本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米載體材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤的主要特征是異常細(xì)胞以不受控制的速度生長(zhǎng)，目前腫瘤疾病仍然是世界第二大死亡的原因。當(dāng)前治療腫瘤的方法包括手術(shù)、放療、激素療法和化療等，而化療是其中的主要手段。傳統(tǒng)的化療不能特異性地靶向給藥，這使得正常的健康細(xì)胞也受到藥物的攻擊而損傷，限定了最大容許計(jì)量，甚者，快速地消除以及靶器官組織非特異性分布使得患者常常需要加大藥量而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增大和毒性反應(yīng)增強(qiáng)。因此提供一種毒性小的靶向給藥系統(tǒng)是解決化療缺陷的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決目前缺乏毒性小的靶向給藥系統(tǒng)的技術(shù)問(wèn)題，提供一種納米載體材料，該納米載體材料不僅可降解、細(xì)胞毒性小，而且具有腫瘤細(xì)胞環(huán)境響應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤細(xì)胞靶向給藥，提高抗腫瘤藥物的藥效，減輕患者的痛苦。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種納米載體材料，該納米載體材料為包含以下結(jié)構(gòu)單元的聚合物，

其中n為3191～3572的整數(shù)。該n值的取值范圍是根據(jù)GPC法測(cè)定結(jié)果所得。

所述納米載體材料是由半胱氨酸還原裂解硫辛酸后，硫辛酸自身交聯(lián)形成的聚合物。

所述半胱氨酸與硫辛酸的摩爾比為1:4～6，且所述半胱氨酸與硫辛酸的最佳摩爾比為1:5。

所述納米載體材料的粒徑為85～119nm，Zeta電位為-30～-38mV。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種納米載體材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)硫辛酸溶于甲醇，加入半胱氨酸鹽酸鹽反應(yīng)1～24小時(shí)；

(2)去除多余的甲醇后，分別用稀鹽酸和水洗滌若干次，進(jìn)一步去除雜質(zhì)；

(3)溶于氯仿，加入1％的膽酸鈉溶液超聲乳化得納米粒，分散至蒸餾水中，得納米載體材料。

優(yōu)選的，在步驟(3)之后，還包括下述步驟(4)：

離心除去大顆粒物質(zhì)，再超濾除去膽酸鈉，得純化的納米載體材料。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中，硫辛酸與半胱氨酸的反應(yīng)時(shí)間為8小時(shí)。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種藥物組合物，包含上述納米載體材料和藥物。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述納米載體材料的應(yīng)用，用于制備藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)載體。

本發(fā)明的納米載體材料，是一種采用半胱氨酸還原裂解、硫辛酸自身交聯(lián)成二硫鍵形成的納米級(jí)載體材料，其中的二硫鍵在還原性條件下能夠快速裂解，尤其在谷胱甘肽的作用下，釋放藥物，而腫瘤細(xì)胞中谷胱甘肽的濃度是正常細(xì)胞的7倍，因此由本發(fā)明材料形成的載藥納米粒具有腫瘤細(xì)胞環(huán)境響應(yīng)性，且性質(zhì)穩(wěn)定，可細(xì)胞內(nèi)降解，毒性小，為抗腫瘤藥的廣泛應(yīng)用提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。此外，本發(fā)明納米載體材料的制備方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)試劑及裂解產(chǎn)物毒性非常小，成本低廉，利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制備納米載體材料的反應(yīng)結(jié)構(gòu)式示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1新型空白納米粒的粒徑圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1新型空白納米粒的電位圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1載藥納米粒的粒徑圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例1載藥納米粒的電位圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1空白和載藥納米粒的透射電鏡圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例2納米載體材料的紫外特征吸收峰變化圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例2納米載體材料的GPC分子量測(cè)定圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例3納米粒體外釋藥曲線圖；

圖10是本發(fā)明實(shí)施例4納米粒攝取熒光圖；

圖11是本發(fā)明實(shí)施例4納米粒攝取的流式圖；

圖12是本發(fā)明實(shí)施例5納米粒入胞機(jī)制考察流式細(xì)胞檢測(cè)圖；

圖13是本發(fā)明實(shí)施例6納米載體材料的毒性結(jié)果圖；

圖14是本發(fā)明實(shí)施例6載多西他賽納米粒的藥效結(jié)果圖；

圖15是本發(fā)明實(shí)施例7載藥納米粒藥效的凋亡流式圖；

圖16是本發(fā)明實(shí)施例7載藥納米粒藥效的周期流式圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明研制了一種由半胱氨酸還原裂解硫辛酸后，硫辛酸自身交聯(lián)形成的納米載體材料，半胱氨酸與硫辛酸的摩爾比為1:4～6，最佳摩爾比為1:5，反應(yīng)時(shí)間為1～24小時(shí)，最佳反應(yīng)時(shí)間為8小時(shí)。

