本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
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引導(dǎo)骨組織再生(Guided Bone Regeneration，GBR)是將屏障膜覆蓋在骨缺損區(qū)的骨組織表面，將軟組織與骨組織隔開(kāi)，防止上皮細(xì)胞以及結(jié)締組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入缺損區(qū)，使骨缺損局部的骨誘導(dǎo)因子含量相對(duì)增加，誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)、填充骨缺損。其中屏障膜是GBR技術(shù)的關(guān)鍵，其結(jié)構(gòu)和性能直接影響骨再生的效果。膜材料是該項(xiàng)技術(shù)的核心，理想的引導(dǎo)再生膜應(yīng)該具備以下特性：①生物相容性，無(wú)生物毒性；②生物可降解性，可完全降解吸收；③生物活性，能夠模擬骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，具有骨誘導(dǎo)性，能夠促進(jìn)骨組織的再生；④有一定的機(jī)械強(qiáng)度，具有空間維持能力并有利于術(shù)者操作。術(shù)后感染是引導(dǎo)骨再生術(shù)后的并發(fā)癥之一，目前，國(guó)內(nèi)有很多關(guān)于骨科抗菌策略探討和報(bào)道。但是這些策略或研究通常只用來(lái)評(píng)估骨科植入物的抗感染能力，沒(méi)有考慮對(duì)骨整合骨再生的影響；或骨科植入材料單只考慮促進(jìn)組織細(xì)胞的粘附、增殖、分化、礦化和提高界面的骨結(jié)合率、骨愈合速度、骨結(jié)合強(qiáng)度等。眾所周知，骨修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要多種因素的結(jié)合來(lái)促進(jìn)骨愈合。臨床中認(rèn)為治療感染確切有效的方法是徹底清除感染病灶，并且局部給予抗菌藥物持續(xù)治療。因此，研究抑菌性GBR膜在治療骨缺損的同時(shí)能夠緩釋抗菌藥物預(yù)防術(shù)后感染已經(jīng)成為一種趨勢(shì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供了一種表面功能化的可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜及其制備方法。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：以細(xì)菌纖維素膜為基底，將納米磷酸鈣負(fù)載于細(xì)菌纖維素膜上，得到納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜，然后再用多巴胺修飾此納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜，得到經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜；制備γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球，然后負(fù)載抗菌藥物，得到功能化凝膠；再將功能化凝膠傾倒于經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜表面，干燥后得到可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜。
具體步驟為：
(1)稱取納米磷酸鈣粉末加入于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％～5.0％分散劑水溶液中，超聲分散15～60min，制得含納米磷酸鈣的分散溶液，所述的納米磷酸鈣粉末和分散劑水溶液的添加比為0.5～2.0g:1L；將細(xì)菌纖維素膜經(jīng)低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜，然后懸掛于含納米磷酸鈣的分散溶液中，100～200r/min磁力攪拌8～30h，靜置12-36h，用蒸餾水進(jìn)行洗滌，得到納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜；
(2)稱取鹽酸多巴胺，將其溶于6.0～12mmol/L的Tris緩沖液中，制得濃度為1.0～2.5mg/mL的多巴胺溶液；氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將步驟(1)中所得的納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜懸浮于多巴胺溶液中，15～36h取出，用6.0～12mmol/L的Tris緩沖液漂洗2～5次后干燥，得到經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜；
(3)向濃度為0.1～0.4mol/Lγ-聚谷氨酸水溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，100～200r/min攪拌5～25min，再加入左旋多巴，冰浴條件下快速攪拌3～10小時(shí)，攪拌過(guò)程中調(diào)節(jié)pH值范圍為3.0～5.0，然后在室溫下攪拌5-12h，反應(yīng)結(jié)束后，除去多余的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和左旋多巴，調(diào)節(jié)pH值范圍為6.5～7.5，真空冷凍干燥，得到γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球，然后用濃度為0.2～1.0mmol/L的抗菌藥物溶液浸泡8～30h，在凝膠化溫度下保持2～8h，得到功能化凝膠；所述的γ-聚谷氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和左旋多巴的摩爾比為2～8:0.2～5:0.2～1.5:0.1～4；所述的γ-聚谷氨酸水溶液和抗菌藥物溶液的體積比為1:1～4.3；
(4)將步驟(3)所述的功能化凝膠傾倒于步驟(2)所述的經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜表面，真空冷凍干燥，得到可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜。
步驟(1)所述的分散劑優(yōu)選為十六烷基三甲基溴化銨、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉或正磷酸鈉。
