本發(fā)明涉及細(xì)胞免疫生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種疫苗耐熱保護(hù)劑，以及利用這種疫苗耐熱保護(hù)劑制備的疫苗疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
病毒等生物活性物質(zhì)及其相關(guān)制品的熱敏感性一直是活疫苗長期保存的瓶頸。我國幅員遼闊，經(jīng)濟(jì)水平差異較大，運(yùn)輸、使用過程中疫苗短期暴露高溫環(huán)境(甚至45℃以上)的現(xiàn)象依然存在，所以對(duì)活疫苗的耐熱性能提出了更高的要求。
耐熱凍干保護(hù)劑考慮了活疫苗在較高溫度和較長保存時(shí)間的情況下，凍干物質(zhì)可能產(chǎn)生的物理和化學(xué)變化對(duì)活疫苗存活的影響。但是，現(xiàn)有耐熱凍干保護(hù)劑僅能使活疫苗在2～8℃條件下保存24個(gè)月，37℃條件下保存30天。
活疫苗的冷凍干燥工藝對(duì)其保存期也有很大的影響。常規(guī)冷凍干燥工藝中，活疫苗首先被超低溫凍結(jié)(-40℃以下)，形成的冰結(jié)晶對(duì)病毒的囊膜或者細(xì)胞壁造成不同程度的傷害，進(jìn)而影響干燥產(chǎn)品水合后的活性。因此，常規(guī)冷凍干燥工藝中，制品的耐熱性能還是有限的，室溫甚至更高溫度的穩(wěn)定性是不高的。
豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種急性胃腸道傳染病，臨床上以發(fā)熱、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水和兩周齡以下子豬高死亡率為特征。豬流行性腹瀉是豬流行性腹瀉病毒引起的一種高度接觸性腸道傳染疾病，臨床上以嘔吐、腹瀉、食欲下降為主要特征。這兩種病毒是引起仔豬腹瀉和死亡的主要病因之一，在豬場(chǎng)流行十分普遍，常呈混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
在食品、藥品以及生物體的冷凍干燥和貯藏過程中，很多因素，例如化學(xué)成分、凍結(jié)速率、凍結(jié)和脫水應(yīng)力、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、干燥固體中剩余水分、貯藏環(huán)境的溫度和濕度等都會(huì)影響其中活性組分的穩(wěn)定性甚至?xí)?dǎo)致失活。為了防止生物制品活性組分的變性，需要添加合適冷凍干燥保護(hù)劑和添加劑，配制成混合液后，才能進(jìn)行有效的冷凍干燥和貯藏。
另外，近年來隨著我國畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，養(yǎng)殖密度加大，疫病種類增多且暴發(fā)頻繁，與之相適應(yīng)的動(dòng)物防疫模式也發(fā)生了根本性的變化。防疫質(zhì)量成為制約這一變化的瓶頸之一，疫苗質(zhì)量更是其中的關(guān)鍵問題。眾所周知，疫苗特別是活疫苗對(duì)于冷鏈運(yùn)輸以及儲(chǔ)存溫度要求非常高，而這一環(huán)節(jié)控制不好將直接影響疫苗質(zhì)量，因此，對(duì)于耐熱保護(hù)劑的開發(fā)顯得尤為重要。
TGEV豬傳染性胃腸炎疫苗和PEDV流行性腹瀉病毒不耐熱，60℃30分鐘可使病毒喪失感染力，因此在開發(fā)一種適宜TGEV和PEDV的耐熱保護(hù)劑非常重要。而實(shí)際生產(chǎn)中，耐熱保護(hù)劑的開發(fā)難度很大，而且保護(hù)效果不明顯。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是提供一種疫苗耐熱保護(hù)劑。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一種疫苗耐熱保護(hù)劑，包括以下按重量配比的組分：
明膠6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
本發(fā)明的優(yōu)選方案之一，疫苗耐熱保護(hù)劑包括以下按重量配比的組分：
明膠10％；海藻糖5％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白3％；酶解酪蛋白15％；
硫脲2％；甘氨酸1％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇0.5％。
本發(fā)明的優(yōu)選方案之一，疫苗耐熱保護(hù)劑的溶劑為注射用水。
本發(fā)明的優(yōu)選方案之一，疫苗耐熱保護(hù)劑包括保護(hù)劑A液和保護(hù)劑B液；保護(hù)劑A液包括海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇；保護(hù)劑B液包括明膠、蔗糖和胰蛋白胨。