本發(fā)明生物可降解的納米載體材料及載藥納米粒的制備方法，具體步驟包括：

(1)材料的制備：硫辛酸溶于甲醇，加入半胱氨酸鹽酸鹽反應(yīng)1～24小時(shí)；

(2)洗滌去雜質(zhì)：去除多余的甲醇后，稀鹽酸洗滌2-3次，水洗滌3次，進(jìn)一步去除雜

質(zhì)；

(3)納米粒的制備：溶于氯仿，1％的膽酸鈉溶液超聲乳化得納米粒，分散到蒸餾水中；

(4)離心除去大顆粒物質(zhì)(3000r,10min)；

(5)純化：超濾除膽酸鈉(100000分子量，1500r,3min)；

(6)載藥：步驟(4)所得溶液凍干后溶于氯仿，加入抗腫瘤藥(或熒光素)、水，超聲乳化所得溶液加入純凈水中攪拌，揮盡氯仿得最終溶液。

下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1 空白納米粒(即納米載體材料)及載藥納米粒的合成

(1)100mg硫辛酸溶于1ml甲醇中，加入170mg的半胱氨酸鹽酸鹽，避光攪拌8小時(shí)，其反應(yīng)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

(2)風(fēng)干或用氮?dú)獯蹈杉状迹←}酸洗滌步驟(1)所得溶液2-3次，去除未反應(yīng)的半胱氨酸鹽酸鹽，再蒸餾水洗滌3次3遍，除去多余的鹽酸后干燥。

(3)將步驟(2)所得材料溶于2ml氯仿，再加入8ml的1％膽酸鈉，超聲30s，間隔10s。重復(fù)超聲2次。

(4)將步驟(3)所得溶液加入到10ml蒸餾水中，攪拌12h，揮發(fā)盡氯仿。

(5)將步驟(4)所得納米粒離心(3000r,10分鐘)除去大的顆粒。

(6)將步驟(5)所得溶液置于10萬(wàn)級(jí)的超濾管中，800r超濾3分鐘，除去多余的膽酸鈉，純化得最終的納米級(jí)載體材料。

(7)載藥：將步驟(5)所得納米粒溶液凍干，取20mg的凍干后材料溶于1ml的氯仿，加入1mg多西他賽(或香豆素6)，加入4ml的水，超聲30s,間隔10s，重復(fù)步驟(4)、(5)、(6)。

(8)粒徑電位測(cè)定：取20ul納米粒溶液加入到1ml的純凈水中，采用粒徑-電位儀(Zeta sizer ZS90電位粒徑分析儀，英國(guó)Malvern公司)。其結(jié)果如圖2-5所示。圖2、3為本發(fā)明新型空白納米粒的粒徑、電位圖，由圖2和3可知，本發(fā)明新型空白納米粒的粒徑為85～119nm，Zeta電位為-30～-38mv。圖4、5為載藥納米粒的粒徑、電位圖，由圖4和5可知，實(shí)施例1載藥納米粒的粒徑為100nm～180nm，Zeta電位為-30～-38mv。

采用透射電鏡觀察納米粒形態(tài)，結(jié)果如圖6所示，納米粒分散較均勻，有少許聚集，納米?；境是蛐位蚪蛐?，說(shuō)明制備的載藥納米粒形態(tài)良好。

實(shí)施例2 硫辛酸納米粒制備處方篩選

硫辛酸甲醇溶液中，分別加入10％、20％、30％、40％、50％的半胱氨酸，反應(yīng)24小時(shí)后測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間的載體材料的330nm處紫外吸收值，納米粒的粒徑，結(jié)果當(dāng)加入20％的半胱氨酸時(shí)，特征紫外吸收值最低，交聯(lián)最完全，且粒徑最低；硫辛酸與20％半胱氨酸反應(yīng)1、2、4、8、12、24小時(shí)，測(cè)定載體材料的330nm處紫外吸收值，納米粒的粒徑，結(jié)果8小時(shí)，特征紫外吸收值最低，交聯(lián)最完全，且粒徑最低，且將制得的納米粒置于4℃保存一個(gè)月，8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)的納米粒未有析出，故篩選出最優(yōu)處方為20％的半胱氨酸，反應(yīng)8小時(shí)。其紫外吸收對(duì)比圖如圖7所示，圖7結(jié)果顯示，反應(yīng)前后硫辛酸五元環(huán)紫外特征吸收峰明顯減少，表明交聯(lián)成功。且將最佳處方所制得載體材料進(jìn)行GPC分子測(cè)定，重復(fù)3次，得交聯(lián)度范圍。其結(jié)果如圖8所示。

實(shí)施例3 體外釋藥特性

采用透析袋法進(jìn)行體外釋藥實(shí)驗(yàn)，將2ml的載多西他賽納米粒溶液置于分子量為8000～14000的透析袋，置于200ml,0.5％吐溫80的PBS溶液中(調(diào)節(jié)PH為5.5或7.4)，以100r的速度進(jìn)行攪拌，分別在2、4、8、12、24、36、48、64、72、96、120h取樣3mL，同時(shí)補(bǔ)液3mL，經(jīng)O.45p.m微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)液相色譜儀檢測(cè)。其釋藥曲線圖如圖9所示，結(jié)果證實(shí)本發(fā)明載藥納米粒溶液具有緩釋作用，且在PH為5.5的釋放率高于PH為7.4時(shí)的釋放率。