步驟(1)所述的將細(xì)菌纖維素膜經(jīng)低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜具體為：將細(xì)菌纖維素膜放入反應(yīng)瓶中反應(yīng)器電極的正中間，并在封閉的反應(yīng)器內(nèi)充入氧氣，等離子放電電壓為5～12kV，放電頻率為5～13MHZ，放電間歇為2～5mm，處理1～3min，得到表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜。
步驟(3)所述的凝膠化溫度優(yōu)選為22℃～47℃。
所述的納米磷酸鈣選自納米γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石和納米γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣中的一種或兩種混合物。所述的納米磷酸鈣的粒徑優(yōu)選為150～300nm。
所述的抗菌藥物優(yōu)選為青霉素類、頭孢菌素類、萬(wàn)古霉素、替考拉寧或抗菌肽。
所述的青霉素類優(yōu)選為氨芐西林或哌拉西林，所述的頭孢菌素類優(yōu)選為頭孢唑林、頭孢拉定或頭孢呋辛，所述的抗菌肽優(yōu)選為Mersacidin、Lactofericin-B或PG-1protegrin。
優(yōu)選，所述的納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜上的納米磷酸鈣和細(xì)菌纖維素膜的質(zhì)量比為1:5～50。
本發(fā)明的第二目的是提供一種上述的制備方法制備得到的可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜。
通過(guò)將本發(fā)明中的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜覆蓋在骨缺損區(qū)，使功能化凝膠層面向骨缺損腔，細(xì)菌纖維素膜朝向軟組織面，不但起到屏障作用和預(yù)防骨感染的作用，還有選擇性地引導(dǎo)成骨細(xì)胞向受損傷的部位附著、增殖，達(dá)到組織修復(fù)的目的。
本發(fā)明制備的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜利用不同來(lái)源的可降解材料的優(yōu)缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種以細(xì)菌纖維素膜為基底，并將具成骨誘導(dǎo)作用納米磷酸鈣負(fù)載于其中，得到納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜，然后進(jìn)行多巴胺修飾，得到經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜；制備γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球，并包載抗菌藥物，得到功能化凝膠；最后應(yīng)用多巴胺自聚合作用將細(xì)菌纖維素膜層和功能化凝膠層相結(jié)合，形成具有引導(dǎo)骨組織再生能力的緩釋抗菌復(fù)合膜。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
(1)本發(fā)明制備的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜以細(xì)菌纖維素膜為基底，并摻入具有誘導(dǎo)成骨作用的納米磷酸鈣，具有一定的力學(xué)性能、骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)活性。
(2)制備γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球，吸附包載抗菌藥物，起到緩釋抗菌藥物預(yù)防或治療局部感染的目的。
(3)本發(fā)明制備的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜是利用多巴胺自聚合且能吸附于材料表面的特性對(duì)細(xì)菌纖維素膜進(jìn)行表面修飾，結(jié)合牢固，避免了以往該領(lǐng)域制備同類復(fù)合材料時(shí)僅將不同成分材料簡(jiǎn)單混合所造成的界面結(jié)合不穩(wěn)定的問(wèn)題。
具體實(shí)施方式：
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
以下實(shí)施例中的γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石的來(lái)源是按照授權(quán)專利號(hào)為：ZL201110377514.5，發(fā)明名稱為：一種新型γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石復(fù)合材料及其制備方法，通過(guò)此方法制備獲得的納米磷酸鈣粉末。其具體方法示例如下：按羥基磷灰石化學(xué)式中鈣離子與磷離子的量，即Ca:P＝5:3的摩爾比，選取氯化鈣和磷酸二氫鈉分別配置濃度為1mol/L的鈣離子溶液和濃度為0.6mol/L的磷離子溶液。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0％γ-聚谷氨酸水溶液，按γ-聚谷氨酸水溶液中的羧基與鈣離子的摩爾比為6:1的比例，將γ-聚谷氨酸水溶液加入到鈣離子溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)5小時(shí)。在γ-聚谷氨酸與鈣離子的反應(yīng)液中，逐滴加入與鈣離子溶液等體積的磷離子溶液，邊滴加邊攪拌，控制攪拌轉(zhuǎn)速500r/min，控制反應(yīng)pH值為8.5～10，滴加完畢后，再攪拌24小時(shí)，然后陳化兩天，即于室溫下靜置，使各種分子間相互緩慢作用，相互結(jié)合，得到γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石溶液，將此溶液中加入液氮冷凍后再放入-50℃真空冷凍干燥，即得γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石納米粉末。