本發(fā)明的一個(gè)具體方案中還公開了一種用于豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗的疫苗耐熱保護(hù)劑，包括以下按重量配比的組分：
明膠6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
基于本發(fā)明的疫苗耐熱保護(hù)劑，本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開并要求保護(hù)利用該疫苗耐熱保護(hù)劑的疫苗。本發(fā)明要求保護(hù)的疫苗可以是疫苗制品，也可以是準(zhǔn)備進(jìn)行凍干的疫苗原液，即包括抗原和疫苗耐熱保護(hù)劑的試劑。
本發(fā)明的一種疫苗，在疫苗配制過程中加入了疫苗耐熱保護(hù)劑，疫苗耐熱保護(hù)劑包括以下按重量配比的組分：
明膠6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
本發(fā)明的一個(gè)具體方案中公開了一種用于豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉的二聯(lián)疫苗，在疫苗配制過程中加入了疫苗耐熱保護(hù)劑，疫苗耐熱保護(hù)劑包括以下按重量配比的組分：
明膠6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
為了實(shí)施上述發(fā)明內(nèi)容，本發(fā)明公開了一種疫苗耐熱保護(hù)劑的制備方法，包括以下步驟：
1)配料：稱取配方量的明膠、海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇；
2)制備保護(hù)劑A液：將海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇加入適量注射用水中，過濾除菌備用；
3)制備保護(hù)劑B液：將明膠、蔗糖和胰蛋白胨溶解于注射用水中經(jīng)高溫高壓滅菌處理后備用；
4)將保護(hù)劑A液和保護(hù)劑B液按照1:1比例配置成混合液，該混合液即為疫苗耐熱保護(hù)劑。
為了進(jìn)一步實(shí)施上述發(fā)明的內(nèi)容，使用本發(fā)明的疫苗耐熱保護(hù)劑制備生產(chǎn)出疫苗，本發(fā)明的一個(gè)方案中公開了一種疫苗的凍干制備方法，包括以下步驟：
1)將疫苗耐熱保護(hù)劑與抗原混合培苗，得到凍干液；
2)將凍干液使用冷凍干燥機(jī)凍干；
疫苗耐熱保護(hù)劑包括以下按重量配比的組分：
明膠6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)化方案中，凍干制備方法的步驟1)中疫苗耐熱保護(hù)劑與抗原的混合比例為1:4；
凍干工藝包括：
凍干液在7小時(shí)內(nèi)緩慢降到-48℃下保持3～5小時(shí)；逐漸升溫至-25℃后保持30～40小時(shí)；升溫至-20℃保持1～3小時(shí)，升溫至-15℃保持1～3小時(shí)，升溫至-10℃保持1～3小時(shí)，升溫至0℃保持1～3小時(shí)；升溫至5℃保持1～3小時(shí)；升溫至26℃保持7～11小時(shí)。
綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明通過優(yōu)化疫苗耐熱保護(hù)劑的組分，能夠提高疫苗在凍干時(shí)對(duì)溫度的耐受性，減少疫苗效力在凍干過程中的損失。同時(shí)本發(fā)明的耐熱保護(hù)劑，配套本發(fā)明公開的凍干方法，可以有效降低病毒凍干損失，可以提高病毒對(duì)溫度的耐受能力，產(chǎn)品在長時(shí)間保存后依然能維持良好的物理性狀和毒價(jià)。
具體實(shí)施方式
1、疫苗耐熱保護(hù)劑的制備
保護(hù)劑a的組成：
明膠10％；海藻糖3％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白2％；酶解酪蛋白12％；
硫脲2％；甘氨酸0.3％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇1％；余量為注射用水。
保護(hù)劑b的組成：
明膠10％；海藻糖5％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白3％；酶解酪蛋白15％；
硫脲2％；甘氨酸1％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇0.5％；余量為注射用水。
保護(hù)劑c的組成：
明膠10％；海藻糖3％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白2％；酶解酪蛋白12％；