實(shí)施例4 攝取的考察

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞按照20萬(wàn)個(gè)/孔鋪12孔板，置于37℃、5％CO2的孵箱中培育24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。將培養(yǎng)基更換為預(yù)熱至37℃的無(wú)血清1640培養(yǎng)基，將制備好的包載香豆素6的納米粒溶液加入各孔中，培養(yǎng)板放入孵箱中3h。采用熒光顯微鏡觀察攝取情況，其結(jié)果為圖10。細(xì)胞攝取熒光物質(zhì)，于熒光顯微鏡下觀看視野明亮，且熒光物質(zhì)分布于細(xì)胞質(zhì) 中，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞攝取載體明顯，且載體分布細(xì)胞質(zhì)中釋放藥物。將細(xì)胞消化，離心后PBS重懸至500ul，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞對(duì)納米復(fù)合物的攝取情況，其結(jié)果為圖11。根據(jù)流式計(jì)數(shù)結(jié)果，硫辛酸納米粒的攝取率明顯高于單純香豆素6，且與PLGA納米粒攝取率相當(dāng)。圖11中，LANP為硫辛酸納米粒，PLGANP為PLGA納米粒。

實(shí)施例5 入胞機(jī)制的考察

利用氯丙嗪、菲律平、阿米洛利3種不同入胞途徑的抑制劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。氯丙嗪(CPZ)阻斷網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，菲律平(Filip)可以通過(guò)選擇性的阻止質(zhì)膜微囊的形成，從而阻斷質(zhì)膜微囊介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，阿米洛利(Amil)可以阻斷大胞飲入胞途徑。細(xì)胞鋪板12孔，將A549細(xì)胞先用氯丙嗪30um/非律平1ug/ml/阿米利洛30um預(yù)處理1小時(shí)，載體加入進(jìn)去孵化2小時(shí)。PBS洗滌，消化，收集細(xì)胞，進(jìn)行流式檢測(cè)。氯丙嗪預(yù)處理后細(xì)胞攝取降幅最大，而阿迷洛利預(yù)處理后細(xì)胞攝取基本不受影響。

結(jié)果(見(jiàn)圖12)：入胞機(jī)制為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，質(zhì)膜微囊介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑共同作用。

實(shí)施例6 細(xì)胞毒性及藥效的考察

1.納米載體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將空白納米載體溶液以不同濃度梯度加入A549細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)24h、48h后，采用CCK8法測(cè)定細(xì)胞毒性。具體步驟如下：

A549細(xì)胞，1萬(wàn)/孔，100ul的培養(yǎng)液，96孔板，孵化24h。細(xì)胞用預(yù)熱至37℃的培養(yǎng)基(無(wú)血清)潤(rùn)洗2次，將新鮮的硫辛酸載體及PLGA載體，配成不同的濃度，加入A549細(xì)胞的96孔板中。3小時(shí)后，換成預(yù)熱好的含有血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)。取出培養(yǎng)板，每孔加入10ul的CCK-8溶液，孵化1.5h,用酶標(biāo)儀振蕩30S，測(cè)定450nm處的吸光度。以未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，未接種細(xì)胞的孔為空白組(空白組：96孔板鋪板，不同濃度的培養(yǎng)液24小時(shí)，加入CCK-8)。計(jì)算各孔的活力：活力＝{A(加納米載體)-A(空白)}/{A(對(duì)照)-A(空白)}*100％，每組重復(fù)3次。結(jié)果顯示，空白載體細(xì)胞毒性很小(見(jiàn)圖13，圖13中LANP為硫辛酸納米粒，PLGANP為PLGA納米粒)。

2.納米載體材料載藥的藥效試驗(yàn)

將載有多西他賽的納米粒以不同濃度梯度加入A549細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)24h、48h后，采用CCK8法測(cè)定細(xì)胞存活率。具體步驟同上述細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

結(jié)果顯示，載多西他賽納米粒釋藥順利，藥效明顯提高(見(jiàn)圖14，圖14中，DTX指多西 他賽，LA-DTX為硫辛酸載多西他賽，PLGA-DTX為PLGA載多西他賽)。

實(shí)施例7 凋亡和周期的考察

將載藥納米粒以不同的濃度梯度加入A549細(xì)胞的12孔板中，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)及周期分析。具體步驟如下：

A549細(xì)胞，20萬(wàn)/孔，12孔板，1ml培養(yǎng)液/孔，孵化24小時(shí)后，每孔給藥1ug/ml，分為四組(control/DTX/PLGA-DTX/LA-DTX)，給藥24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡及周期。凋亡結(jié)果為圖15，由圖15可知，control組早期凋亡及晚期凋亡的總和即凋亡細(xì)胞總比例為6.6％，DTX組為11％，PLGA-DTX組為20％，LA-DTX組為30％，凋亡明顯增加。周期結(jié)果圖為圖16，由圖16可知，相對(duì)于control組，給藥組的G2期細(xì)胞明顯增多，且以LA-DTX組增多最為明顯，說(shuō)明藥物作用于細(xì)胞的G2期，藥效明顯。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。