以下實(shí)施例中的γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣的具體制備方法：按羥基磷灰石化學(xué)式中鈣離子與磷離子的量，即Ca:P＝3:2的摩爾比，選取氯化鈣和磷酸二氫鈉分別配置濃度為1.5mol/L的鈣離子溶液和濃度為1.0mol/L的磷離子溶液。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％γ-聚谷氨酸水溶液，按γ-聚谷氨酸水溶液中的羧基與鈣離子的摩爾比為6:1的比例，將γ-聚谷氨酸水溶液加入到鈣離子溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)。在γ-聚谷氨酸與鈣離子的反應(yīng)液中，逐滴加入與鈣離子溶液等體積的磷離子溶液，邊滴加邊攪拌，控制攪拌轉(zhuǎn)速500r/min，控制反應(yīng)pH值為8.5～10，滴加完畢后，再攪拌24小時(shí)，然后陳化兩天，即于室溫下靜置，使各種分子間相互緩慢作用，相互結(jié)合，得到γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣溶液，將此溶液中加入液氮冷凍后再放入-50℃真空冷凍干燥，即得γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣納米粉末。
實(shí)施例1：
一種可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)基底仿生層的制備：稱取0.5g的納米γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石粉末加入于1L質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％十六烷基三甲基溴化銨水溶液中，超聲分散15min，制得含納米磷酸鈣的分散溶液；將細(xì)菌纖維素膜先進(jìn)行低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜，然后將表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜懸掛于含納米磷酸鈣的分散溶液中，100r/min磁力攪拌8h，靜置12h，用蒸餾水進(jìn)行洗滌，得到納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜，即為基底仿生層，其中納米磷酸鈣和細(xì)菌纖維素膜的質(zhì)量比為1:5。
(2)中間連接層的制備：稱取鹽酸多巴胺，將其溶于6.0mmol/L的Tris緩沖液中，制得濃度為1.0mg/mL的多巴胺溶液；將步驟(1)中所得納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜懸浮于步驟(2)中所制得的多巴胺溶液中，15h取出用6.0mmol/L的Tris緩沖液漂洗2次后干燥，得到經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜；期間反應(yīng)器皿中充氮?dú)獗Ｗo(hù)聚多巴胺不變色。
(3)功能化凝膠的制備：將2mmolγ-聚谷氨酸加入到20mL蒸餾水中，待完全溶解后添加0.2mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和0.2mmol N-羥基琥珀酰亞胺，100r/min攪拌5min，再加入0.1mmol左旋多巴，并且在冰浴條件下400r/min快速攪拌3小時(shí)，攪拌過(guò)程中調(diào)節(jié)pH值為3.0，然后在室溫下攪拌5h。反應(yīng)結(jié)束后，除去多余的左旋多巴、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，收集純化液并調(diào)節(jié)pH值為6.5，真空冷凍干燥，得到γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球。將γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球轉(zhuǎn)移至模具中，用預(yù)先配置好的20mL濃度為0.2mmol/L的氨芐西林鈉溶液浸泡8h，在22℃下保持2h，即得功能化凝膠。
(4)將步驟(3)中所制得的功能化凝膠傾倒在步驟(2)所得的經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜表面，真空冷凍干燥，得到可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜。
其中將細(xì)菌纖維素膜經(jīng)低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜具體為：將細(xì)菌纖維素膜放入反應(yīng)瓶中反應(yīng)器電極的正中間，并在封閉的反應(yīng)器內(nèi)充入氧氣(流速度為20L/S)，等離子放電電壓為5kV，放電頻率為5MHZ，放電間歇為2mm，處理1min，得到表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜。
本實(shí)施例制備的可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜兼具優(yōu)異的力學(xué)性能和緩釋抗菌活性，沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性和凝血性，沒(méi)有明顯的致敏、刺激和遺傳毒性，促骨細(xì)胞生長(zhǎng)，材料界面結(jié)合穩(wěn)定。
力學(xué)強(qiáng)度：按照GB/T16777-2008《纖維增強(qiáng)復(fù)合材料筋基本力學(xué)性能試驗(yàn)方法》所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行拉伸性能測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例制得的可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度為72+10MPa。
緩釋抗菌性能：采用以下實(shí)驗(yàn)菌株：①表皮葡萄球菌菌株(Staphylococcus epidermidis ATCC 12228)、②金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureu ATCC 25923)、③肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae ATCC 49619)以及④大腸埃希菌(Escherichia coli ATCC 25922)；抑菌實(shí)驗(yàn)按照“JISZ2801-2000《抗菌加工制品-抗菌性試驗(yàn)方法和抗菌效果》、GB/T21510-2008《納米無(wú)機(jī)材料抗菌性能檢測(cè)方法》”等標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。結(jié)果顯示，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜對(duì)①、②、③、④號(hào)菌株的抗菌率分別為93％、95％、92％和90％，抗菌效果持續(xù)均能持續(xù)到3周或以上，對(duì)照組(傳統(tǒng)磷酸鈣骨水泥)的抗菌率均為0％。