硫脲2％；甘氨酸0.3％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇1％；
葉酸0.5％；乙基香蘭素0.1％；
丹參酚酸B0.2％；余量為注射用水。
保護(hù)劑d的組成：
明膠10％；海藻糖3％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白2％；酶解酪蛋白12％；
硫脲2％；甘氨酸0.3％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇1％；
丹參酚酸B0.2％；余量為注射用水。
2、疫苗耐熱保護(hù)劑制備方法
本發(fā)明的疫苗耐熱保護(hù)劑可以采用現(xiàn)有的方法來制備，也可以使用本發(fā)明中公開的方法制備。本發(fā)明的制備方法為：
1)配料：稱取配方量的明膠、海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇；
2)制備保護(hù)劑A液：將海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇加入適量注射用水中，過濾除菌備用；
3)制備保護(hù)劑B液：將明膠、蔗糖和胰蛋白胨溶解于注射用水中經(jīng)高溫高壓滅菌處理后備用；
4)將保護(hù)劑A液和保護(hù)劑B液按照1:1比例配置成混合液，該混合液即為疫苗耐熱保護(hù)劑。
本發(fā)明的制備方法還可以為：
1)配料：稱取配方量的明膠、海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐、甘露醇、葉酸、丹參酚酸B和乙基香蘭素；
2)制備保護(hù)劑A液：將海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇加入適量注射用水中，使用0.22μm膜過濾除菌備用；
3)制備保護(hù)劑B液：將明膠、蔗糖、胰蛋白胨、葉酸、乙基香蘭素和/或丹參酚酸B溶解于注射用水中經(jīng)116℃高溫高壓滅菌處理20分鐘后備用；
4)將保護(hù)劑A液和保護(hù)劑B液按照1:1比例配置成混合液，該混合液即為疫苗耐熱保護(hù)劑。
3、疫苗制備方法
在配置完成疫苗耐熱保護(hù)劑后，需要將其與疫苗原液進(jìn)行混合，經(jīng)過無菌處理后凍干制備成凍干疫苗。本發(fā)明中疫苗的凍干制備方法，包括以下步驟：
1)將疫苗耐熱保護(hù)劑與抗原按照1:4的體積比混合培苗，得到凍干液；每瓶中含有溶液2.6ml；
2)將凍干液進(jìn)行凍干，所述凍干工藝包括：
凍干液在7小時(shí)內(nèi)緩慢降到-48℃下保持4小時(shí)；逐漸升溫至-25℃后保持30小時(shí)；升溫至-20℃保持2小時(shí)，升溫至-15℃保持2小時(shí)，升溫至-10℃保持2小時(shí)，升溫至0℃保持2小時(shí)；升溫至5℃保持2小時(shí)；升溫至26℃保持9小時(shí)。
4、凍干疫苗的檢驗(yàn)
使用本發(fā)明或者與其相適應(yīng)凍干工藝均可以將本發(fā)明的疫苗耐熱保護(hù)劑與疫苗進(jìn)行凍干處理成凍干粉劑。將本發(fā)明4組的疫苗保護(hù)劑與豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗混合后制備得到的疫苗凍干粉進(jìn)行成品檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下：
4.1性狀：海綿疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
4.2無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無菌生長。
4.3支原體檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無支原體生長。
4.4外源病毒檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無外源病毒污染。
4.5安全檢驗(yàn)用1～3日齡仔豬5頭，各經(jīng)頸部肌肉接種疫苗10頭份，連續(xù)觀察14日。試驗(yàn)豬均無不良反應(yīng)。
4.6鑒別檢驗(yàn)用MEM營養(yǎng)液將1頭份疫苗(1.0ml)作1000倍稀釋，與等量的兩種特異性血清混合液(1:1)混合，置37℃中和1小時(shí)后，分別接種生長良好的ST和Vero細(xì)胞單層，同時(shí)設(shè)病毒和正常細(xì)胞對(duì)照，觀察120小時(shí)。疫苗中和組、正常細(xì)胞組均不產(chǎn)生CPE，病毒對(duì)照組產(chǎn)生CPE。
4.7效力檢驗(yàn)
4.71豬傳染性胃腸炎病毒含量測(cè)定
