是將癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)和MCF-7細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng)(以下簡稱CAF-MCF7)并用做以下細(xì)胞實驗。
按照細(xì)胞傳代的步驟將CAF-MCF7細(xì)胞處理到單細(xì)胞懸液，計數(shù)后每孔接種5×103個細(xì)胞于96孔板上，培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃，5％CO2)24h，待細(xì)胞貼壁完全后棄去原培養(yǎng)基后加藥，DSP-pep-DSP組，DOX-S-S-PAMAM組，以及DOX組，所加藥物濃度以阿霉素(DOX)濃度呈一系列梯度用不含血清的培養(yǎng)基配制而成，DOX的濃度梯度依次為0,0.039,0.078,0.156,0.313,0.625,1.25,2.5,5,10μg/ml，并于加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出培養(yǎng)板，每孔加入50μl預(yù)冷的50％三氯乙酸，終濃度為10％，靜置5min；移至4℃冰箱中靜置1h，取出，用超純水洗5遍，室溫空氣中干燥完全后，每孔中加入1％乙酸配制的SRB50μl，室溫下染色20min，倒掉染液，用1％乙酸洗5遍，除去孔中未結(jié)合的染料，室溫空氣干燥后用pH10.5的10mmol/lTris堿液150μl溶解，在空氣加熱搖床中震蕩10min，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔在515nm處的光吸收度值。計算抑制率(％)＝(1-實驗組A/對照組A)×100％，由此得出上述樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50)依次為：0.5158,1.0016,1.5108μg/ml。
4、DSP-pep-DSP納米制劑對細(xì)胞流式攝取試驗：
細(xì)胞培養(yǎng)方法：試驗采用2種細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，是將癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)和MCF-7細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng)(以下簡稱CAF-MCF7)并用做以下細(xì)胞實驗。
將實驗分為DSP-pep-DSP組，DOX-S-S-PAMAM組，DOX組，另設(shè)有空白細(xì)胞組。取對數(shù)生長期的CAF-MCF7細(xì)胞按照細(xì)胞傳代的步驟處理成單細(xì)胞懸液，計數(shù)之后鋪上六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為3×105個/孔，培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)中培養(yǎng)24h，貼壁完全后，棄去培養(yǎng)基，加入用不含血清的培養(yǎng)基配制的藥物，分別設(shè)置0.5h，1h，2h，4h，6h的時間段進行后期處理，藥液吸入對應(yīng)EP管中，用PBS洗2遍，然后用0.5ml的不含EDTA的胰酶消化處理1min，加入培養(yǎng)基1ml，吸入對應(yīng)的EP管，1000rpm/10min離心后，棄去上清，在沉淀中加入2mlPBS吹打均勻，1000rpm/10min離心后，棄去上清，在沉淀中，加入0.5mlPBS吹打均勻后轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中置于冰盒，等待流式上機檢測，測得時間點6h的流式攝取量依次為：90.1％,73.8％,57.6％。
5、DSP-pep-DSP納米制劑的藥效學(xué)試驗：
準(zhǔn)備10只雌性小鼠進行S-180肉瘤腹水培養(yǎng)，兩周后抽取腹水，用于小鼠實體瘤的種植，當(dāng)腫瘤的體積達到100mm3以上時，腫瘤模型接種成功，將荷瘤小鼠隨機分為四組，每組八只，分組情況如下：(1)空白組；(2)DOX組；(3)DOX-S-S-PAMAM組；(4)DSP-pep-DSP組。然后進行隔日給藥，給藥劑量按人鼠劑量換算為4mg/kg，尾靜脈注射給藥。每天觀察小鼠的生存狀況并且稱體重量瘤體積(腫瘤體積V＝A×B2/2)，然后通過相對瘤體積R＝V/V0的變化(V0為給藥前一天瘤體積的大小)評價藥物抗腫瘤活性。記錄的數(shù)據(jù)表明，給藥結(jié)束時和給藥前相比，各組瘤體積抑制率依次為0.03％、46.58％、67.86％、85.38％，具有顯著抑制腫瘤體積之效果，可用于制備抗腫瘤藥物。
實驗表明，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下突出的有益效果：
1、本發(fā)明基于腫瘤微環(huán)境中生物屏障作用較強的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞CAF，選擇了對其表面特異性表達的FAP-α敏感的多肽鏈作為連接臂，將小粒徑的還原性納米粒DOX-S-S-PAMAM交聯(lián)起來形成納米制劑DSP-pep-DSP。納米制劑在遇到CAF上的FAP-α?xí)r能夠特異性斷裂，使大粒徑納米粒裂解為負(fù)載藥物的小粒徑還原敏感型納米粒，進而能夠破壞或穿過生物屏障，進入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮還原敏感作用釋放藥物，提高了抗癌效率；
2、本發(fā)明基于高濃度的生物還原性谷胱甘肽提供了腫瘤組織還原性微環(huán)境，選擇含有二硫鍵的連接臂連接抗腫瘤藥阿霉素和聚酰胺胺，利用此觸發(fā)機制可以實現(xiàn)抗腫瘤藥物在生物體內(nèi)快速、靶向釋放藥物，減少了抗腫瘤藥物的毒副作用；
3、聚酰胺胺PAMAM作為自身可成納米粒的樹枝狀分子，是一種生物相容性很好的藥物載體，與傳統(tǒng)無機載體相比大大降低了毒副作用，還具有長循環(huán)、腫瘤靶向性好、載藥形式多樣等優(yōu)點，十分有利于腫瘤的治療，有效率可提高到80％以上，是治療腫瘤藥物上的一大創(chuàng)新，經(jīng)濟和社會效益巨大。