生物安全性：按照GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜對(duì)成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性和凝血性，沒(méi)有明顯的致敏、刺激和遺傳毒性，可促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。
實(shí)施例2：
一種可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)基底仿生層的制備：稱取2.0g的γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣粉末加入于1L的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0％焦磷酸鈉水溶液中，超聲分散60min，制得含納米磷酸鈣的分散溶液；將細(xì)菌纖維素膜先進(jìn)行低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜，然后將表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜懸掛于含納米磷酸鈣的分散溶液中，200r/min磁力攪拌30h，靜置36h，用蒸餾水進(jìn)行洗滌，得到納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜，即為基底仿生層，其中納米磷酸鈣和細(xì)菌纖維素膜的質(zhì)量比為1:50。
(2)中間連接層的制備：稱取鹽酸多巴胺，將其溶于12mmol/L的Tris緩沖液中，制得濃度為2.5mg/mL的多巴胺溶液；將步驟(1)中所得納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜懸浮于步驟(2)中所制得的多巴胺溶液中，36h取出用12mmol/L的Tris緩沖液漂洗5次后干燥，得到經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜；期間反應(yīng)器皿中充氮?dú)獗Ｗo(hù)聚多巴胺不變色。
(3)功能化凝膠的制備：將8mmolγ-聚谷氨酸加入到20mL蒸餾水中，待完全溶解后添加5mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和1.5mmol N-羥基琥珀酰亞胺，200r/min攪拌25min，再加入4mmol左旋多巴，并且在冰浴條件下800r/min快速攪拌10小時(shí)，攪拌過(guò)程中調(diào)節(jié)pH值為5.0，然后在室溫下攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束后，除去多余的左旋多巴、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，收集純化液并調(diào)節(jié)pH值為7.5，真空冷凍干燥，得到γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球。將γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球轉(zhuǎn)移至模具中，用預(yù)先配置好的85mL濃度為1.0mmol/L的頭孢唑林鈉溶液浸泡30h，在47℃下保持8h，即得功能化凝膠。
(4)將步驟(3)中所制得的功能化凝膠傾倒在步驟(2)所得的經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜表面，真空冷凍干燥，得到可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜。
其中將細(xì)菌纖維素膜經(jīng)低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜具體為：將細(xì)菌纖維素膜放入反應(yīng)瓶中反應(yīng)器電極的正中間，并在封閉的反應(yīng)器內(nèi)充入氧氣(流速度為70L/S)，等離子放電電壓為12kV，放電頻率為13MHZ，放電間歇為5mm，處理3min，得到表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜。
本實(shí)施例制備的可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜兼具優(yōu)異的力學(xué)性能和緩釋抗菌活性，沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性和凝血性，沒(méi)有明顯的致敏、刺激和遺傳毒性，促骨細(xì)胞生長(zhǎng)，材料界面結(jié)合穩(wěn)定。
力學(xué)強(qiáng)度：按照GB/T16777-2008《纖維增強(qiáng)復(fù)合材料筋基本力學(xué)性能試驗(yàn)方法》所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行拉伸性能測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度為79+5MPa。
緩釋抗菌性能：采用以下實(shí)驗(yàn)菌株：①表皮葡萄球菌菌株(Staphylococcus epidermidis ATCC 12228)、②金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureu ATCC 25923)、③肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae ATCC 49619)以及④大腸埃希菌(Escherichia coli ATCC 25922)；抑菌實(shí)驗(yàn)按照“JISZ2801-2000《抗菌加工制品-抗菌性試驗(yàn)方法和抗菌效果》、GB/T21510-2008《納米無(wú)機(jī)材料抗菌性能檢測(cè)方法》”等標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。結(jié)果顯示，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜對(duì)①、②、③、④號(hào)菌株的抗菌率分別為95％、96％、91％和94.7％，抗菌效果持續(xù)均能持續(xù)到3周或以上，對(duì)照組(傳統(tǒng)磷酸鈣骨水泥)的抗菌率均為0％。