用MEM營養(yǎng)液將疫苗稀釋至1頭份/ml，并用MEM營養(yǎng)液作1000倍稀釋。取稀釋后的疫苗液加入等量PEDV的特異性血清，置37℃水浴中和1小時(shí)后。用MEM營養(yǎng)液將中和后疫苗液作10倍系列稀釋，取最終稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6的中和后疫苗液，接種于已生長良好的ST細(xì)胞單層的96孔培養(yǎng)板，每個(gè)滴度接種8孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)120小時(shí)，觀察CPE，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。每頭份疫苗中豬傳染性胃腸炎病毒的含量≥105.5TCID50。
4.7.2豬流行性腹瀉病毒含量測(cè)定
用MEM營養(yǎng)液將疫苗稀釋至1頭份/ml，并用MEM營養(yǎng)液作1000倍稀釋。取稀釋后的疫苗液加入等量TGEV的特異性血清，置37℃水浴中和1小時(shí)后。用MEM營養(yǎng)液將中和后疫苗液作10倍系列稀釋，取最終稀釋度為成10-3、10-4、10-5、10-6的中和后疫苗液，接種于已生長良好的Vero細(xì)胞單層的96孔培養(yǎng)板，每個(gè)滴度接種8孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)120小時(shí)，觀察CPE，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。每頭份疫苗中豬流行性腹瀉病毒的含量≥105.3TCID50。
4.8剩余水分測(cè)定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，符合規(guī)定。
4.9真空度測(cè)定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，符合規(guī)定。
經(jīng)過上述檢驗(yàn)可以得知，本發(fā)明的疫苗保護(hù)劑是符合國家要求的。
5、疫苗耐熱性保護(hù)劑的效力分析
5.1實(shí)驗(yàn)疫苗：本發(fā)明保護(hù)劑a作為實(shí)驗(yàn)組；另選現(xiàn)有技術(shù)中一種常用的普通保護(hù)劑作為對(duì)照組。
5.3實(shí)驗(yàn)疫苗：
TGEV豬傳染性胃腸炎和PEDV流行性腹瀉組成的二價(jià)活疫苗。
5.3實(shí)驗(yàn)方法：
將二價(jià)活疫苗與疫苗保護(hù)劑混合后采用下列方法制備出成品：
1)將保護(hù)劑與抗原按照1:4的體積比混合培苗，得到凍干液；每瓶中含有溶液2.6ml；
2)將凍干液進(jìn)行凍干，所述凍干工藝包括：
凍干液在7小時(shí)內(nèi)緩慢降到-48℃下保持4小時(shí)；逐漸升溫至-25℃后保持30小時(shí)；升溫至-20℃保持2小時(shí)，升溫至-15℃保持2小時(shí)，升溫至-10℃保持2小時(shí)，升溫至0℃保持2小時(shí)；升溫至5℃保持2小時(shí)；升溫至26℃保持9小時(shí)。
5.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
本實(shí)施方案的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，(單位：TCID50/頭份)。
表1：普通保護(hù)劑和耐熱保護(hù)劑凍干數(shù)據(jù)比較
用普通保護(hù)劑病毒在凍干過程中損失0.5～1個(gè)滴度；在37℃溫度下存放7天后測(cè)病毒含量，病毒損失相當(dāng)大，在2.5～3.5個(gè)滴度。本發(fā)明的耐熱保護(hù)劑不僅可以減少病毒在凍干過程中的損失(幾乎無損失)，同時(shí)大大提高了病毒的耐老化能力，即在7℃放7天后病毒含量損失在1個(gè)滴度以內(nèi)；具體的數(shù)據(jù)如下表1所示。
本發(fā)明還公開了一種用于豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗的疫苗耐熱保護(hù)劑，包括以下按重量配比的組分：
明膠6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
本發(fā)明還公開了一種用于豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉的二聯(lián)疫苗，疫苗在凍干過程中加入了疫苗耐熱保護(hù)劑，疫苗耐熱保護(hù)劑包括以下按重量配比的組分：
明膠6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了詳細(xì)地描述，但不應(yīng)理解為對(duì)本專利的保護(hù)范圍的限定。在權(quán)利要求書所描述的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改和變形仍屬本專利的保護(hù)范圍。