生物安全性：按照GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜對(duì)成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性和凝血性，沒(méi)有明顯的致敏、刺激和遺傳毒性，可促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。
實(shí)施例3：
一種可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)基底仿生層的制備：稱取1.0g的γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石和γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣混合物(γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石和γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣的質(zhì)量比為1:1)加入于1L的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0％正磷酸鈉水溶液中，超聲分散30min，制得含納米磷酸鈣的分散溶液；將細(xì)菌纖維素膜先進(jìn)行低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜，然后將表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜懸掛于含納米磷酸鈣的分散溶液中，150r/min磁力攪拌20h，靜置24h，用蒸餾水進(jìn)行洗滌，得到納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜，即為基底仿生層，其中納米磷酸鈣和細(xì)菌纖維素膜的質(zhì)量比為1:35。
(2)中間連接層的制備：稱取鹽酸多巴胺，將其溶于8.0mmol/L的Tris緩沖液中，制得濃度為2.0mg/mL的多巴胺溶液；將步驟(1)中所得納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜懸浮于步驟(2)中所制得的多巴胺溶液中，24h取出用8.0mmol/L的Tris緩沖液漂洗4次后干燥，得到經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜；期間反應(yīng)器皿中充氮?dú)獗Ｗo(hù)聚多巴胺不變色。
(3)功能化凝膠的制備：將4mmolγ-聚谷氨酸加入到20mL蒸餾水中，待完全溶解后添加4mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和0.4mmol N-羥基琥珀酰亞胺，150r/min攪拌15min，再加入2mmol左旋多巴，并且在冰浴條件下650r/min快速攪拌8小時(shí)，攪拌過(guò)程中調(diào)節(jié)pH值為4.0，然后在室溫下攪拌10h。反應(yīng)結(jié)束后，除去多余的左旋多巴、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，收集純化液并調(diào)節(jié)pH值為7.0，真空冷凍干燥，得到γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球。將γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球轉(zhuǎn)移至模具中，用預(yù)先配置好的50mL濃度為0.8mmol/L的萬(wàn)古霉素溶液浸泡15h，在30℃下保持5h，即得功能化凝膠。
(4)將步驟(3)中所制得的功能化凝膠傾倒在步驟(2)所得的經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜表面，真空冷凍干燥，得到可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜。
其中將細(xì)菌纖維素膜經(jīng)低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜具體為：將細(xì)菌纖維素膜放入反應(yīng)瓶中反應(yīng)器電極的正中間，并在封閉的反應(yīng)器內(nèi)充入氧氣(流速度為40L/S)，等離子放電電壓為8kV，放電頻率為8MHZ，放電間歇為3mm，處理2min，得到表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜。
本實(shí)施例制備的復(fù)合膜兼具優(yōu)異的力學(xué)性能和緩釋抗菌活性，沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性和凝血性，沒(méi)有明顯的致敏、刺激和遺傳毒性，促骨細(xì)胞生長(zhǎng)，材料界面結(jié)合穩(wěn)定。
力學(xué)強(qiáng)度：按照GB/T16777-2008《纖維增強(qiáng)復(fù)合材料筋基本力學(xué)性能試驗(yàn)方法》所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行拉伸性能測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度為78+9MPa。
緩釋抗菌性能：采用以下實(shí)驗(yàn)菌株：①表皮葡萄球菌菌株(Staphylococcus epidermidis ATCC 12228)、②金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureu ATCC 25923)、③肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae ATCC 49619)以及④大腸埃希菌(Escherichia coli ATCC 25922)；抑菌實(shí)驗(yàn)按照“JISZ2801-2000《抗菌加工制品-抗菌性試驗(yàn)方法和抗菌效果》、GB/T21510-2008《納米無(wú)機(jī)材料抗菌性能檢測(cè)方法》”等標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。結(jié)果顯示，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜對(duì)①、②、③、④號(hào)菌株的抗菌率分別為99％、98％、99％和98％，抗菌效果持續(xù)均能持續(xù)到3周或以上，對(duì)照組(傳統(tǒng)磷酸鈣骨水泥)的抗菌率均為0％。
生物安全性：按照GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜對(duì)成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性和凝血性，沒(méi)有明顯的致敏、刺激和遺傳毒性，可促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。
實(shí)施例4：
一種可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)基底仿生層的制備：稱取1.5g的γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石和γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣混合物(γ-聚谷氨酸/羥基磷灰石和γ-聚谷氨酸/β-磷酸三鈣的質(zhì)量比為2:1)加入于1L的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0％六偏磷酸鈉水溶液中，超聲分散50min，制得含納米磷酸鈣的分散溶液；將細(xì)菌纖維素膜先進(jìn)行低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜，然后將表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜懸掛于含納米磷酸鈣的分散溶液中，180r/min磁力攪拌20h，靜置20h，用蒸餾水進(jìn)行洗滌，得到納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜，即為基底仿生層，其中納米磷酸鈣和細(xì)菌纖維素膜的質(zhì)量比為1:45。
(2)中間連接層的制備：稱取鹽酸多巴胺，將其溶于10mmol/L的Tris緩沖液中，制得濃度為1.5mg/mL的多巴胺溶液；將步驟(1)中所得納米磷酸鈣/細(xì)菌纖維素膜懸浮于步驟(2)中所制得的多巴胺溶液中，18h取出用10mmol/L的Tris緩沖液漂洗4次后干燥，得到經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜；期間反應(yīng)器皿中充氮?dú)獗Ｗo(hù)聚多巴胺不變色。
(3)功能化凝膠的制備：將6mmolγ-聚谷氨酸加入到20mL蒸餾水中，待完全溶解后添加1.0mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和1.0mmol N-羥基琥珀酰亞胺，200r/min攪拌24min，再加入2.4mmol左旋多巴，并且在冰浴條件下500r/min快速攪拌6小時(shí)，攪拌過(guò)程中調(diào)節(jié)pH值為4.5，然后在室溫下攪拌8h。反應(yīng)結(jié)束后，除去多余的左旋多巴、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，收集純化液并調(diào)節(jié)pH值為7.2，真空冷凍干燥，得到γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球。將γ-聚谷氨酸/左旋多巴凝膠微球轉(zhuǎn)移至模具中，用預(yù)先配置好的30mL濃度為0.5mmol/L的抗菌肽(PG-1protegrin)溶液浸泡24h，在45℃下保持3h，即得功能化凝膠。
(4)將步驟(3)中所制得的功能化凝膠傾倒在步驟(2)所得的經(jīng)多巴胺修飾的細(xì)菌纖維素膜表面，真空冷凍干燥，得到可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜。
其中將細(xì)菌纖維素膜經(jīng)低溫等離子體處理制得表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜具體為：將細(xì)菌纖維素膜放入反應(yīng)瓶中反應(yīng)器電極的正中間，并在封閉的反應(yīng)器內(nèi)充入氧氣(流速度為60L/S)，等離子放電電壓為10kV，放電頻率為10MHZ，放電間歇為5mm，處理3min，得到表面富含氧極性官能團(tuán)的細(xì)菌纖維素膜。
本實(shí)施例制備的可引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜兼具優(yōu)異的力學(xué)性能和緩釋抗菌活性，沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性和凝血性，沒(méi)有明顯的致敏、刺激和遺傳毒性，促骨細(xì)胞生長(zhǎng)，材料界面結(jié)合穩(wěn)定。
力學(xué)強(qiáng)度：按照GB/T16777-2008《纖維增強(qiáng)復(fù)合材料筋基本力學(xué)性能試驗(yàn)方法》所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行拉伸性能測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度為62+5MPa。
緩釋抗菌性能：采用以下實(shí)驗(yàn)菌株：①表皮葡萄球菌菌株(Staphylococcus epidermidis ATCC 12228)、②金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureu ATCC 25923)、③肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae ATCC 49619)以及④大腸埃希菌(Escherichia coli ATCC 25922)；抑菌實(shí)驗(yàn)按照“JISZ2801-2000《抗菌加工制品-抗菌性試驗(yàn)方法和抗菌效果》、GB/T21510-2008《納米無(wú)機(jī)材料抗菌性能檢測(cè)方法》”等標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。結(jié)果顯示，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜對(duì)①、②、③、④號(hào)菌株的抗菌率分別為84％、87％、83％和90％，抗菌效果持續(xù)均能持續(xù)到3周或以上，對(duì)照組(傳統(tǒng)磷酸鈣骨水泥)的抗菌率均為0％。
生物安全性：按照GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例制得的引導(dǎo)骨組織再生的緩釋抗菌復(fù)合膜對(duì)成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性和凝血性，沒(méi)有明顯的致敏、刺激和遺傳毒性，可促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。